The in vivo characterization of the DNA repair gene apn-1 in the model organism Caenorhabditis elegans

Les sites apuriniques/apyrimidinique (AP) représentent une forme de dommage à l’ADN hautement mutagène et ce type de dommage peut survenir spontanément ou être induit par une variété d’agents. Afin de préserver la stabilité génomique, deux familles d’endonucléases de type AP, endo-IV et exo-III, sont nécessaires pour contrecarrer les effets mutagènes des sites AP. Malgré l’identification de membres des deux familles dans plusieurs organismes unicellulaire tels que E.coli et S. cerevisiae, aucun membre de la famille endo-IV n’a été identifié chez les organismes multicellulaires à l’exception de C. elegans et de C. briggsae. Nous avons donc décidé d’investiguer l’importance biologique de APN-1 chez C. elegans par l’utilisation d’une approche de knockdown du gène. Dans notre étude, nous avons montré que le knockdown du gène apn-1 chez C. elegans, en utilisant des ARN d’interférence (ARNi), cause une accumulation de mutations spontanées et induites par des drogues résultant en un délai de l’éclosion des œufs ainsi que par une diminution de la survie et de la longévité des vers adultes. De plus, nous avons montré que cette accumulation de mutations mène à un délai dans la progression du cycle cellulaire durant l’embryogénèse, représentant possiblement une explication du délai dans l’éclosion des œufs. Nous avons montré qu’il y avait une augmentation du niveau de mutations dans la gorge des vers, sans toutefois pouvoir confirmer la distribution de APN-1 qui possède une étiquette GFP. Les animaux transgéniques APN-1-GFP n’exprimaient pas suffisamment de la protéine de fusion pour permettre une visualisation à l’aide d’un microscope à fluorescence, mais la protéine a été détectée par immunobuvardage de type western. Les animaux transgéniques APN-1-GFP étaient instables et avaient des phénotypes concordants avec les défauts génétiques. En conclusion, il semble que C. elegans aie évolué afin de retenir un niveau de base de APN-1 jouant ainsi un rôle versatile afin de maintenir l’intégrité génétique d’autant plus que cet organisme semble manquer plusieurs enzymes de la voie de réparation par excision de base.

Morphologie évolutive et fonctionnelle des hémichordés

L’embranchement Hemichordata regroupe les classes Enteropneusta et Pterobranchia. Hemichordata constitue, avec l’embranchement Echinodermata, le groupe-frère des chordés. Les entéropneustes sont des organismes vermiformes solitaires qui vivent sous ou à la surface du substrat et s’alimentent généralement par déposivorie, alors que les ptérobranches sont des organismes coloniaux filtreurs habitant dans un réseau de tubes appelé coenecium. Ce mémoire présente trois études dont le point commun est l’utilisation des hémichordés actuels pour répondre à des questions concernant l’évolution des hémichordés, des chordés, et du super-embranchement qui les regroupe, Deuterostomia. Notre première étude démontre que les fentes pharyngiennes, l’organe pré-oral cilié (POCO) et le pharynx de l’entéropneuste Protoglossus graveolens sont utilisés pour l’alimentation par filtration. Le système de filtration de P. graveolens permet la capture de particules jusqu’à 1.3 um, à un débit de 4.05 mm.s-1, pour une demande énergétique de 0.009 uW. Les similarités structurales et fonctionnelles avec le système de filtration des céphalochordés suggèrent que la filtration pharyngienne est ancestrale aux deutérostomes. Lors de notre deuxième étude, nous avons exploré l’hypothèse selon laquelle le POCO des entéropneustes, une structure ciliée pré-buccale au rôle possiblement chémorécepteur, serait homologue au « wheel organ » des céphalochordés et à l’adénohypophyse des vertébrés. Pour cela, nous avons déterminé par immunohistochimie l’expression de Pit-1, un facteur de transcription spécifique à ces deux structures, chez l’entéropneuste Saccoglossus pusillus. Pit-1 est exprimé dans des cellules sensorielles du POCO, mais aussi dans des cellules épithéliales distribuées dans le proboscis, collet et tronc. Ce patron d’expression ne permet pas de confirmer ou rejeter l’homologie du POCO et de l’adénohypophyse des vertébrés. Lors de notre troisième étude, nous avons caractérisé l’ultrastructure du coenecium des ptérobranches Cephalodiscus hodgsoni, Cephalodiscus nigrescens et Cephalodiscus densus par microscopie électronique à transmisison et à balayage. Cephalodiscus est le groupe frère de Graptolithina, un groupe qui inclut les graptolithes éteints ainsi que les ptérobranches du genre Rhabdopleura. Nous avons décrit les types de fibrilles de collagène présents, leur taille et leur organisation, ainsi que l’organisation globale du coenecium. Nous avons ainsi démontré la présence chez Cephalodiscus d’une organisation similaire au paracortex, pseudocortex et eucortex des graptolithes. La présence chez Cephalodiscus de ce type d’organisation suggère que le cortex est ancestral à la classe Pterobranchia. Ces trois études illustrent plusieurs axes importants de la recherche sur les hémichordés, qui en intégrant des données morphologiques, fonctionnelles et moléculaires permet de reconstruire certains évènements clés de l’évolution des deutérostomes.

Le Baylisascaris procyonis dans le sud du Québec : prévalence chez le raton laveur et étude de contamination des latrines

Le raton laveur (Procyon lotor) est porteur de nombreux parasites dont certains sont des agents de zoonose. Il nous est apparu opportun d’étudier la faune parasitaire intestinale du raton laveur québécois, particulièrement l’espèce Baylisascaris procyonis. L’étude a donc porté sur l’examen de matières fécales (n = 301) et de contenus intestinaux (n = 203) de 351 ratons laveurs provenant de deux programmes gouvernementaux sur la rage du raton laveur et d’excréments (n = 409) provenant de latrines dans des parcs nationaux du Québec. Des oeufs de B. procyonis étaient excrétés par 23,3 % des ratons laveurs, alors que 29,1 % étaient porteurs de vers. La charge parasitaire moyenne des vers B. procyonis de tout stade variait de 8,5 chez les adultes à 27,1 chez les juvéniles. Chez ces derniers, la charge parasitaire était 11,4 fois supérieure à celle des ratons adultes (p < 0,0001) dont 23,7 fois plus de vers immatures (p < 0,0001) et 9,1 fois plus de vers matures (p = 0,01). Le nombre d’oeufs était 24,7 fois plus élevé chez les ratons juvéniles (p = 0,02) et 50,0 fois moins élevé chez la femelle allaitante. La probabilité du raton d’excréter des oeufs l’automne était de 11,1 (IC95 %: 1,21-101,60) par rapport au printemps et de 21,1 (IC95 %: 2,91-153,18) par rapport à l’été (p < 0,01). La sensibilité (Se) et la spécificité (Sp) de la coproscopie comparée à la nécropsie (norme étalon) ont été calculées en se basant sur l’observation des vers matures (Se : 81,8 %; Sp : 97,7 %) et des vers de tout stade (Se : 53,9 %; Sp : 97,0 %). De plus, la recherche des parasites intestinaux nous a permis de découvrir des ookystes de Giardia (6/159), espèce parasitaire nouvellement rapportée chez le raton. En 2007, nous avons trouvé, par échantillonnage unique, des oeufs de B. procyonis dans 15,8 % des latrines (n = 165) identifiées dans des parcs nationaux du sud du Québec et en 2008, par échantillonnage multiple, dans 89,7 % des latrines (n = 26) actives situées dans des secteurs accessibles à l’homme dans trois parcs nationaux de la Montérégie. Le potentiel zoonotique de B. procyonis est un problème de santé publique qui pourrait devenir sérieux étant donné le pourcentage élevé de ratons laveurs qui excrètent le parasite et qui contaminent des secteurs accessibles par les humains.

A computational fluid dynamic study on the filtering mechanics in suspension feeding marine invertebrates

Les suspensivores ont la tâche importante de séparer les particules de l'eau. Bien qu'une grande gamme de morphologies existe pour les structures d'alimentation, elles sont pratiquement toutes constituées de rangées de cylindres qui interagissent avec leur environnement fluide. Le mécanisme de capture des particules utilisé dépend des contraintes morphologiques, des besoins énergétiques et des conditions d'écoulement. Comme nos objectifs étaient de comprendre ces relations, nous avons eu recours à des études de comparaison pour interpréter les tendances en nature et pour comprendre les conditions qui provoquent de nouveaux fonctionnements. Nous avons utilisé la dynamique des fluides numérique (computational fluid dynamics, CFD) pour créer des expériences contrôlées et pour simplifier les analyses. Notre première étude démontre que les coûts énergétiques associés au pompage dans les espaces petits sont élevés. De plus, le CFD suggère que les fentes branchiales des ptérobranches sont des structures rudimentaires, d'un ancêtre plus grande. Ce dernier point confirme l'hypothèse qu'un ver se nourrit par filtration tel que l'ancêtre des deuterostomes. Notre deuxième étude détermine la gamme du nombre de Reynolds number critique où la performance d'un filtre de balane change. Quand le Re est très bas, les différences morphologiques n'ont pas un grand effet sur le fonctionnement. Cependant, une pagaie devient une passoire lorsque le Re se trouve entre 1 et 3,5. Le CFD s’est dévoilé être un outil très utile qui a permis d’obtenir des détails sur les microfluides. Ces études montrent comment la morphologie et les dynamiques des fluides interagissent avec la mécanisme de capture ou de structures utilisées, ainsi que comment des petits changements de taille, de forme, ou de vitesse d'écoulement peuvent conduire à un nouveau fonctionnement.

Daughters of Lilith : transgressive femininity in Bram Stoker’s late gothic fiction

Daughters of Lilith: Transgressive Femininity in Bram Stoker’s Late Gothic Fiction explore le thème de la transgression féminine dans quatre romans gothiques de Bram Stoker. En combinant les études féministes et les études de genre, cette thèse examine les différents visages de la dissidence féminine à travers Dracula (1897), The Jewel of Seven Stars (1903), The Lady of the Shroud (1909) et The Lair of the White Worm (1911). Dans ces textes, la transgression est incarnée par la femme hystérique, la mère monstrueuse, la femme exotique et la New Woman. De plus, le traitement de ces stéréotypes féminins révèle une certaine tolérance envers la dissension féminine chez l’auteur. Souvent perçu comme un écrivain conservateur, Stoker est plutôt qualifié de progressiste dans cette thèse. L’inclusion de personnages féminins forts et déterminés à travers ses romans ainsi que ses rapports avec plusieurs féministes et proto-féministes dans sa vie privée témoignent de sa libéralité envers les femmes. Sa largeur d’esprit semble d’ailleurs évoluer tout au long de sa carrière ainsi qu’avec la progression du mouvement suffragiste britannique, une période mouvante à la fin du dix-neuvième et au début du vingtième siècle.

Étude de la toxicité causée par le gène C9orf72 dans la Sclérose Latérale Amyotrophique

La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative qui affecte les neurones moteurs. 10% des cas sont des cas familiaux et l’étude de ces familles a mené à la découverte de plusieurs gènes pouvant causer la SLA, incluant SOD1, TARDBP et FUS. L’expansion de la répétition GGGGCC dans le gène C9orf72 est, à ce jour, la cause la plus connue de SLA. L’impact de cette expansion est encore méconnu et il reste à déterminer si la toxicité est causée par un gain de fonction, une perte de fonction ou les deux. Plusieurs gènes impliqués dans la SLA sont conservés entre le nématode Caenorhabditis elegans et l’humain. C. elegans est un vers transparent fréquemment utilisé pour des études anatomiques, comportementales et génétiques. Il possède une lignée cellulaire invariable qui inclue 302 neurones. Aussi, les mécanismes de réponse au stress ainsi que les mécanismes de vieillissement sont très bien conservés entre ce nématode et l’humain. Donc, notre groupe, et plusieurs autres, ont utilisé C. elegans pour étudier plusieurs aspects de la SLA. Pour mieux comprendre la toxicité causée par l’expansion GGGGCC de C9orf72, nous avons développé deux modèles de vers pour étudier l’impact d’une perte de fonction ainsi que d’un gain de toxicité de l’ARN. Pour voir les conséquences d’une perte de fonction, nous avons étudié l’orthologue de C9orf72 dans C. elegans, alfa-1 (ALS/FTD associated gene homolog). Les vers mutants alfa-1(ok3062) développent des problèmes moteurs causant une paralysie et une dégénérescence spécifique des neurones moteurs GABAergiques. De plus, les mutants sont sensibles au stress osmotique qui provoque une dégénérescence. D’autre part, l’expression de la séquence d’ARN contenant une répétition pathogénique GGGGCC cause aussi des problèmes moteurs et de la dégénérescence affectant les neurones moteurs. Nos résultats suggèrent donc qu’un gain de toxicité de l’ARN ainsi qu’une perte de fonction de C9orf72 sont donc toxiques pour les neurones. Puisque le mouvement du vers peut être rapidement évalué en cultivant les vers dans un milieu liquide, nous avons développé un criblage de molécules pouvant affecter le mouvement des vers mutants alfa-1 en culture liquide. Plus de 4 000 composés ont été évalués et 80 ameliore la mobilité des vers alfa-1. Onze molécules ont aussi été testées dans les vers exprimant l’expansion GGGGCC et huit diminuent aussi le phénotype moteur de ces vers. Finalement, des huit molécules qui diminent la toxicité causée par la perte de fonction de C9orf72 et la toxicité de l’ARN, deux restaurent aussi l’expression anormale de plusieurs transcrits d’ARN observée dans des cellules dérivées de patient C9orf72. Avec ce projet, nous voulons identifier des molécules pouvant affecter tous les modes de toxicité de C9orf72 et possiblement ouvrir de nouvelles avenues thérapeutiques

L’exploitation d’un modèle de levure présentant une déficience de l’absorption des anthracyclines révèle qu’une protéine de Caenorhabditis elegans, OCT-1, est un transporteur fonctionnel d’anthracyclines

Les anthracyclines, comme la doxorubicine (DOX) ou la daunorubicine (DNR), sont utilisées dans le traitement d’une grande variété de cancers allant des lymphomes, au cancer du sein, en passant par certaines leucémies. Encore aujourd’hui, beaucoup pensent que les anthracyclines entrent dans les cellules par diffusion passive, toutefois, la plupart de ces mêmes personnes sont d’accord pour dire que la p-glycoprotéine est responsable d’exporter ces molécules hors de la cellule. Mais pourquoi une molécule aurait besoin d’un transporteur pour sortir de la cellule, et pas pour y entrer ? Qu’est-ce qui ferait que la diffusion passive fonctionnerait dans un sens, mais pas dans l’autre, d’autant que l’entrée des anthracyclines dans les cellules est très rapide ? Nous pensons qu’il existe bel et bien un transporteur responsable de faire passer les anthracyclines du milieu extracellulaire au cytoplasme, et nous voulons développer un modèle de levure qui permettrait de déterminer si une protéine, un transporteur, issue d’un autre organisme eucaryote est en mesure de transporter la DOX à l’intérieur de la cellule. Pour ce faire, nous avons rassemblé un groupe de mutants présentant une déficience dans l’absorption d’autres molécules chargées positivement telles que la bléomycine ou le NaD1 et avons déterminé le taux d’absorption de DOX de chacun de ces mutants. Les simples mutants sam3Δ ou dur3Δ n’ont montré qu’une faible réduction de l’absorption de DOX, voire, aucune, par rapport à la souche parentale. Si le double mutant sam3Δdur3Δ a montré une réduction relativement importante de l’absorption de DOX, c’est le mutant agp2Δ qui présentait la plus grande réduction d’absorption de DOX, ainsi qu’une résistance notable à son effet létal. Nous avons utilisé, par la suite, ce mutant pour exprimer, à l’aide d’un vecteur d’expression, une protéine du ver Caenorhabditis elegans, OCT-1 (CeOCT-1). Les résultats ont montré que cette protéine était en mesure de restaurer l’absorption de DOX, compromise chez le mutant agp2Δ ainsi que d’augmenter la sensibilité de la souche parentale à son effet létal, lorsqu’exprimée chez celle-ci. Cela suggère que CeOCT-1 est un transporteur fonctionnel de DOX et contredit également le dogme selon lequel les anthracyclines entrent dans les cellules par diffusion passive.