Molecular characterization of the contribution of autophagy to antigen presentation using quantitative proteomics

L’autophagie est une voie hautement conservée de dégradation lysosomale des constituants cellulaires qui est essentiel à l’homéostasie cellulaire et contribue à l’apprêtement et à la présentation des antigènes. Les rôles relativement récents de l'autophagie dans l'immunité innée et acquise sous-tendent de nouveaux paradigmes immunologiques pouvant faciliter le développement de nouvelles thérapies où la dérégulation de l’autophagie est associée à des maladies auto-immunes. Cependant, l'étude in vivo de la réponse autophagique est difficile en raison du nombre limité de méthodes d'analyse pouvant fournir une définition dynamique des protéines clés impliquées dans cette voie. En conséquence, nous avons développé un programme de recherche en protéomique intégrée afin d’identifier et de quantifier les proteines associées à l'autophagie et de déterminer les mécanismes moléculaires régissant les fonctions de l’autophagosome dans la présentation antigénique en utilisant une approche de biologie des systèmes. Pour étudier comment l'autophagie et la présentation antigénique sont activement régulés dans les macrophages, nous avons d'abord procédé à une étude protéomique à grande échelle sous différentes conditions connues pour stimuler l'autophagie, tels l’activation par les cytokines et l’infection virale. La cytokine tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) est l'une des principales cytokines pro-inflammatoires qui intervient dans les réactions locales et systémiques afin de développer une réponse immune adaptative. La protéomique quantitative d'extraits membranaires de macrophages contrôles et stimulés avec le TNF-alpha a révélé que l'activation des macrophages a entrainé la dégradation de protéines mitochondriales et des changements d’abondance de plusieurs protéines impliquées dans le trafic vésiculaire et la réponse immunitaire. Nous avons constaté que la dégradation des protéines mitochondriales était sous le contrôle de la voie ATG5, et était spécifique au TNF-alpha. En outre, l’utilisation d’un nouveau système de présentation antigènique, nous a permi de constater que l'induction de la mitophagie par le TNF-alpha a entrainée l’apprêtement et la présentation d’antigènes mitochondriaux par des molécules du CMH de classe I, contribuant ainsi la variation du répertoire immunopeptidomique à la surface cellulaire. Ces résultats mettent en évidence un rôle insoupçonné du TNF-alpha dans la mitophagie et permet une meilleure compréhension des mécanismes responsables de la présentation d’auto-antigènes par les molécules du CMH de classe I. Une interaction complexe existe également entre infection virale et l'autophagie. Récemment, notre laboratoire a fourni une première preuve suggérant que la macroautophagie peut contribuer à la présentation de protéines virales par les molécules du CMH de classe I lors de l’infection virale par l'herpès simplex virus de type 1 (HSV-1). Le virus HSV1 fait parti des virus humains les plus complexes et les plus répandues. Bien que la composition des particules virales a été étudiée précédemment, on connaît moins bien l'expression de l'ensemble du protéome viral lors de l’infection des cellules hôtes. Afin de caractériser les changements dynamiques de l’expression des protéines virales lors de l’infection, nous avons analysé par LC-MS/MS le protéome du HSV1 dans les macrophages infectés. Ces analyses nous ont permis d’identifier un total de 67 protéines virales structurales et non structurales (82% du protéome HSV1) en utilisant le spectromètre de masse LTQ-Orbitrap. Nous avons également identifié 90 nouveaux sites de phosphorylation et de dix nouveaux sites d’ubiquitylation sur différentes protéines virales. Suite à l’ubiquitylation, les protéines virales peuvent se localiser au noyau ou participer à des événements de fusion avec la membrane nucléaire, suggérant ainsi que cette modification pourrait influer le trafic vésiculaire des protéines virales. Le traitement avec des inhibiteurs de la réplication de l'ADN induit des changements sur l'abondance et la modification des protéines virales, mettant en évidence l'interdépendance des protéines virales au cours du cycle de vie du virus. Compte tenu de l'importance de la dynamique d'expression, de l’ubiquitylation et la phosphorylation sur la fonction des proteines virales, ces résultats ouvriront la voie vers de nouvelles études sur la biologie des virus de l'herpès. Fait intéressant, l'infection HSV1 dans les macrophages déclenche une nouvelle forme d'autophagie qui diffère remarquablement de la macroautophagie. Ce processus, appelé autophagie associée à l’enveloppe nucléaire (nuclear envelope derived autophagy, NEDA), conduit à la formation de vésicules membranaires contenant 4 couches lipidiques provenant de l'enveloppe nucléaire où on retrouve une grande proportion de certaines protéines virales, telle la glycoprotéine B. Les mécanismes régissant NEDA et leur importance lors de l’infection virale sont encore méconnus. En utilisant un essai de présentation antigénique, nous avons pu montrer que la voie NEDA est indépendante d’ATG5 et participe à l’apprêtement et la présentation d’antigènes viraux par le CMH de classe I. Pour comprendre l'implication de NEDA dans la présentation des antigènes, il est essentiel de caractériser le protéome des autophagosomes isolés à partir de macrophages infectés par HSV1. Aussi, nous avons développé une nouvelle approche de fractionnement basé sur l’isolation de lysosomes chargés de billes de latex, nous permettant ainsi d’obtenir des extraits cellulaires enrichis en autophagosomes. Le transfert des antigènes HSV1 dans les autophagosomes a été determine par protéomique quantitative. Les protéines provenant de l’enveloppe nucléaire ont été préférentiellement transférées dans les autophagosome lors de l'infection des macrophages par le HSV1. Les analyses protéomiques d’autophagosomes impliquant NEDA ou la macroautophagie ont permis de decouvrir des mécanismes jouant un rôle clé dans l’immunodominance de la glycoprotéine B lors de l'infection HSV1. Ces analyses ont également révélées que diverses voies autophagiques peuvent être induites pour favoriser la capture sélective de protéines virales, façonnant de façon dynamique la nature de la réponse immunitaire lors d'une infection. En conclusion, l'application des méthodes de protéomique quantitative a joué un rôle clé dans l'identification et la quantification des protéines ayant des rôles importants dans la régulation de l'autophagie chez les macrophages, et nous a permis d'identifier les changements qui se produisent lors de la formation des autophagosomes lors de maladies inflammatoires ou d’infection virale. En outre, notre approche de biologie des systèmes, qui combine la protéomique quantitative basée sur la spectrométrie de masse avec des essais fonctionnels tels la présentation antigénique, nous a permis d’acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes moléculaires régissant les fonctions de l'autophagie lors de la présentation antigénique. Une meilleure compréhension de ces mécanismes permettra de réduire les effets nuisibles de l'immunodominance suite à l'infection virale ou lors du développement du cancer en mettant en place une réponse immunitaire appropriée.

Mécanismes d'activation de la voie lysosomale durant l'apoptose chimio-induite

L’apoptose est une forme de mort cellulaire essentielle au développement et au maintien de l’homéostase chez les animaux multicellulaires. La machinerie apoptotiq ue requiert la participation des caspases, des protéases conservées dans l’évolution et celle des organelles cytoplasmiques. Les lysosomes subissent des ruptures partielles, labilisation de la membrane lysosomale (LML), qui entraînent l’activation des cathepsines dans le cytoplasme de cellules cancéreuses humaines en apoptose induite par la camptothecin (CPT), incluant les histiocytes humains U-937. Ces modifications lysosomales se manifestent tôt durant l’activation de l’apoptose, concomitamment avec la perméabilisation de la mitochondrie et l’activation des caspases. Une étude protéomique quantitative et comparative a permis d’identifier des changements précoces dans l’expression/localisation de protéines lysosomales de cellules U-937 en apoptose. Lors de deux expériences indépendantes, sur plus de 538 protéines lysosomales identifiées et quantifiées grâce au marquage isobarique iTRAQ et LC-ESIMS/ MS, 18 protéines augmentent et 9 diminuent dans les lysosomes purifiés de cellules en cours d’apoptose comparativement aux cellules contrôles. Les candidats validés par immuno-buvardage et microscopie confocale incluent le stérol-4-alpha-carboxylate 3- déhydrogénase, le prosaposin et la protéine kinase C delta (PKC-d). Des expériences fonctionnelles ont démontrées que la translocation de PKC-d aux lysosomes est requise pour la LML puisque la réduction de son expression par ARN interférents ou l’inhibition de son activité à l’aide du rottlerin empêche la LML lors de l’apoptose induite par la CPT. La translocation de PKC-d aux lysosomes conduit à la phosphorylation et l’activation de la sphingomyelinase acide lysosomale (ASM), et à l’accroissement subséquent du contenu en céramide (CER) à la membrane lysosomale. Cette accumulation de CER endogène aux lysosomes est un évènement critique pour la LML induite par la CPT car l’inhibition de l’activité de PKC-d ou de ASM diminue la formation de CER et la LML.Ces résultats révèlent un nouveau mécanisme par lequel la PKC-d active l’ASM qui conduit à son tour à l’accumulation de CER à la membrane lysosomale et déclenche la LML et l’activation de la voie lysosomale de l’apoptose induite par la CPT. En somme, ce mécanisme confirme l’importance du métabolisme des sphingolipides dans l’activation de la voie lysosomale de l’apoptose.

Analytical strategies for the comprehensive profiling of histone post translational modifications by mass spectrometry and implications for functional analyses

Le long bio-polymère d'ADN est condensé à l’intérieur du noyau des cellules eukaryotes à l'aide de petites protéines appelées histones. En plus de leurs fonctions condensatrices,ces histones sont également la cible de nombreuses modifications post-traductionnelles(MPT), particulièrement au niveau de leur section N-terminale. Ces modifications réversibles font partie d’un code d’histones épi-génétique transmissible qui orchestre et module dynamiquement certains événements impliquant la chromatine, tels l’activation et la désactivation de gènes ainsi que la duplication et la réparation d’ADN. Ces modifications sont impliquées subséquemment dans la signalisation et la progression de cancers, tels que la leucémie. En conséquence, l'élucidation des modifications d’histones est importante pour comprendre leurs fonctions biologiques. Une méthodologie analytique a été mise au point en laboratoire pour isoler, détecter, et quantifier les MPT d’histones en utilisant une approche rapide à deux volets à l’aide d’outils bioinformatiques spécialisés. La méthodologie développée en laboratoire a été validée en utilisant des histones de souche sauvage ainsi que deux types d’histones mutants déficients en enzymes acétyltransferase. Des trois sources d’histones utilisées, la seule MPT qui a démontré un changement significatif est l’acétylation de l’histone H3 à lysine 56 (H3K56ac). L’expression et la stoechiométrie de cette MPT, issue de cellules de souche sauvage et de cellules mutantes, ont été déterminées avec précision et comparées. Les fonctions de balayage polyvalentes d'un instrument à trappe ionique quadrupôle linéaire hybride ont été utilisées pour améliorer la détection de protéines intactes. Le mode de balayage « enhanced multiply charged » (EMC) a été modifié pour contenir et détecter les ions de protéines intactes situées dans la trappe ionique linéaire. Ce mode de balayage nommé « targeted EMC » (tEMC) a permis de quadrupler le niveau de sensibilité (signal/interférence), et quintupler la résolution du mode de balayage conventionnel. De plus, la capacité de séparation des charges du tEMC a réduit de façon significative les effets de « space charge » dans la trappe ionique linéaire. La résolution supérieure du mode tEMC a permis de différencier plusieurs isoformes modifiées, particulièrement pour l’histone H3. L’analyse des peptides d’histones trypsiques à l’aide du mode de balayage « MRM » a permis le séquençage et la quantification de MPT avec un haut degré de précision. La seule MPT qui était sous-exprimée entre l’histone de souche sauvage et le mutant DOT1L fut la méthylation de l’histone H3 lysine 79(H3K79me1). Les effets de deux inhibiteurs d’enzymes HDAC (HDACi) sur l’expression de MPT d’histone ont été évalués en utilisant la méthodologie analytique mentionnée. Les histones extraites de cellules normales et cancéreuses ont été exposées à du Vorinostat(SAHA) ou du Entinostat (MS-275) pour une période de 24 à 72 heures. Deux histones furent principalement affectées, soit H3 et H4. Étonnamment, les mêmes effets n'ont pas été détectés lorsque les cellules normales ont été traitées avec le HDACi pour une période de 48 à 72 heures. Une méthode absolue de quantification avec une courbe d’étalonnage a été développée pour le peptide H3K56ac. Contrairement à certaines publications, nos résultats démontrent que cette MPT est présente dans les cellules mammifères avec une stoechiométrie très basse (< 0,1%) et n'est pas surexprimée de façon significative après le traitement au HDACi.

Large scale identification of protein SUMOylation by mass spectrometry in HEK293 cells

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Identification de nouveaux substrats des kinases Erk1/2 par une approche bio-informatique, pharmacologique et phosphoprotéomique

La phosphorylation est une modification post-traductionnelle omniprésente des protéines Cette modification est ajoutée et enlevée par l’activité enzymatique respective des protéines kinases et phosphatases. Les kinases Erk1/2 sont au cœur d’une voie de signalisation importante qui régule l’activité de protéines impliquées dans la traduction, le cycle cellulaire, le réarrangement du cytosquelette et la transcription. Ces kinases sont aussi impliquées dans le développement de l’organisme, le métabolisme du glucose, la réponse immunitaire et la mémoire. Différentes pathologies humaines comme le diabète, les maladies cardiovasculaires et principalement le cancer, sont associées à une perturbation de la phosphorylation sur les différents acteurs de cette voie. Considérant l’importance biologique et clinique de ces deux kinases, connaître l’étendue de leur activité enzymatique pourrait mener au développement de nouvelles thérapies pharmacologiques. Dans ce contexte, l’objectif principal de cette thèse était de mesurer l’influence de cette voie sur le phosphoprotéome et de découvrir de nouveaux substrats des kinases Erk1/2. Une étude phosphoprotéomique de cinétique d’inhibition pharmacologique de la voie de signalisation Erk1/2 a alors été entreprise. Le succès de cette étude était basé sur trois technologies clés, soit l’enrichissement des phosphopeptides avec le dioxyde de titane, la spectrométrie de masse haut débit et haute résolution, et le développement d’une plateforme bio-informatique nommée ProteoConnections. Cette plateforme permet d’organiser les données de protéomique, évaluer leur qualité, indiquer les changements d’abondance et accélérer l’interprétation des données. Une fonctionnalité distinctive de ProteoConnections est l’annotation des sites phosphorylés identifiés (kinases, domaines, structures, conservation, interactions protéiques phospho-dépendantes). Ces informations ont été essentielles à l’analyse des 9615 sites phosphorylés sur les 2108 protéines identifiées dans cette étude, soit le plus large ensemble rapporté chez le rat jusqu’à ce jour. L’analyse des domaines protéiques a révélé que les domaines impliqués dans les interactions avec les protéines, les acides nucléiques et les autres molécules sont les plus fréquemment phosphorylés et que les sites sont stratégiquement localisés pour affecter les interactions. Un algorithme a été implémenté pour trouver les substrats potentiels des kinases Erk1/2 à partir des sites identifiés selon leur motif de phosphorylation, leur cinétique de stimulation au sérum et l’inhibition pharmacologique de Mek1/2. Une liste de 157 substrats potentiels des kinases Erk1/2 a ainsi été obtenue. Parmi les substrats identifiés, douze ont déjà été rapportés et plusieurs autres ont des fonctions associées aux substrats déjà connus. Six substrats (Ddx47, Hmg20a, Junb, Map2k2, Numa1, Rras2) ont été confirmés par un essai kinase in vitro avec Erk1. Nos expériences d’immunofluorescence ont démontré que la phosphorylation de Hmg20a sur la sérine 105 par Erk1/2 affecte la localisation nucléocytoplasmique de cette protéine. Finalement, les phosphopeptides isomériques positionnels, soit des peptides avec la même séquence d’acides aminés mais phosphorylés à différentes positions, ont été étudiés avec deux nouveaux algorithmes. Cette étude a permis de déterminer leur fréquence dans un extrait enrichi en phosphopeptides et d’évaluer leur séparation par chromatographie liquide en phase inverse. Une stratégie analytique employant un des algorithmes a été développée pour réaliser une analyse de spectrométrie de masse ciblée afin de découvrir les isomères ayant été manqués par la méthode d’analyse conventionnelle.

Étude de la voie de signalisation de l’insuline chez la drosophile par une approche phosphoprotéomique

La phosphorylation est une modification post-traductionnelle modulant l’activité, la conformation ou la localisation d’une protéine et régulant divers processus. Les kinases et phosphatases sont responsables de la dynamique de phosphorylation et agissent de manière coordonnée. L’activation anormale ou la dérégulation de kinases peuvent conduire au développement de cancers ou de désordres métaboliques. Les récepteurs tyrosine kinase (RTKs) sont souvent impliqués dans des maladies et la compréhension des mécanismes régissant leur régulation permet de déterminer les effets anticipés sur leurs substrats. Dans ce contexte, le but de cette thèse est d’identifier les évènements de phosphorylation intervenant dans la voie de l’insuline chez la drosophile impliquant un RTK : le récepteur de l’insuline (InR). La cascade de phosphorylation déclenchée suite à l’activation du récepteur est conservée chez le mammifère. Afin d’étudier le phosphoprotéome de cellules S2 de drosophile, nous avons utilisé une étape d’enrichissement de phosphopeptides sur dioxyde de titane suivie de leur séparation par chromatographie liquide (LC) et mobilité ionique (FAIMS). Les phosphopeptides sont analysés par spectrométrie de masse en tandem à haute résolution. Nous avons d’abord démontré les bénéfices de l’utilisation du FAIMS comparativement à une étude conventionnelle en rapportant une augmentation de 50 % dans le nombre de phosphopeptides identifiés avec FAIMS. Cette technique permet de séparer des phosphoisomères difficilement distinguables par LC et l’acquisition de spectres MS/MS distincts où la localisation précise du phosphate est déterminée. Nous avons appliqué cette approche pour l’étude des phosphoprotéomes de cellules S2 contrôles ou traitées à l’insuline et avons identifié 32 phosphopeptides (sur 2 660 quantifiés) pour lesquels la phosphorylation est modulée. Étonnamment, 50 % des cibles régulées possèdent un site consensus pour la kinase CK2. Une stratégie d’inhibition par RNAi a été implémentée afin d’investiguer le rôle de CK2 dans la voie de l’insuline. Nous avons identifié 6 phosphoprotéines (CG30085, su(var)205, scny, protein CDV3 homolog, D1 et mu2) positivement régulées suite à l’insuline et négativement modulées après le traitement par RNAi CK2. Par essai kinase in vitro, nous avons identifié 29 cibles directes de CK2 dont 15 corrélaient avec les résultats obtenus par RNAi. Nous avons démontré que la phosphorylation de su(var)205 (S15) était modulée par l’insuline en plus d’être une cible directe de CK2 suite à l’expérience RNAi et à l’essai kinase. L’analyse des données phosphoprotéomiques a mis en évidence des phosphopeptides isomériques dont certains étaient séparables par FAIMS. Nous avons déterminé leur fréquence lors d’études à grande échelle grâce à deux algorithmes. Le script basé sur les différences de temps de rétention entre isomères a identifié 64 phosphoisomères séparés par LC chez la souris et le rat (moins de 1 % des peptides identifiés). Chez la drosophile, 117 ont été répertoriés en combinaison avec une approche ciblée impliquant des listes d’inclusion. Le second algorithme basé sur la présence d’ions caractéristiques suite à la fragmentation de formes qui co-éluent a rapporté 23 paires isomériques. L’importance de pouvoir distinguer des phosphoisomères est capitale dans le but d’associer une fonction biologique à un site de phosphorylation précis qui doit être identifié avec confiance.

Detection and quantification of staphylococcus aureus enterotoxin B in food product using isotopic dilution techniques and mass spectrometry

L’entérotoxine B staphylococcique (SEB) est une toxine entérique hautement résistante à la chaleur et est responsable de plus de 50 % des cas d’intoxication d’origine alimentaire par une entérotoxine. L’objectif principal de ce projet de maîtrise est de développer et valider une méthode basée sur des nouvelles stratégies analytiques permettant la détection et la quantification de SEB dans les matrices alimentaires. Une carte de peptides tryptiques a été produite et 3 peptides tryptiques spécifiques ont été sélectionnés pour servir de peptides témoins à partir des 9 fragments protéolytiques identifiés (couverture de 35 % de la séquence). L’anhydride acétique et la forme deutérée furent utilisés afin de synthétiser des peptides standards marqués avec un isotope léger et lourd. La combinaison de mélanges des deux isotopes à des concentrations molaires différentes fut utilisée afin d’établir la linéarité et les résultats ont démontré que les mesures faites par dilution isotopique combinée au CL-SM/SM respectaient les critères généralement reconnus d’épreuves biologiques avec des valeurs de pente près de 1, des valeurs de R2 supérieure à 0,98 et des coefficients de variation (CV%) inférieurs à 8 %. La précision et l’exactitude de la méthode ont été évaluées à l’aide d’échantillons d’homogénat de viande de poulet dans lesquels SEB a été introduite. SEB a été enrichie à 0,2, 1 et 2 pmol/g. Les résultats analytiques révèlent que la méthode procure une plage d’exactitude de 84,9 à 91,1 %. Dans l’ensemble, les résultats présentés dans ce mémoire démontrent que les méthodes protéomiques peuvent être utilisées efficacement pour détecter et quantifier SEB dans les matrices alimentaires. Mots clés : spectrométrie de masse; marquage isotopique; protéomique quantitative; entérotoxines

The Exchange Rate in a Dynamic-Optimizing Current Account Model with Nominal Rigidities: a Quantitative Investigation.

This paper studies a dynamic-optimizing model of a semi-small open economy with sticky nominal prices and wages. the model exhibits exchange rate overshooting in response to money supply shocks. the predicted variability of nominal and real exchange rates is roughly consistent with that of G7 effective exchange rates during the post-Bretton Woods era.

Développement et validation d’un outil clinique pour l’analyse quantitative de la posture auprès de personnes atteintes d’une scoliose idiopathique

La scoliose idiopathique (SI) est une déformation tridimensionnelle (3D) de la colonne vertébrale et de la cage thoracique à potentiel évolutif pendant la croissance. Cette déformation 3D entraîne des asymétries de la posture. La correction de la posture est un des objectifs du traitement en physiothérapie chez les jeunes atteints d’une SI afin d’éviter la progression de la scoliose, de réduire les déformations morphologiques et leurs impacts sur la qualité de vie. Les outils cliniques actuels ne permettent pas de quantifier globalement les changements de la posture attribuables à la progression de la scoliose ou à l’efficacité des interventions thérapeutiques. L’objectif de cette thèse consiste donc au développement et à la validation d’un nouvel outil clinique permettant l’analyse quantitative de la posture auprès de personnes atteintes d’une SI. Ce projet vise plus spécifiquement à déterminer la fidélité et la validité des indices de posture (IP) de ce nouvel outil clinique et à vérifier leur capacité à détecter des changements entre les positions debout et assise. Suite à une recension de la littérature, 34 IP représentant l’alignement frontal et sagittal des différents segments corporels ont été sélectionnés. L’outil quantitatif clinique d’évaluation de la posture (outil 2D) construit dans ce projet consiste en un logiciel qui permet de calculer les différents IP (mesures angulaires et linéaires). L’interface graphique de cet outil est conviviale et permet de sélectionner interactivement des marqueurs sur les photographies digitales. Afin de vérifier la fidélité et la validité des IP de cet outil, la posture debout de 70 participants âgés entre 10 et 20 ans atteints d'une SI (angle de Cobb: 15º à 60º) a été évaluée à deux occasions par deux physiothérapeutes. Des marqueurs placés sur plusieurs repères anatomiques, ainsi que des points de référence anatomique (yeux, lobes des oreilles, etc.), ont permis de mesurer les IP 2D en utilisant des photographies. Ces mêmes marqueurs et points de référence ont également servi au calcul d’IP 3D obtenus par des reconstructions du tronc avec un système de topographie de surface. Les angles de Cobb frontaux et sagittaux et le déjettement C7-S1 ont été mesurés sur des radiographies. La théorie de la généralisabilité a été utilisée pour déterminer la fidélité et l’erreur standard de la mesure (ESM) des IP de l’outil 2D. Des coefficients de Pearson ont servi à déterminer la validité concomitante des IP du tronc de l’outil 2D avec les IP 3D et les mesures radiographiques correspondantes. Cinquante participants ont été également évalués en position assise « membres inférieurs allongés » pour l’étude comparative de la posture debout et assise. Des tests de t pour échantillons appariés ont été utilisés pour détecter les différences entre les positions debout et assise. Nos résultats indiquent un bon niveau de fidélité pour la majorité des IP de l’outil 2D. La corrélation entre les IP 2D et 3D est bonne pour les épaules, les omoplates, le déjettement C7-S1, les angles de taille, la scoliose thoracique et le bassin. Elle est faible à modérée pour la cyphose thoracique, la lordose lombaire et la scoliose thoraco-lombaire ou lombaire. La corrélation entre les IP 2D et les mesures radiographiques est bonne pour le déjettement C7-S1, la scoliose et la cyphose thoracique. L’outil est suffisamment discriminant pour détecter des différences entre la posture debout et assise pour dix des treize IP. Certaines recommandations spécifiques résultents de ce projet : la hauteur de la caméra devrait être ajustée en fonction de la taille des personnes; la formation des juges est importante pour maximiser la précision de la pose des marqueurs; et des marqueurs montés sur des tiges devraient faciliter l’évaluation des courbures vertébrales sagittales. En conclusion, l’outil développé dans le cadre de cette thèse possède de bonnes propriétés psychométriques et permet une évaluation globale de la posture. Cet outil devrait contribuer à l’amélioration de la pratique clinique en facilitant l’analyse de la posture debout et assise. Cet outil s’avère une alternative clinique pour suivre l’évolution de la scoliose thoracique et diminuer la fréquence des radiographies au cours du suivi de jeunes atteints d’une SI thoracique. Cet outil pourrait aussi être utile pour vérifier l’efficacité des interventions thérapeutiques sur la posture.

Analyse quantitative des cyanotoxines d'eau douce par LDTD-APCI-MS/MS

Avec la hausse mondiale de la fréquence des floraisons de cyanobactéries (CB), dont certaines produisent des cyanotoxines (CT), le développement d’une méthode de détection/quantification rapide d’un maximum de CT s’impose. Cette méthode permettrait de faire un suivi quotidien de la toxicité de plans d’eau contaminés par des CB et ainsi d’émettre rapidement des avis d’alerte appropriés afin de protéger la santé publique. Une nouvelle technologie utilisant la désorption thermique induite par diode laser (LDTD) couplée à l’ionisation chimique sous pression atmosphérique (APCI) et reliée à la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) a déjà fait ses preuves avec des temps d'analyse de l’ordre de quelques secondes. Les analytes sont désorbés par la LDTD, ionisés en phase gazeuse par APCI et détectés par la MS/MS. Il n’y a donc pas de séparation chromatographique, et la préparation de l’échantillon avant l’analyse est minimale selon la complexité de la matrice contenant les analytes. Parmi les quatre CT testées (microcystine-LR, cylindrospermopsine, saxitoxine et anatoxine-a (ANA-a)), seule l’ANA-a a généré une désorption significative nécessaire au développement d’une méthode analytique avec l’interface LDTD-APCI. La forte polarité ou le poids moléculaire élevé des autres CT empêche probablement leur désorption. L’optimisation des paramètres instrumentaux, tout en tenant compte de l’interférence isobarique de l’acide aminé phénylalanine (PHE) lors de la détection de l’ANA-a par MS/MS, a généré une limite de détection d’ANA-a de l’ordre de 1 ug/L. Celle-ci a été évaluée à partir d’une matrice apparentée à une matrice réelle, démontrant qu’il serait possible d’utiliser la LDTD pour effectuer le suivi de l’ANA-a dans les eaux naturelles selon les normes environnementales applicables (1 à 12 ug/L). Il a été possible d’éviter l’interférence isobarique de la PHE en raison de sa très faible désorption avec l’interface LDTD-APCI. En effet, il a été démontré qu’une concentration aussi élevée que 500 ug/L de PHE ne causait aucune interférence sur le signal de l’ANA-a.

Pauvreté, criminalité et problèmes de santé mentale : une évaluation qualitative et quantitative des interventions communautaires et policières dans un taudis mal famé

L'analyse quantitative a été réalisée en cotutelle avec Rémi Boivin et Pierre Tremblay et publiée dans la Revue de Criminologie: Boivin, R., Lamige, C,. Tremblay, P. (2009) La police devrait-elle cibler les taudis malfamés? Criminologie, (42)1, 225-266.

Développement d'une méthode d'isolation des noyaux adaptée aux macrophages pour une caractérisation protéomique d'une nouvelle structure autophagique induite par le virus HSV-1

L’autophagie est un processus cellulaire catabolique qui a été conservé durant l’évolution de la levure à l’homme. Cet important mécanisme consiste en une dégradation des composants cytoplasmiques dans une structure lytique, le lysosome. Il existe trois types de l’autophagie : la microautophagie, l’autophagie médiée par les chaperones et la macroautophagie nommée « autophagie ». Il a été démontré que lors de l’autophagie, le matériel cytoplasmique (protéines cytosoliques et organites) est séquestré dans l’autophagosome qui finit par fusionner avec le lysosome, formant ainsi l’autophagolysosome. Le matériel séquestré et la membrane interne de l’autophagosome seront dégradés par les hydrolases lysosomales. Plusieurs études se sont focalisées sur la détermination de la machinerie moléculaire et les mécanismes de l’autophagie. Il a été démontré l’implication de 31 molécules Atg essentielles dans le processus de l’autophagie. L’identification de ces protéines a permis de déceler le rôle de l’autophagie non seulement dans le maintien de l’homéostasie cellulaire mais aussi dans la défense contre les agents pathogènes. En effet, l’autophagie joue un rôle important dans l’immunité innée conduisant à contrôler l’évasion des pathogènes dont les bactéries et les virus. Également, l’autophagie est impliquée dans l’immunité adaptative en favorisant la présentation des antigènes viraux par le CMH de classe II aux cellules T CD4+. De plus, une étude récente suggère que l’autophagie contribue à la présentation antigénique par le CMH de classe I aux cellules T CD8+ durant une infection virale par le virus HSV-1 (Herpes simplex type 1). Toutefois, certains virus y compris HSV-1 ont pu développer des mécanismes pour contourner et inhiber en partie le rôle protecteur de l’autophagie. Récemment, une étude dans notre laboratoire a mis en évidence, lors d’une infection virale par HSV-1 des cellules macrophages BMA, la présence d’une nouvelle structure autophagique dans une phase tardive de l’infection. Cette nouvelle structure est différente des autophagosomes classiques à double membrane et est caractérisée morphologiquement par quatre membranes dérivées de l’enveloppe nucléaire interne et externe. Peu de choses ont été rapportées sur cette nouvelle voie autophagique qui peut être un mécanisme de défense cellulaire quand l’autophagie classique dans le cytosol est inhibée par HSV-1. Il devient donc intéressant de caractériser les molécules impliquées dans la formation de ces autophagosomes issus du noyau par spectrométrie de masse. Pour ce faire, il était impératif d’établir un outil d’isolation des noyaux à partir de macrophages infectés par HSV-1 dans lesquels les autophagosomes issus des noyaux seront formés. La validation de cette méthode d’isolation a été effectuée en déterminant la pureté et l’intégrité des noyaux isolés à partir des cellules non infectées (contrôle) et infectées par HSV-1. La pureté des préparations de noyaux isolés a été caractérisée par l’absence de contaminants cellulaires et un enrichissement en noyaux. Également, il a fallu déterminer la cinétique de formation des autophagosomes issus des noyaux pour les deux lignées cellulaires de macrophages utilisées dans ce projet. Dans une perspective future, l’analyse protéomique à partir des échantillons purs des noyaux isolés (non infectés et infectés) mènera à identifier les protéines impliquées dans la formation des autophagosomes dérivés des noyaux, ce qui permettra ultérieurement d’effectuer des études sur les mécanismes moléculaires et les fonctions de cette nouvelle voie autophagique.

Caractérisation de la migration du virus Herpès simplex de type 1 (HSV-1) par protéomique

Le virus Herpès simplex de type 1 (HSV-1), agent étiologique des feux sauvages, possède une structure multicouche comprenant une capside icosaédrale qui protège le génome viral d’ADN, une couche protéique très structurée appelée tégument et une enveloppe lipidique dérivant de la cellule hôte et parsemée de glycoprotéines virales. Tous ces constituants sont acquis séquentiellement à partir du noyau, du cytoplasme et du réseau trans-golgien. Cette structure multicouche confère à HSV-1 un potentiel considérable pour incorporer des protéines virales et cellulaires. Toutefois, l’ensemble des protéines qui composent ce virus n’a pas encore été élucidé. De plus, malgré son rôle critique à différentes étapes de l’infection, le tégument demeure encore mal défini et ce, tant dans sa composition que dans la séquence d’addition des protéines qui le composent. Toutes ces incertitudes quant aux mécanismes impliqués dans la morphogenèse du virus nous amènent à l’objectif de ce projet, soit la caractérisation du processus de maturation d’HSV-1. Le premier article présenté dans cette thèse et publié dans Journal of Virology s’attarde à la caractérisation protéique des virus extracellulaires matures. Grâce à l’élaboration d’un protocole d’isolation et de purification de ces virions, une étude protéomique a pu être effectuée. Celle-ci nous a permis de réaliser une cartographie de la composition globale en protéines virales des virus matures (8 protéines de la capside, 23 protéines du tégument et 13 glycoprotéines) qui a fait la page couverture de Journal of Virology. De plus, l’incorporation potentielle de 49 protéines cellulaires différentes a été révélée. Lors de cette étude protéomique, nous avons aussi relevé la présence de nouveaux composants du virion dont UL7, UL23, ICP0 et ICP4. Le deuxième article publié dans Journal of General Virology focalise sur ces protéines via une analyse biochimique afin de mieux comprendre les interactions et la dynamique du tégument. Ces résultats nous révèlent que, contrairement aux protéines ICP0 et ICP4, UL7 et UL23 peuvent être relâchées de la capside en présence de sels et que les cystéines libres jouent un rôle dans cette relâche. De plus, cet article met en évidence la présence d’ICP0 et d’ICP4 sur les capsides nucléaires suggérant une acquisition possible du tégument au noyau. La complexité du processus de morphogenèse du virus ainsi que la mise en évidence d’acquisition de protéines du tégument au noyau nous ont incités à poursuivre nos recherches sur la composition du virus à un stade précoce de son cycle viral. Les capsides C matures, prémisses des virus extracellulaires, ont donc été isolées et purifiées grâce à un protocole innovateur basé sur le tri par cytométrie en flux. L’analyse préliminaire de ces capsides par protéomique a permis d’identifier 28 protéines virales et 39 protéines cellulaires. Les données recueilles, comparées à celles obtenues avec les virus extracellulaires, suggèrent clairement un processus séquentiel d’acquisition des protéines du tégument débutant dans le noyau, site d’assemblage des capsides. Finalement, tous ces résultats contribuent à une meilleure compréhension du processus complexe de maturation d’HSV-1 via l’utilisation de techniques variées et innovatrices, telles que la protéomique et la cytométrie en flux, pouvant être appliquées à d’autres virus mais aussi permettre le développement de meilleurs traitements pour vaincre l’HSV-1.

Développement de méthodes analytiques pour la protéomique et l'identification de peptides MHC I issus de cellules leucémiques

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

A study of rat chromosome 8 by congenics : Mapping and dissecting quantitative trait loci into opposite blood pressure effects

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.