Characterization of cytotoxic ribonucleases: from the internalization pathway to the importance of dimeric structures

En aquesta tesi s'ha caracteritzat la ruta d'internalització de l'onconasa, una RNasa citotòxica. Els resultats indiquen que l'onconasa entra a les cèl·lules per la via dependent de clatrina i del complex AP-2. Seguidament es dirigeix als endosomes de reciclatge i es a través d'aquesta ruta que la proteïna exerceix la citotoxicitat. Per altra banda, els resultats d'aquest treball demostren que PE5, una variant citotòxica de la ribonucleasa pancreàtica humana (HP-RNasa), interacciona amb la importina  mitjançant diferents residus que tot i que no són seqüencials, es troben propers en l'estructura tridimensional d'aquesta proteïna. PM8 és una HP-RNasa amb estructura cristal·logràfica dimèrica constituïda per intercanvi de dominis N-terminals. En aquesta tesi s'han establert les condicions per estabilitzar aquest dimer en solució i també es proposa un mecanisme per la dimerització.

L´onconasa com a model per l´estudi de les bases moleculars de la citotoxicitat de les ribonucleases pancreàtiques. Aplicacions a la construcció de ribonucleases amb activitat antimicrobiana

La primera part d'aquest treball s´ha centrat en la caracterització i optimització del procés d'activació de l´onconasa recombinant per tal d'obtenir l´enzim igual a la forma nativa. Per això, les reaccions d'eliminació de la Met-1 i la ciclació de la Glu1, necessàries per generar el piroglutamic han estat seguides per MALDI-TOF MS. La segona part d´aquest treball s´ha centrat en l´estudi de la contribució del pont disulfur 30-75 de l´onconasa a les seves propietats biològiques. Els resultats suggereixen que el potencial redox del citosol cel·lular podria reduir el pont disulfur 30-75 de l´onconasa salvatge afectant la unió onconasa -inhibidor proteic de ribonucleases. La tercera part ha consistit en la construcció de variants de l´HP-RNasa i onconasa amb activitat bactericida. Per això, s´ha introduït el determinant bactericida (YRWR) descrit per la proteïna catiònica d'eosinòfils en els dos enzims. Els resultats obtinguts han evidenciat que les dues ribonucleases amb el determinant bactericida presenten activitat citotòxica contra bacteris gram-negatius preferentment.

Producció i caracterització de variants de la ribonucleasa pancreàtica humana dissenyades per a adquirir propietats citotòxiques

Amb la finalitat d'aprofundir en les bases moleculars de la citotoxicitat de les ribonucleases pancreàtiques, es van construir variants derivades de l'HP-RNasa seguint dues estratègies. En la primera, es van generar variants de l'enzim resistents a l'acció de l'inhibidor proteic de les ribonucleases (hRI), substituint residus implicats en la interfície de contacte entre la ribonucleasa i l'hRI. En la segona, es va addicionar el motiu RGD en regions de superfície de la proteïna implicades en la formació del complex amb l'hRI, a fi de promoure la seva interacció amb la membrana plasmàtica de les cèl·lules i a la vegada disminuir l'afinitat de les variants per l'hRI. Es va comprovar que només les variants portadores de substitucions múltiples adquirien la capacitat de resistència a l'hRI. L'estudi del percentatge d'inhibició de la síntesi proteica en cèl·lules incubades amb cadascuna de les variants va mostrar que només dues de les variants construïdes havien adquirit propietats citotòxiques. La citotoxicitat més elevada la va presentar una variant que no era resistent a l'hRI, amb valors que eren només entre 5 i 15 vegades inferiors als de l'onconasa. Aquest resultat demostrà que la sensibilitat a l'hRI no és necessàriament un paràmetre limitant per a la citotoxicitat de les ribonucleases. Cap de les variants que incorporava un motiu RGD presentà citotoxicitat, evidenciant que aquest motiu no és efectiu a fi de dotar les ribonucleases pancreàtiques de propietats citotòxiques. Es van estudiar les bases moleculars de la citotoxicitat de la variant més citotòxica. En primer lloc, l'anàlisi de la internalització per marcatge radioactiu d'aquesta variant en relació amb l'onconasa i amb altres variants de l'HP-RNasa no citotòxiques, va posar en evidència que només l'onconasa era internalitzada eficientment. Es descartava així la possibilitat que l'acció citotòxica de l'enzim estudiat fos conseqüència d'una major eficiència d'endocitosi. També es va comprovar que l'addició del motiu RGD no era capaç de promoure la internalització de les proteïnes amb més eficàcia. Per microscòpia confocal de fluorescència, les variants humanes només es van començar a detectar a l'interior de la cèl·lula a partir de les 24 h d'incubació. Totes les variants generades van presentar una eficiència catalítica superior al 50 % de l'activitat de la seva proteïna parental, PM5, indicant que probablement l'estructura del centre actiu no havia estat afectada de manera dràstica per les substitucions introduïdes. No obstant, en tots els casos es va produir una disminució en la termoestabilitat respecte a PM5. Aquest resultat indicà que la correlació descrita a la bibliografia entre l'increment de termoestabilitat i l'increment de citotoxicitat per les ribonucleases no sempre es compleix. Per microscòpia confocal es va comprovar que tant la proteïna més citotòxica, com una variant no citotòxica resistent a l'hRI, així com la proteïna parental, seguien la via de degradació lisosomal. Aquesta ruta de trànsit no va ser afectada per l'addició de drogues que alteren les vies de trànsit retrògrad (monensina i brefeldina A), però sí per l'addició de la bafilomicina A1, una droga que neutralitza el pH endosomal i que va actuar alentint el trànsit de les proteïnes als lisosomes. D'acord amb aquests resultats, els valors de citotoxicitat de les variants es van incrementar de manera significativa només en presència de bafilomicina A1, suggerint que les ribonucleases transloquen al citoplasma a partir d'algun punt de la via de trànsit endosomal. Es va comprovar que l'acció de la variant més citotòxica era deguda a que l'addició d'un segon motiu de tres Arg en PE5 dota a aquesta proteïna amb un senyal de transport nuclear. La fracció d'enzim que aconsegueix translocar al citoplasma a partir d'algun punt de la via endosomal previ als lisosomes, és conduït ràpidament al nucli de la cèl·lula per mitjà del mecanisme clàssic de transport actiu. Per la seva afinitat amb l'rRNA, l'enzim es concentra en el nuclèol, on probablement duu a terme la seva activitat catalítica. La interacció d'aquesta variant amb els receptors nucleocitoplasmàtics, les importines, impediria per altra banda el bloqueig de l'enzim per part de l'hRI. Els resultats obtinguts presenten una nova estratègia de disseny de ribonucleases citotòxiques, basada en l'addició de segments NLS a fi de promoure el transport nuclear dels enzims. Aquesta estratègia podria permetre superar limitacions que fins al moment han estat descrites com a limitants de la citotoxicitat de les ribonucleases pancreàtiques, com la sensibilitat a l'hRI o la baixa eficiència d'internalització.

Anàlisi dels descartaments efectuats per la flota d'arrossegament en el Golf de Lleó

La pesca d'arrossegament practicada al mar Mediterrani incideix sobre un rang batimètric molt ampli i afecta a nombrosos tipus de fons que presenten comunitats molt diversificades, on les espècies de peixos, crustacis, cefalòpodes, altres mol·luscs, equinoderms i d'altres macroorganismes epibentònics interaccionen entre si. D'aquí la importància de caracteritzar amb una aproximació multiespecífica els fons explotats, com la que aquí hem dut a terme, prenent en consideració no tan sols les espècies d'interès comercial sinó totes les espècies que conformen la comunitat. Els objectius concrets d'aquesta tesi estan centrats en l'estudi qualitatiu i quantitatiu dels descartaments produïts per la pesca d'arrossegament que efectua la flota espanyola en la zona del Golf de Lleó, i en aspectes relacionats a millorar la selectivitat de les xarxes emprades canviant el disseny de la malla tradicional per malla quadrada. El mostreig s'ha dut a terme a bord d'una embarcació d'arrossegament comercial, amb una freqüència setmanal, dins el període comprès entre març del 1998 i març del 2000. En total s'han analitzat 68 pesques. Totes les mostres estudiades provenen del primer vol del dia i s'han capturat a fondàries entre 50 i 500 metres. De tot el volum capturat durant l'estudi s'han identificat un total de 307 espècies pertanyent a diversos grups taxonòmics. El grup taxonòmic majoritari és el dels peixos amb 133 espècies, seguit dels crustacis, els cefalòpodes, els equinoderms i finalment el grup d'altres invertebrats. L'espècie més capturada en nombre a la pesquera del Golf de Lleó ha estat la cervellina (Leptometra phalangium) i les més capturades en biomassa han estat la sardina (Sardina pilchardus) i el lluç mediterrani (Merluccius merluccius smiridus). Pel total de la captura la fracció descartada en nombre d'individus representa el 71% mentre que la biomassa descartada és de l'ordre del 36%. La causa més important en quant a quantitat de rebuig produït és la que respon al compliment de la normativa vigent, ja sigui per les talles mínimes legals o per les captures acompanyants permeses. Els majors descartaments estacionals en termes d'abundància es donen a la primavera i l'estiu, coincidint amb l'època de reclutament de la majoria de les espècies explotades. En canvi, els descartaments estacionals en termes de biomassa són excepcionalment elevats a l'estiu i estan provocats per la captura massiva de sardina (S. pilchardus) durant aquesta època de l'any. El rebuig expressat tant en nombre com en pes disminueix en funció de l'estrat de fondària, essent la quantitat descartada major en l'estrat A (50-200 m) i menor en l'estrat C (>400 m). S'ha comprovat que el disseny de malla quadrada aplicat al cóp de les xarxes d'arrossegament fa augmentar dràsticament, tant en nombre com en pes, el percentatge d'individus escapats, disminuint a la vegada la quantitat de descartament. També s'aconsegueix un augment de la mida de primera captura (L50) de totes les espècies excepte en la bruixa de quatre taques (Lepidorhombus boscii). A més es redueix l'impacte de la pesca sobre els estocs d'individus juvenils, sobretot d'espècies que presenten una secció de cos rodona com el lluç mediterrani (M. merluccius smiridus) i el verat (Scomber scombrus), disminuint així la sobrepesca de creixement i de reclutament al mateix temps que s'assegura i es millora la venda d'exemplars de mida legal.

Improvement of heat-induced gel properties of porcine plasma

L'objectiu és millorar els gels de plasma porcí induïts per calor a pH àcid utilitzant transglutaminasa microbiana (MTGasa). El tractament millora textura i CRA dels gels a pH 5,5, però les millores no són suficients per recuperar les pèrdues degut a l'acidificació. L'estructura globular de les proteïnes dificulta l'atac enzimàtic. La reactivitat de l'enzim no millora amb l'addició de cisteïna a plasma amb MTGasa. El tractament del plasma amb MTGasa sota alta pressió (HP) millora la duresa dels gels. No obstant, la CRA només millora lleugerament. La duresa es pot incrementar mantenint les solucions de plasma pressuritzat sota refrigeració, encara que no millora la CRA. Es pot concloure que les pèrdues en la textura dels gels de plasma induïts per calor a pH àcid es poden recuperar parcialment tractant amb MTGasa, especialment afegint cisteïna o sota HP. Encara que la CRA només es veu lleugerament millorada en el segon cas.