HLA-A Typing in formalin-fixed paraffin embedded tissue samples : towards potential retrospective analysis

El Antígeno Leucocitario Humano (HLA en inglés) ha sido descrito en muchos casos como factor de pronóstico para cáncer. La característica principal de los genes de HLA, localizados en el cromosoma 6 (6p21.3), son sus numerosos polimorfismos. Los análisis de secuencia de nucleótidos muestran que la variación está restringida predominantemente a los exones que codifican los dominios de unión a péptidos de la proteína. Por lo tanto, el polimorfismo del HLA define el repertorio de péptidos que se unen a los alotipos de HLA y este hecho define la habilidad de un individuo para responder a la exposición a muchos agentes infecciosos durante su vida. La tipificación de HLA se ha convertido en un análisis importante en clínica. Muestras de tejido embebidas en parafina y fijadas con formalina (FFPE en inglés) son recolectadas rutinariamente en oncología. Este procedimiento podría ser utilizado como una buena fuente de ADN, dado que en estudios en el pasado los ensayos de recolección de ADN no eran normalmente llevados a cabo de casi ningún tejido o muestra en procedimientos clínicos regulares. Teniendo en cuenta que el problema más importante con el ADN de muestras FFPE es la fragmentación, nosotros propusimos un nuevo método para la tipificación del alelo HLA-A desde muestras FFPE basado en las secuencias del exón 2, 3 y 4. Nosotros diseñamos un juego de 12 cebadores: cuatro para el exón 2 de HLA-A, tres para el exón 3 de HLA-A y cinco para el exón 4 de HLA-A, cada uno de acuerdo las secuencias flanqueantes de su respectivo exón y la variación en la secuencia entre diferentes alelos. 17 muestran FFPE colectadas en el Hospital Universitario de Karolinska en Estocolmo Suecia fueron sometidas a PCR y los productos fueron secuenciados. Finalmente todas las secuencias obtenidas fueron analizadas y comparadas con la base de datos del IMGT-HLA. Las muestras FFPE habían sido previamente tipificadas para HLA y los resultados fueron comparados con los de este método. De acuerdo con nuestros resultados, las muestras pudieron ser correctamente secuenciadas. Con este procedimiento, podemos concluir que nuestro estudio es el primer método de tipificación basado en secuencia que permite analizar muestras viejas de ADN de las cuales no se tiene otra fuente. Este estudio abre la posibilidad de desarrollar análisis para establecer nuevas relaciones entre HLA y diferentes enfermedades como el cáncer también.

Tissue- specific DNA methylation profiles in newborns

Experimental and epidemiological studies demonstrate that fetal growth restriction and low birth weight enhance the risk of chronic diseases in adulthood. Derangements in tissue-specific epigenetic programming of fetal and placental tissues are a suggested mechanism of which DNA methylation is best understood. DNA methylation profiles in human tissue are mostly performed in DNA from white blood cells. The objective of this study was to assess DNA methylation profiles of IGF2 DMR and H19 in DNA derived from four tissues of the newborn. We obtained from 6 newborns DNA from fetal placental tissue (n = 5), umbilical cord CD34+ hematopoietic stem cells (HSC) and CD34- mononuclear cells (MNC) (n = 6), and umbilical cord Wharton jelly (n = 5). HCS were isolated using magnetic-activated cell separation. DNA methylation of the imprinted fetal growth genes IGF2 DMR and H19 was measured in all tissues using quantitative mass spectrometry. ANOVA testing showed tissue-specific differences in DNA methylation of IGF2 DMR (p value 0.002) and H19 (p value 0.001) mainly due to a higher methylation of IGF2 DMR in Wharton jelly (mean 0.65, sd 0.14) and a lower methylation of H19 in placental tissue (mean 0.25, sd 0.02) compared to other tissues. This study demonstrates the feasibility of the assessment of differential tissue specific DNA methylation. Although the results have to be confirmed in larger sample sizes, our approach gives opportunities to investigate epigenetic profiles as underlying mechanism of associations between pregnancy exposures and outcome, and disease risks in later life.