Producció i caracterització de variants de la ribonucleasa pancreàtica humana dissenyades per a adquirir propietats citotòxiques

Amb la finalitat d'aprofundir en les bases moleculars de la citotoxicitat de les ribonucleases pancreàtiques, es van construir variants derivades de l'HP-RNasa seguint dues estratègies. En la primera, es van generar variants de l'enzim resistents a l'acció de l'inhibidor proteic de les ribonucleases (hRI), substituint residus implicats en la interfície de contacte entre la ribonucleasa i l'hRI. En la segona, es va addicionar el motiu RGD en regions de superfície de la proteïna implicades en la formació del complex amb l'hRI, a fi de promoure la seva interacció amb la membrana plasmàtica de les cèl·lules i a la vegada disminuir l'afinitat de les variants per l'hRI. Es va comprovar que només les variants portadores de substitucions múltiples adquirien la capacitat de resistència a l'hRI. L'estudi del percentatge d'inhibició de la síntesi proteica en cèl·lules incubades amb cadascuna de les variants va mostrar que només dues de les variants construïdes havien adquirit propietats citotòxiques. La citotoxicitat més elevada la va presentar una variant que no era resistent a l'hRI, amb valors que eren només entre 5 i 15 vegades inferiors als de l'onconasa. Aquest resultat demostrà que la sensibilitat a l'hRI no és necessàriament un paràmetre limitant per a la citotoxicitat de les ribonucleases. Cap de les variants que incorporava un motiu RGD presentà citotoxicitat, evidenciant que aquest motiu no és efectiu a fi de dotar les ribonucleases pancreàtiques de propietats citotòxiques. Es van estudiar les bases moleculars de la citotoxicitat de la variant més citotòxica. En primer lloc, l'anàlisi de la internalització per marcatge radioactiu d'aquesta variant en relació amb l'onconasa i amb altres variants de l'HP-RNasa no citotòxiques, va posar en evidència que només l'onconasa era internalitzada eficientment. Es descartava així la possibilitat que l'acció citotòxica de l'enzim estudiat fos conseqüència d'una major eficiència d'endocitosi. També es va comprovar que l'addició del motiu RGD no era capaç de promoure la internalització de les proteïnes amb més eficàcia. Per microscòpia confocal de fluorescència, les variants humanes només es van començar a detectar a l'interior de la cèl·lula a partir de les 24 h d'incubació. Totes les variants generades van presentar una eficiència catalítica superior al 50 % de l'activitat de la seva proteïna parental, PM5, indicant que probablement l'estructura del centre actiu no havia estat afectada de manera dràstica per les substitucions introduïdes. No obstant, en tots els casos es va produir una disminució en la termoestabilitat respecte a PM5. Aquest resultat indicà que la correlació descrita a la bibliografia entre l'increment de termoestabilitat i l'increment de citotoxicitat per les ribonucleases no sempre es compleix. Per microscòpia confocal es va comprovar que tant la proteïna més citotòxica, com una variant no citotòxica resistent a l'hRI, així com la proteïna parental, seguien la via de degradació lisosomal. Aquesta ruta de trànsit no va ser afectada per l'addició de drogues que alteren les vies de trànsit retrògrad (monensina i brefeldina A), però sí per l'addició de la bafilomicina A1, una droga que neutralitza el pH endosomal i que va actuar alentint el trànsit de les proteïnes als lisosomes. D'acord amb aquests resultats, els valors de citotoxicitat de les variants es van incrementar de manera significativa només en presència de bafilomicina A1, suggerint que les ribonucleases transloquen al citoplasma a partir d'algun punt de la via de trànsit endosomal. Es va comprovar que l'acció de la variant més citotòxica era deguda a que l'addició d'un segon motiu de tres Arg en PE5 dota a aquesta proteïna amb un senyal de transport nuclear. La fracció d'enzim que aconsegueix translocar al citoplasma a partir d'algun punt de la via endosomal previ als lisosomes, és conduït ràpidament al nucli de la cèl·lula per mitjà del mecanisme clàssic de transport actiu. Per la seva afinitat amb l'rRNA, l'enzim es concentra en el nuclèol, on probablement duu a terme la seva activitat catalítica. La interacció d'aquesta variant amb els receptors nucleocitoplasmàtics, les importines, impediria per altra banda el bloqueig de l'enzim per part de l'hRI. Els resultats obtinguts presenten una nova estratègia de disseny de ribonucleases citotòxiques, basada en l'addició de segments NLS a fi de promoure el transport nuclear dels enzims. Aquesta estratègia podria permetre superar limitacions que fins al moment han estat descrites com a limitants de la citotoxicitat de les ribonucleases pancreàtiques, com la sensibilitat a l'hRI o la baixa eficiència d'internalització.

Macrocicles nitrogenats contenint unitats de ferrocè i llurs complexos de Pal·ladi(0). Estudi estructural i aplicacions en catàlisi

La present tesi doctoral s'ha basat en la caracterització estructural i en l'estudi de les propietats catalítiques de nous complexos de pal·ladi(0) amb lligands olefínics contenint unitats de ferrocè. En una primera fase s'ha desenvolupat la síntesi d'estructures de tipus (E, E, E)-1,6,11-trisarilsulfonil-1,6,11-triazaciclopentadeca-3,8,13-triè contenint des d'una fins a tres unitats de ferrocè i s'ha estudiat la seva complexació amb pal·ladi(0). Mitjançant estudis electroquímics s'ha avaluat la seva possible aplicació en el reconeixement molecular electroquímic. Encara que aquest tipus d'estructures no han resultat vàlides per aquest tipus de processos de reconeixement, l'estudi electroquímic ha permès determinar que la presència del grup ferrocenil influeix en les propietats redox del metall complexat. S'ha descrit també l'obtenció de macrocicles pentaolefínics anàlegs de 25 membres contenint unitats de ferrocè i s'ha estudiat paral·lelament la seva complexació amb pal·ladi(0).En una segona part del treball s'han avaluat les propietats catalítiques del complex (E, E, E)-6,11-bis[(p-metilfenil)sulfonil]-1-ferrocenilsulfonil-1,6,11-triazaciclopentadeca-3,8,13-trièpal·ladi(0), en reaccions clàssicament catalitzades per pal·ladi tals com l'acoblament creuat de Suzuki o la reacció de Heck, i s'ha pogut determinar que és un catalitzador actiu en aquest tipus de reaccions, essent a més possible, la seva recuperació i reutilització. En el cas concret de la reacció de Heck s'han emprat sals de diazoni com a agents arilants i cal destacar que s'ha descrit el primer sistema catalític recuperable i reutilitzable per aquest tipus de reaccions. Mitjançant espectrometria de masses amb ionització per electrospray ha estat possible determinar el rol mecanístic del nostre complex de pal·ladi en la reacció de Heck amb sals de diazoni.Finalment, en una tercera part estructural del treball s'ha estudiat el comportament espectroscòpic dels complexos de pal·ladi(0) anteriorment mencionats, contenint des de tres unitats aríliques iguals fins a tres unitats aríliques diferents. Mitjançant RMN i difracció de raigs-X s'ha determinat que la complexitat estereoquímica dels complexos deriva dels isòmers que es poden formar mitjançant complexació del metall amb cada una de les cares dels tres dobles enllaços continguts a l'estructura.

New Ruthenium complexes containing N, P and S-donor type of ligands: coordination chemistry, characterization and application to asymetric and non-asymetric catalysis

Síntesi de nous complexos de Ruteni amb lligands no quirals que tenen per fórmula [Ru(phen)([9]aneS3)X] (on X = H2O, py i MeCN). Caracterització espectroscòpica electroquímica i estructural d'aquesta família de complexos. Estudi de les seves propietats catalítiques en front a l'oxidació de substrats orgànics com l'alcohol benzílic en reaccions d'electrocatàlisi. Avaluació cinètica dels mecanismes de substitució entre els complexos Ru-py i Ru-MeCN. Generació d'un interruptor molecular foto-induït. Síntesi de nous complexos quirals de Ru atropoisomèricament purs amb lligands oxazolínics que tenen per fórmula [Ru(trpy)(Ph-box-R)X] on (X = Cl, H2O, py, MeCN, 2-OH-py). Caracterització estructural exhaustiva en estat sòlid (Raig-X) en solució (RMN) i en fase gas (càlculs DFT). Avaluació de la seva activitat catalítica en reaccions asimmetriques d'epoxidació de substrats proquirals. Síntesi de nous lligands polipiridílics quirals amb simetria C3. Estudi de la seva química de coordinació i avaluació de la seva activitat catalítica en reaccions asimmetriques d'oxidació i reducció.

Nous complexos mono- i dinuclears de ruteni amb lligands polipiridílics i de tipus fosfina. Síntesi, caracterització i aplicacions catalítiques

La Tesi descriu de manera completa una sèrie de complexos de ruteni amb lligands polipiridílics i lligands auxiliars de tipus fosfina, dmso, nitril o aquo. Es descriuen estudis d'isomerització (cis/trans o coordinació meridional/facial) en complexos mononuclears, a partir de tècniques espectroscòpiques. Els resultats experimentals es corroboren a partir de càlculs DFT. S'han fet també estudis d'activitat catalítica en transferència d'hidrogen per als complexos Ru-fosfina. S'han sintetitzat també complexos dinuclears de ruteni amb el lligand tetradentat Hbpp i s'ha avaluat llur activitat en la catàlisi d'oxidació d'aigua, determinant la importància de la correcta orientació relativa dels centres actius Ru=O. L'heterogeneïtzació dels complexos sobre suports conductors permet avaluar llur activitat en fase heterogènia, millorant respecte el corresponent procés en dissolució. La co-polimerització dels catalitzadors amb espècies de tipus metalocarborà, amb major dilució del catalitzador i minimització de la sobreoxidació, millora notablement els resultats, permetent diverses reutilitzacions.

Preparació de nous catalitzadors basats en complexos de Ru i Pd, i el seu ancorament a polímers conductors per a la fabricació de materials multifuncionals

Aquesta tesi doctoral es basa en l'estudi de l'aplicació en catàlisi de dos tipus de complexos organometallics basats en dos metalls de tansició diferents. Concretament s'estudien complexos macrocíclics triolefínics de pal·ladi(0) com a catalitzadors per a les reaccions de Suzuki i Heck, i oxocomplexos carbènics de ruteni(II) com a espècies catalítiques en oxidacions de compostos orgànics. En el cas dels complexos de ruteni s'ha vist que en augmentar el nombre de lligands carbènics en l'esfera de coordinació del metall s'aconseguiex afavorir els processos bielectrònics, obtenint-se catalitzadors més actius i més selectius. En un segon pas, els dos tipus de catalitzadors homogenis s'han immobilitzat sobre la superfície d'un elèctrode mitjançant l'estratègia d'electropolimerització del grup pirrol. Els elèctodes modificats resultants s'han aplicat com a catalitzadors heterogenis. En ambdós casos els catalitzadors heterogenis han mostrat una activitat equiparable o superior a la del sistema homogeni corresponent. Finalment, s'ha assajat una reacció de catàlisi tàndem en què els dos catalitzadors (immobilitzats sobre el mateix elèctrode) actuen en cooperació. S'ha aconseguit realitzar dues transformacions consecutives d'un substat orgànic.

Síntesi i Caracterització de Nous Complexos de Ruteni contenint Lligands Quirals. Aplicacions en Catàlisi Asimètrica

La Tesis describe una serie de complejos de Rutenio conteniendo ligandos quirales y su aplicación en catálisis asimétrica. Por un lado se describe el complejo [RuCl(bpea)((S)-BINAP)](BF4), donde (S)-BINAP es una difosfina quiral y bpea un ligando N-tridentado. Su aplicación en catálisis de hidrogenación asimétrica de sustratos olefínicos y carbonílicos, tanto en fase homogénea como heterogénea (tras inmovilización sobre soportes alumino-fosfato), ha mostrado excelentes resultados de conversión y excesos enantioméricos. Aparte, se ha desarrollado una familia de complejos con fórmula [Ru(T)(B)X], donde T representa un ligando tri-N-dentado, B una di-oxazolina quiral y X es Cl o H2O. Se ha estudiado la actividad catalítica de los aquocomplejos con T = tpm en epoxidaciones, determinándose la influencia de los sustituyentes en B sobre el rendimiento y la quimioselectividad, favorecidos por interacciones de tipo π-stacking. El uso de otros ligandos tridentados ha llevado a su rotura, habiéndose caracterizado sin embargo los correspondientes complejos

Síntesi, caracterització i avaluació com a catalitzadors de nous complexos quirals de platí

The oxidative addition proved to be a useful method to prepare platinum (II) hydridotiolate by reaction of tetrakis(triphenylphosphine)platinum(0) with aminothiolate and phosphinothiolate ligands like cysteamine, cysteine ethyl and methyl Esther, 2-(diphenylphosphino)ethanetiol and 2-(diphenylphosphino)propanetiol. The complexes are square-planar and the aminothiolate or phosphinothiolate ligands are chelated to platinum (II). The hydrido ligand is trans to the sulfur and the other coordination position is occuped by a triphenylphosphine ligand. The complexes are mononuclear and they show low symmetry. The only symmetry element, the plan is broke if the ligand is branched, obtaining asymmetric complexes C1. If the ligand has electronic or esteric impediments the reaction doesn't run and the starting products are recovered. This was observed with N,N-dimethylcysteamine and penicylamine methyl esther ligands. In the special case of orthoaminotiophenol the hydridotiolate was obtained but the ligand was not chelated. The aminothiolate complexes don't show solution equilibrium. Otherwise, the complexe with 2-(diphenylphosphino)ethanetiol show an isomerisation equilibrium which forms cis isomer as a minor component. The complexe with 2-(diphenylphosphino)-propanetiol shows a conformational equilibrium between chair and twist forms. The complexes have been tested as catalyst precursors in hydroformylation and hydrosilylation reactions. The hydroformylation reaction runs only in presence of SnCl2 as cocatalyst. Catalytic activity depends on the presence of triphenylphosphine and, with less magnitude, CO and H2 pressure. We also studied the enantioselectivity using a chiral complexe. In the hydrosililation reaction, catalysts run with good results (<90%) using triethylsilane as silicon hydride. Dehydrogenative addition product has been also found in this reaction.