7 resultados para Proteínas celulares Teses
em Universidad del Rosario, Colombia
Resumo:
El acelerado avance de la inmunologa ha generado el desarrollo de tcnicas que permiten resultados ms precisos y de mtodos de separacin, tanto de componentes celulares como humorales, tiles en el diagnstico. La presente edicin tiene como objetivo proveer las herramientas necesarias para entender estos avances, junto con los mecanismos implicados en el desarrollo de algunas tcnicas de diagnstico inmunolgico e interpretacin clnica. Entre los temas tratados se encuentra el estudio de la estructura y fisiologa de Toxoplasma gondii, que sirve de modelo para la elaboracin de pptidos sintticos de proteínas inmunognicas y, adems, puede ser aplicado en el desarrollo de mtodos de diagnstico en otros parsitos de importancia clnica. El presente manual ha sido elaborado con el fin de proporcionar una ayuda en el desarrollo de prcticas de laboratorio en inmunologa y est dirigido, principalmente, a estudiantes universitarios y trabajadores de las diferentes reas de la salud como medicina, bacteriologa, biologa y qumica.
Resumo:
La captacin de glucosa y su conversin en lactato juega un papel fundamental en el metabolismo tumoral, independientemente de la concentracin de oxgeno presente en el tejido (efecto Warburg). Sin embrago, dicha captacin vara de un tipo tumoral a otro, y dentro del mismo tumor, situacin que podra depender de las caractersticas microambientales tumorales (fluctuaciones de oxgeno, presencia de otros tipos celulares) y de factores estresores asociados a los tratamientos. Se estudi el efecto de la hipoxia-reoxigenacin (HR) y las radiaciones ionizantes (RI) sobre la captacin de glucosa, en cultivos de lneas tumorales MCF-7 y HT-29, cultivadas de forma aislada o en cocultivo con la lnea celular EAhy296. Se encontr que la captacin de glucosa en HR es diferente para lo descrito en condiciones de hipoxia permanente y que es modificada en el cocultivo. Se identificaron poblaciones celulares dentro de la misma lnea celular, de alta y baja captacin de glucosa, lo que implicara una simbiosis metablica de la clula como respuesta adaptativa a las condiciones tumorales. Se evalu la expresin de NRF2 y la translocacin nuclear de NRF2 y HIF1a, como vas de respuesta a estrs celular e hipoxia. La translocacin nuclear de las proteínas evaluadas explicara el comportamiento metablico de las clulas tumorales de seno, pero no de colon, por lo cual deben existir otras vas metablicas implicadas. Las diferencias en el comportamiento de las clulas tumorales en HR en relacin con hipoxia permitir realizar planeaciones dosimtricas ms dinmicas, que reevalen las condiciones de oxigenacin tumoral constantemente.
Resumo:
El marcaje de proteínas con ubiquitina, conocido como ubiquitinacin, cumple diferentes funciones que incluyen la regulacin de varios procesos celulares, tales como: la degradacin de proteínas por medio del proteosoma, la reparacin del ADN, la sealizacin mediada por receptores de membrana, y la endocitosis, entre otras (1). Las molculas de ubiquitina pueden ser removidas de sus sustratos gracias a la accin de un gran grupo de proteasas, llamadas enzimas deubiquitinizantes (DUBs) (2). Las DUBs son esenciales para la manutencin de la homeostasis de la ubiquitina y para la regulacin del estado de ubiquitinacin de diferentes sustratos. El gran nmero y la diversidad de DUBs descritas refleja tanto su especificidad como su utilizacin para regular un amplio espectro de sustratos y vas celulares. Aunque muchas DUBs han sido estudiadas a profundidad, actualmente se desconocen los sustratos y las funciones biolgicas de la mayora de ellas. En este trabajo se investigaron las funciones de las DUBs: USP19, USP4 y UCH-L1. Utilizando varias tcnicas de biologa molecular y celular se encontr que: i) USP19 es regulada por las ubiquitin ligasas SIAH1 y SIAH2 ii) USP19 es importante para regular HIF-1, un factor de transcripcin clave en la respuesta celular a hipoxia, iii) USP4 interacta con el proteosoma, iv) La quimera mCherry-UCH-L1 reproduce parcialmente los fenotipos que nuestro grupo ha descrito previamente al usar otros constructos de la misma enzima, y v) UCH-L1 promueve la internalizacin de la bacteria Yersinia pseudotuberculosis.
Resumo:
The main purpose of this study was to obtain primary cell cultures derived from Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae). Necrophagous this fly is used for determination of post-mortem interval and larval therapy. Since explants embryonated eggs were performed in various culture media (Grace Schneider, MM/VP12, DMEM, Grace/L-15 and L-15), supplemented with 20% fetal serum. Sterilization of the biological material was carried out by immersing it in formaldehyde and sodium hypochlorite solutions. The cell growth was initiated in the L-15, MM/VP12, and Schneider Grace/L-15 in an average time of 10 days after completion of planting by the proliferation of groups of colonies scattered on the surface of the boxes crops and also from the endings of larval fragments. The evolution of cell growth to the formation of monolayer semi-confluent was relatively fast, reaching at 3 weeks post-explant. Cellular morphology in cultured cells was heterogeneous, especially epithelioid forms, similar to nerve, giant and irregular. Comparison of the growth characteristics of these cell cultures with those obtained from other species of flies was more favorable in the evolution of those obtained from L. sericata, on the grounds that the cells are better adapted to the physical-chemical conditions of several culture media. This is the first report of a cell culture-fly family Calliphoridae.
Resumo:
Los gliomas malignos representan una de las formas ms agresivas de los tumores del sistema nervioso central (SNC). De acuerdo con la clasificacin de los tumores cerebrales de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS), los astrocitomas han sido categorizados en cuatro grados, determinados por la patologa subyacente. Es as como los gliomas malignos (o de alto grado) incluyen el glioma anaplsico (grado III) as como el glioblastoma multiforme (GBM, grado IV),estos ltimos los ms agresivos con el peor pronstico (1). El manejo teraputico de los tumores del SNC se basa en la ciruga, la radioterapia y la quimioterapia, dependiendo de las caractersticas del tumor, el estadio clnico y la edad (2),(3), sin embargo ninguno de los tratamientos estndar es completamente seguro y compatible con una calidad de vida aceptable (3), (4). En general, la quimioterapia es la primera opcin en los tumores diseminados, como el glioblastoma invasivo y el meduloblastoma de alto riesgo o con metstasis mltiple, pero el pronstico en estos pacientes es muy pobre (2),(3). Solamente nuevas terapias dirigidas (2) como las terapias anti-angiognicas (4); o terapias gnicas muestran un beneficio real en grupos limitados de pacientes con defectos moleculares especficos conocidos (4). De este modo, se hace necesario el desarrollo de nuevas terapias farmacolgicas para atacar los tumores cerebrales. Frente a las terapias los gliomas malignos son con frecuencia quimioresistentes, y esta resistencia parece depender de al menos dos mecanismos: en primer lugar, la pobre penetracin de muchas drogas anticncer a travs de la barrera hematoenceflica (BBB: Blood Brain Barrier), la barrera del fluido sangre-cerebroespinal (BCSFB: Blood-cerebrospinal fluid barrier) y la barrera sangre-tumor (BTB: blood-tumor barrier). Dicha resistencia se debe a la interaccin de la droga con varios transportadores o bombas de eflujo de droga ABC (ABC: ATP-binding cassette) que se sobre expresan en las clulas endoteliales o epiteliales de estas barreras. En segundo lugar, estos transportadores de eflujo de drogas ABC propios de las clulas tumorales confieren un fenotipo conocido como resistencia a multidrogas (MDR: multidrug resistance), el cual es caracterstico de varios tumores slidos. Este fenotipo tambin est presente en los tumores del SNC y su papel en gliomas es objeto de investigacin (5). Por consiguiente el suministro de medicamentos a travs de la BBB es uno de los problemas vitales en los tratamientos de terapia dirigida. Estudios recientes han demostrado que algunas molculas pequeas utilizadas en estas terapias son sustratos de la glicoprotena P (Pgp: P-gycoprotein), as como tambin de otras bombas de eflujo como las proteínas relacionadas con la resistencia a multidrogas (MRPs: multidrug resistance-related proteins (MRPs) o la protena relacionada con cncer de seno (BCRP: breast-cancer resistance related protein)) que no permiten que las drogas de este tipo alcancen el tumor (1). Un sustrato de Pgp y BCRP es la DOXOrubicina (DOXO), un frmaco utilizado en la terapia anti cncer, el cual es muy eficaz para atacar las clulas del tumor cerebral in vitro, pero con un uso clnico limitado por la poca entrega a travs de la barrera hematoenceflica (BBB) y por la resistencia propia de los tumores. Por otra parte las clulas de BBB y las clulas del tumor cerebral tienen tambin proteínas superficiales, como el receptor de la lipoprotena de baja densidad (LDLR), que podra utilizarse como blanco teraputico en BBB y tumores cerebrales. Es asi como la importancia de este estudio se basa en la generacin de estrategias teraputicas que promuevan el paso de las drogas a travs de la barrera hematoencefalica y tumoral, y a su vez, se reconozcan mecanismos celulares que induzcan el incremento en la expresin de los transportadores ABC, de manera que puedan ser utilizados como blancos teraputicos.Este estudio demostr que el uso de una nueva estrategia basada en el Caballo de Troya, donde se combina la droga DOXOrubicina, la cual es introducida dentro de un liposoma, salvaguarda la droga de manera que se evita su reconocimiento por parte de los transportadores ABC tanto de la BBB como de las clulas del tumor. La construccin del liposoma permiti utilizar el receptor LDLR de las clulas asegurando la entrada a travs de la BBB y hacia las clulas tumorales a travs de un proceso de endocitosis. Este mecanismo fue asociado al uso de estatinas o drogas anticolesterol las cuales favorecieron la expresin de LDLR y disminuyeron la actividad de los transportadores ABC por nitracin de los mismos, incrementando la eficiencia de nuestro Caballo de Troya. Por consiguiente demostramos que el uso de una nueva estrategia o formulacin denominada ApolipoDOXO ms el uso de estatinas favorece la administracin de frmacos a travs de la BBB, venciendo la resistencia del tumor y reduciendo los efectos colaterales dosis dependiente de la DOXOrubicina. Adems esta estrategia del "Caballo de Troya", es un nuevo enfoque teraputico que puede ser considerado como una nueva estrategia para aumentar la eficacia de diferentes frmacos en varios tumores cerebrales y garantiza una alta eficiencia incluso en un medio hipxico,caracterstico de las clulas cancerosas, donde la expresin del transportador Pgp se vi aumentada. Teniendo en cuenta la relacin entre algunas vas de sealizacin reconocidas como moduladores de la actividad de Pgp, este estudio presenta no solo la estrategia del Caballo de Troya, sino tambin otra propuesta teraputica relacionada con el uso de Temozolomide ms DOXOrubicina. Esta estrategia demostr que el temozolomide logra penetrar la BBB por que interviene en la via de sealizacin de la Wnt/GSK3/-catenina, la cual modula la expresin del transportador Pgp. Se demostr que el TMZ disminuye la protena y el mRNA de Wnt3 permitiendo plantear la hiptesis de que la droga al disminuir la transcripcin del gen Wnt3 en clulas de BBB, incrementa la activacin de la va fosforilando la -catenina y conduciendo a disminuir la -catenina nuclear y por tanto su unin al promotor del gen mdr1. Con base en los resultados este estudio permiti el reconocimiento de tres mecanismos bsicos relacionados con la expresin de los transportadores ABC y asociados a las estrategias empleadas: el primero fue el uso de las estatinas, el cual condujo a la nitracin de los transportadores disminuyendo su actividad por la via del factor de transcripcin NFB; el segundo a partir del uso del temozolomide, el cual metila el gen de Wnt3 reduciendo la actividad de la via de sealizacin de la la -catenina, disminuyendo la expresin del transportador Pgp. El tercero consisti en la determinacin de la relacin entre el eje RhoA/RhoA quinasa como un modulador de la via (no cannica) GSK3/-catenina. Se demostr que la protena quinasa RhoA promovi la activacin de la protena PTB1, la cual al fosforilar a GSK3 indujo la fosforilacin de la -catenina, lo cual dio lugar a su destruccin por el proteosoma, evitando su unin al promotor del gen mdr1 y por tanto reduciendo su expresin. En conclusin las estrategias propuestas en este trabajo incrementaron la citotoxicidad de las clulas tumorales al aumentar la permeabilidad no solo de la barrera hematoenceflica, sino tambin de la propia barrera tumoral. Igualmente, la estrategia del Caballo de Troya podra ser til para la terapia de otras enfermedades asociadas al sistema nervioso central. Por otra parte estos estudios indican que el reconocimiento de mecanismos asociados a la expresin de los transportadores ABC podra constituir una herramienta clave en el desarrollo de nuevas terapias anticncer.
Resumo:
SPECT-1 y -2 y SIAP-1 y -2 son proteínas pertenecientes al esporozoto de Plasmodium falciparum causante de la malaria ms agresiva en los humanos. Estas proteínas estn involucradas en el paso del parsito a travs de las clulas del hospedero humano y en la invasin del hepatocito, hacindolas blancos atractivos para ser estudiadas. Pptidos conservados de alta capacidad de unin (cHABPs) a clulas HeLa y HepG2 derivados de estas molculas son no inmunognicos porque son incapaces de generar una respuesta inmunitaria, pero son claves para el parsito porque cumplen una funcin importante durante la infeccin del hospedero humano. En este trabajo se encontr que algunos cHABPs pertenecientes a las proteínas SPECT-1 y -2, estn posiblemente involucrados con la unin y formacin de poros sobre la membrana de las clulas hospederas, ayudando al esporozoto a abrirse paso travs de las clulas del hospedero. Por otro lado, con el fin de cambiar el comportamiento inmunolgico de cHABPs derivados de SPECT-1 y -2 y SIAP-1 y -2, se obtuvieron nuevos pptidos mediante el reemplazo de aminocidos crticos por otros residuos cuya masa molecular sea similar, pero diferente en su polaridad. En este trabajo se reporta que dichas modificaciones promovieron cambios en la estructura secundaria (determinada por DC o 1H-RMN) de los pptidos modificados (mHABPs) cuando se compar con la estructura de los cHABPs nativos; adicionalmente, estos mHABPs invirtieron su comportamiento inmunolgico convirtindose en pptidos inmunognicos inductores de anticuerpos. Lo que permite establecer la existencia de una relacin entre la estructura que adoptan estos mHABPs con su actividad inmunolgica. Adems, algunos de los mHABPs estudiados aqu, pueden ser candidatos a ser incluidos en la vacuna contra la malaria qumicamente sintetizada multi-epitope y multi-estadio que se est desarrollando en la Fundacin Instituto de Inmunologa de Colombia (FIDIC).
Resumo:
El desarrollo de una vacuna contra malaria es un rea de exploracin activa pero con enormes retos debido especialmente a la complejidad del ciclo del parsito. As, es necesario bloquear las diferentes etapas de la invasin que tiene el Plasmodium falciparum y extraer de ellas la mayor informacin posible de la artillera que utiliza para su ataque. Para esto, pptidos de las proteínas STARP, CelTOS y TRSP (del esporozoito) y SERA 5 (del merozoito) que tienen alta afinidad de unin a clulas HepG2 y a glbulos rojos respectivamente (conocidos como cHABPs), han sido modificados (conocidos como mHABPs), sintetizados y evaluados a nivel de respuesta inmune en monos Aotus as como estudiados en su conformacin estructural por RMN de 1H. Los resultados muestran que los pptidos nativos no son inmunognicos, pero pueden inducir altos ttulos de anticuerpos cuando sus residuos crticos o sus vecinos son reemplazados por otro con un volumen y masa similar, pero diferente polaridad. El estudio conformacional pone de manifiesto que las estructuras de los pptidos nativos son diferentes de sus pptidos modificados ya sea que muestren regiones estructuradas ms cortas o ms largas o que no presenten ninguna, en comparacin con sus anlogos modificados altamente inmunognicos. Las caractersticas estereoqumicas particulares en las cadenas laterales de algunos residuos de aminocidos de estos pptidos modificados as como los rasgos fisicoqumicos parecen jugar un rol importante en la respuesta inmune apropiada cuando estos fueron inmunizados en grupos de monos Aotus confiriendo un avance al diseo de una vacuna contra malaria totalmente eficaz.
