Regulation of microsomal prostaglandin E2 synthase-1 and 5-lipoxygenase-activating protein/5-lipoxygenase by 4-hydroxynonenal in human osteoarthritic chondrocytes

L’arthrose (OA) est une maladie dégénérative et multifactorielle caractérisée par une destruction de cartilage, une formation d’ostéophytes et une inflammation au niveau de la membrane synoviale. Le 4-hydroxynonénal (HNE), un produit final de la peroxydation lipidique, a été identifié récemment comme un facteur catabolique et un médiateur inflammatoire dans le cartilage arthrosique humain. Notre projet vise à étudier l’effet du HNE sur la régulation de la prostaglandine E2 synthase-1 microsomale (mPGES-1) et de la protéine activante 5-lipoxygénase (FLAP)/5-lipoxygénase (5-LOX) dans les chondrocytes arthrosiques humains. Lorsque les cellules sont traitées une seule fois avec 10 µM HNE, les résultats de Western blot et de PCR en temps réel montrent que l’expression de la cyclooxygénase-2 (COX-2) et de la mPGES-1 augmente de manière significative et atteint respectivement le maximum après 8 et 16 heures d’incubation puis diminue graduellement. Cependant, lorsque les cellules sont traitées plusieurs fois avec 10 µM HNE à 2 heures d’intervalle, l’expression de la COX-2 et de la mPGES-1 augmente en fonction du temps sans subir une baisse après 24 heures d’incubation. Le HNE induit l’activité du promoteur de la mPGES-1 via l’activation du facteur de transcription Egr-1. L’investigation de la 2ème voie du métabolisme de l’acide arachidonique, à savoir 5-LOX/FLAP, montre que le HNE induit l’expression de FLAP après 24 heures de stimulation et celle de 5-LOX seulement après 48 heures. Ceci semble survenir à l’étape de transcription au cours de laquelle HNE induit l’expression de l’ARNm et l’activité du promoteur du gène 5-LOX. Nous avons démontré aussi que le niveau de leukotriène B4 (LTB4) augmente et suit le même profil que celui de la 5-LOX. L’étude des mécanismes moléculaires susceptibles d’être impliqués dans la régulation de la 5-LOX/FLAP par le HNE montre que ce dernier stimule leur expression via l’action de prostaglandine E2 (PGE2) et du facteur de croissance transformant-beta 1 (TGF-β1). En conclusion, notre étude démontre que le HNE induit à court-terme d’incubation la voie de COX-2/mPGES-1 puis par la suite stimule celle de FLAP/5-LOX à long-terme d’incubation dans les chondrocytes arthrosiques humains. Ces résultats suggèrent que la mPGES-1 et 5-LOX/FLAP sont des potentielles cibles thérapeutiques intéressantes pour contrôler la production de PGE2 et LTB4 dans OA.

CD40-stimulated B Lymphocytes Pulsed with Tumor Antigens Are Effective Antigen-presenting Cells That Can Generate Specific T Cells

Although they are considered as antigen presenting cells (APC), the role of antigen-unspecific B-lymphocytes in antigen presentation and T lymphocyte stimulation remains controversial. In this paper, we tested the capacity of normal human peripheral activated B cells to stimulate T cells using melanoma antigens or melanoma cell lysates. B lymphocytes activated through CD40 ligation and then pulsed with tumor antigens efficiently processed and presented MHC class II restricted peptides to specific CD4+ T cell clones. This suggests that CD40-activated B cells have the functional and molecular competence to present MHC class II epitopes when pulsed with exogenous antigens, thereby making them a relevant source of APC to generate T cells. To test this hypothesis, CD40-activated B cells were pulsed with a lysate prepared from melanoma cells and used to stimulate peripheral autologous T cells. Interestingly, T cells specific to melanoma antigens were generated. Further analysis of these T cell clones revealed that they recognized MHC class II restricted epitopes from tyrosinase, a known melanoma tumor antigen. The efficient antigen presentation by antigen-unspecific activated B cells was correlated with a down-regulation in the expression of HLA-DO, a B cell specific protein known to interfere with HLA-DM function. Because HLA-DM is important in MHC class II peptide loading, the observed decrease in HLA-DO may partially explain the enhanced antigen presentation following B-cell activation. Results globally suggest that when they are properly activated, antigen-unspecific B-lymphocytes can present exogenous antigens by MHC class II molecules and stimulate peripheral antigen-specific T cells. Antigen presentation by activated B cells could be exploited for immunotherapy by allowing the in vitro generation of T cells specific against antigens expressed by tumors or viruses.

Évaluation neurobiologique des souris spontanément hypertendues : Du vieillissement à la génomique comparative

Le but de cette thèse est premièrement d’évaluer l’effet du vieillissement sur les fonctions psychomotrices des souches de souris sélectionnées génétiquement en fonction de leur tension artérielle (TA); deuxièmement, de localiser les déterminants génétiques des phénotypes psychophysiologiques à partir de souches recombinantes congéniques (RCS). Ces travaux ont mené à la publication de 4 articles. Le premier article décrit l’évaluation des fonctions psychomotrices des souches avec une tension artérielle élevée (HBP), basse (LBP) et normale (NBP). La performance aux épreuves d’exploration, d’habiletés motrices et d’apprentissage spatial, a été mesurée sur deux cohortes âgées respectivement de 12 mois et de trois mois. Indépendamment de l’âge, les HBPs sont hyperactives dans l’open-field (OF), mais pas dans le test d’exploration de trous. Inversement, les LBP explorent moins d’espaces que les NBP et, à trois mois seulement, sont hypoactives dans l’OF. Par ailleurs, les HBPs et les LBP présentent des déficits précoces de coordination motrice et des fonctions visuo-motrices. Le second article concerne l’évaluation longitudinale de la coordination motrice, de l’anxiété et de l’apprentissage spatial des souches HBP, LBP et NBP, à l’âge de deux mois et de 12 mois. Le vieillissement accentue l’hyperactivité des HBPs dans l’OF. Par contre, l’hypoactivité des souris LBP est détectable seulement à l’âge de deux mois. Indépendamment de l’âge, les souris HBP et LBP montrent une perception réduite du danger dans l’épreuve d’anxiété et des dysfonctions visuo-motrices au labyrinthe aquatique. Enfin, des déficits précoces de coordination motrice se manifestent seulement chez les HBPs. Il reste à déterminer si les déficits observés sont liés à des déterminants génétiques indépendants ou secondaires aux altérations de la tension artérielle. Le troisième article présente la comparaison entre les souches consanguines A/J et C57Bl/6J (B6) aux épreuves de l’OF, de la planche à trous, du labyrinthe aquatique et du cintre (coordination motrice). Les B6 explore d’avantage l’OF et la planche à trous. Les B6 sont moins rapides sur le cintre, mais supérieurs aux A/J dans le labyrinthe aquatique, avec une plate-forme invisible ou visible. Ces résultats démontrent l’implication de déterminants génétiques. Cette thèse se termine par un quatrième article sur la localisation des déterminants génétiques de la susceptibilité au stress dans les RCS, dérivées de A/J et B6, et présentant un agencement spécifique de 12.5% du génome. La réactivité émotionnelle est évaluée dans l’OF et le plus-maze; la réponse de stress est mesurée par radio télémétrie de la température interne pendant le stress d’immobilisation (SI) sous diète régulière et riche en sel; l’excrétion des électrolytes urinaires est dosée après 24 heures de diète salée. Les loci les plus significatifs sont situés dans les régions suivantes: de l’émotionalité dans l’OF (Emo1) sur le chr. 1 (LOD=4.6) correspondant à la région homologue impliquée dans la cohorte d’hypertension familiale du Saguenay; de la dopa décarboxylase (ddc) sur le chr. 11 pour l’émergence du plus-maze (LOD=4.7); de la protéine liant l’endotoxine (lbp) sur le chr. 2 pour l’hypothermie initiale en réponse au SI (LOD=4); et de HSP90 sur le chr. 12 pour l’excrétion de Ca++ (LOD=4.6). Des banques de données sont ensuite interrogées pour recenser les polymorphismes des régions régulatrices ou codantes des gènes candidats chez les souches ancestrales A/J et B6, dont les séquences sont disponibles pour le génome entier. Des utilitaires web permettent de dévoiler les changements dans la structure secondaire de l’ARNm, l’interférence avec des microARN ou avec d’autres motifs de liaison. Plusieurs SNPs fonctionnels ont été identifiés pour le QTL du chr. 1, particulièrement dans les éléments de régulation; ceux-ci impliquant des gènes reliés avec les réponses inflammatoire/immunitaire ou avec le système cardiovasculaire. La quantification par la PCR confirme une régulation à la baisse d’atp1a2 dans le cœur et le cerveau des souches susceptibles à l’anxiété. Ces résultats confirment l’intrication des altérations de la susceptibilité au stress et de la régulation de la TA.

Influence du chondroïtine sulfate (CS) sur l’activité et l’expression de plusieurs isoformes du cytochrome P450 et de la NADPH P450 réductase

Le CS fait partie de la famille des SYSADOA (SYmptomatic Slow Acting Drugs for OsteoArthritis) et est utilisé par les patients avec de l’ostéoarthrose de façon chronique pour ses propriétés anti-inflammatoires. Étant donné que ces patients reçoivent d’autres médicaments, il était intéressant de documenter les effets du CS sur le cytochrome P450 et la NADPH-réductase (NADPH). Pour cette étude, deux modèles ont été utilisés: des lapins témoins (LT) et des lapins avec une réaction inflammatoire (LRI) afin de diminuer l’activité et l’expression du CYP. Six groupes contenant chacun cinq lapins ont été utilisés: un groupe sans CS et deux groupes qui ont pris oralement dans l’eau approximativement 20.5 mg/kg/jour de CS pendant 20 et 30 jours; les lapins des trois groupes restants ont pris du CS comme décrit plus haut, mais ont reçu 5 ml sous-cutanées de térébenthine afin de produire une réaction inflammatoire aseptique (RIA) deux jours avant leur sacrifice, c’est-à-dire aux jours -2, 18 et 28. Les hépatocytes ont été isolés pour évaluer l’activité et l’expression du CYP3A6, CYP1A2 et NADPH et aussi le ARNm de ces protéines. In vitro, nous avons étudié l’effet de différentes concentrations de CS-disaccharides sulfatés, 4S, 6S, et 4,6S de CS, sur l’activité et l’expression du CYP1A2 et du CYP3A6. Pour documenter la présence de la réaction inflammatoire, nous avons mesure les mucoprotéines, dans le sérum des lapins avec une réaction inflammatoire. Aussi nous avons mesuré la présence de l’oxide nitrique (NO) chez les hépatocytes de lapins contrôles et chez les hépatocytes des lapins avec une réaction inflammatoire. La translocation nucléaire du NF-κB a été etudiée par fluorescence chez les hépatocytes. Par comparaison aux lapins témoins, l’administration du CS pendant 20 et 30 jours n’affecte pas l’activité du CYP3A6 et du CYP1A2. La RIA a augmenté les mucoprotéines à 95,1±5,7 vs 8,4±1,6 mg/dl dans les lapins témoins (p<0,05). La RIA a diminué l’activité du CYP3A6 de 62% et l’activité du CYP 1A2 de 54%. Le CS n’empêché pas la diminution du CYP1A2 produite par la RIA. Par ailleurs, le CS n’affecte pas l’activité ni l’expression de la NADPH. La translocation nucléaire de NF-κB a été empêche par l’administration chronique de CS aux lapins avec RIA; en plus, la concentration de l’oxide nitrique n’a pas démontré une augmentation en présence de CS; par contre, CS n’empêche pas l’augmentation des séromucoïdes. Au contraire, CS affecte la diminution du CYP3A6 en fonction de temps et secondaire à la RIA. Dans ce group, CS a rétabli le niveau des protéines du CYP3A6 observé dans le group de lapins témoins. Pourtant cette croissance été independante de mRNA qui garde un niveau trés bas. Le plus remarcable a été la manière dont CS a augmenté la protéine du CYP3A6, sans avoir rétabli l’activité de cet isoforme. Finalement, in vitro, CS et ses trois disaccharides sulfatés (4S, 6S et 4,6S) n’affectent ni l’activité ni l’expression de CYP1A2, CYP3A6 et de la NADPH. En conclusion, l’administration chronique de CS n’affecte pas l’activité ni l’expression du CYP1A2, ou la diminution du CYP1A2 produite par la réaction inflammatoire. Le CS n’affecte pas l’activité ni l’expression du NADPH. Cependant, CS empêche la diminution du CYP3A6 en fonction de temps et secondaire à la RIA.

Evaluation du systeme nerveux autonome dans l'hypertension arterielle essentielle

L’analyse spectrale de la fréquence cardiaque, de la pression artérielle systolique, de la pression artérielle diastolique ainsi que de la respiration par la transformée de Fourier rapide, est considérée comme une technique non invasive pour la détermination de l’activité du système nerveux autonome (SNA). Dans une population de sujets normaux volontaires, nous avons obtenu à l’état basal, des oscillations de basses fréquences (0,05-0,15Hz) reliées au système nerveux sympathique autonome et des oscillations de hautes fréquences (0,2Hz) représentant sur les intervalles entre chaque ondes R de l’électrocardiogramme (RR), l’arythmie sinusale respiratoire correspondant à une activité vagale. Nous avons comparé les tests de stimulation du système nerveux sympathique autonome déclenché par le passage de la position de repos (en décubitus dorsal), à la position orthostatique volontaire et le passage de la position de repos à la position orthostatique avec la table basculante à 60o. Nous avons également comparé un groupe normotendu à un groupe hypertendu qui a été soumis au passage du repos à l’orthostation volontaire et pour lesquels nous avons évalué la sensibilité du baroréflexe et la réponse sympathique par la mesure des catécholamines circulantes. Dans un groupe de sujets ayant une hypertension artérielle essentielle, nous avons évalué l’effet de la thérapie hypotensive, par le Trandolapril qui est un Inhibiteur de l’enzyme de conversion (IEC) de l`angiotensine. Dans ce groupe hypertendu, nous avons procédé, en plus de la stimulation sympathique par l’orthostation volontaire, à un exercice isométrique de trois minutes à 30 % de la force maximale. Nous avons également complété notre évaluation par la mesure de la densité de récepteurs ß2 adrénergiques sur lymphocytes et par la mesure des indices de contractilité à l’aide de l’échocardiographie en M mode. Les résultats ont montré, dans les groupes normaux volontaires, dans les deux types de stimulation du système nerveux sympathique par la position orthostatique, une augmentation significative des catécholamines plasmatiques avec une augmentation de la fréquence cardiaque et des basses fréquences de RR, confirmant ainsi que l’on est en état de stimulation sympathique. On observe en même temps une diminution significative des hautes fréquences de RR, suggérant un retrait vagal lors de cette stimulation. On a observé au test de la table basculante six cas d’hypotension orthostatique. On a comparé la position orthostatique volontaire entre le groupe de sujets normaux et le groupe de sujets hypertendus. L’analyse spectrale croisée de RR et de la pression artérielle systolique a permis d’évaluer dans l’hypertension artérielle (HTA), essentielle une sensibilité du baroréflexe atténuée, accompagnée d’une réactivité vagale réduite en présence d’une activité et d’une réactivité sympathique augmentées suggérant une altération sympathovagale dans l’HTA. Dans le groupe de sujets hypertendus traités (Trandolapril 2mg/jour), nous avons identifié un groupe de répondeurs au traitement par le Trandolapril et un groupe de non répondeurs à ce type de thérapie anti-hypertensive. Le groupe répondeur avait un profil hyper-adrénergique avec une hyper-réactivité sympathique, une fréquence cardiaque et des pressions artérielles diastolique et systolique plus élevées au repos. Dans le groupe total traité au Trandolapril, la densité des récepteurs ß2 adrénergiques a doublé, après thérapie, alors que la réactivité des basses fréquences obtenues à l’analyse spectrale a augmenté. Nous avons montré dans notre étude qu’un IECA a pu inhiber le mécanisme facilitateur de l’angII sur les terminaisons nerveuses sympathiques et a permis ainsi de réduire l’hyperactivité sympathique et le mécanisme de « down regulation » des récepteurs ß2 adrénergiques rendant ainsi l’expression de l’influence du SNA post synaptique plus efficace. Dans l’ensemble de nos protocoles cliniques, par l’utilisation de l’analyse spectrale des signaux RR, de la pression artérielle systolique,de la pression artérielle diastolique et de la respiration, nous avons montré que cette technique non invasive permet de décrire et de mieux comprendre les mécanismes physiologiques, physiopathologiques et pharmacologiques reliés au système nerveux autonome et à l’hypertension artérielle essentielle.

The proprotein convertase PC5/6 is protective against intestinal tumorigenesis: in vivo mouse model

BACKGROUND: The secretory basic amino acid-specific proprotein convertases (PCs) have often been associated with cancer/metastasis. By controlling the cleavage of cancer-associated proteins, PCs play key roles in multiple steps of cancer development. Most analyses of the implication of PCs in cancer/metastasis relied on the use of in vitro overexpression systems or inhibitors that can affect more than one PC. Aside from the role of furin in salivary gland tumorigenesis, no other in vivo genetic model of PC-knockout was reported in relation to cancer development. RESULTS: Since PC5/6 is highly expressed in the small intestine, the present study examined its in vivo role in intestinal tumorigenesis. Analysis of human intestinal tumors at various stages showed a systematic down-regulation of PC5/6 expression. Since gene inactivation of PC5/6 leads to lethality at birth, we generated mice lacking PC5/6 in enterocytes and analyzed the impact of the presence or absence of this PC in the mouse ApcMin/+ model that develops numerous adenocarcinomas along the intestinal tract. This resulted in viable mice with almost no expression of PC5/6 in small intestine, but with no overt phenotype. The data showed that by themselves ApcMin/+ tumors express lower levels of PC5/6 mRNA, and that the lack of PC5/6 in enterocytes results in a significantly higher tumor number in the duodenum, with a similar trend in other intestinal segments. Finally, the absence of PC5/6 is also associated with a premature mortality of ApcMin/+ mice. CONCLUSION: Overall, these data suggest that intestinal PC5/6 is protective towards tumorigenesis, especially in mouse duodenum, and possibly in human colon.

Modulation du cytochrome P450 par l’insuffisance rénale chronique dans un modèle murin transgénique

L’insuffisance rénale chronique (IRC) est associée à une diminution de la clairance métabolique des médicaments résultant en partie de l’inhibition des cytochromes P450 (CYP450) et des enzymes de phase II, notamment la N-acétyltransférase 2 (NAT2), tel que démontré chez le rat. Nous avons précédemment démontré le rôle de l'hormone parathyroïdienne (PTH) dans la diminution des CYP450 hépatiques chez le rat souffrant d’IRC. Toutefois, l’étude des mécanismes sous-jacents pouvant être facilitée par l’utilisation de souris transgéniques, l’objectif de cette étude consiste à confirmer ces résultats dans un modèle murin. D’abord, afin de valider ce modèle expérimental, une IRC a été induite par néphrectomie subtotale 3/4 chez des souris C57BL/6, puis l’expression protéique et génique des CYP450 et de la Nat2 hépatiques a été étudiée. Les résultats indiquent que l’IRC induit effectivement une diminution d’expression de ces enzymes dans un modèle murin. Ensuite, des souris mutantes pour le gène codant la PTH (PTH-/-) et les souris correspondantes de type sauvage (PTH+/+) ont été néphrectomisées, puis l’expression protéique et génique des CYP450 hépatiques a été analysée. Si la PTH est responsable de la diminution du CYP450 en situation d’IRC, les souris PTH-/- atteintes d’IRC ne devraient présenter aucune baisse d’expression. Les résultats obtenus pour les souris PTH-/- ne peuvent être interprétés, puisque chez les souris PTH+/+ atteintes d'IRC, le CYP450 hépatique est inchangé par rapport aux souris PTH+/+ témoins. Des expériences supplémentaires seront requises afin de déterminer si la régulation à la baisse du CYP450 précédemment observée est contrecarrée par l’absence de PTH.

Analyse du mécanisme de la dégradation du récepteur CD4 par la protéine Vpu du virus de l'immunodéficience humaine-1 (VIH-1)

Le VIH-1 a développé plusieurs mécanismes menant à la dégradation de son récepteur cellulaire, la molécule CD4, dans le but d’augmenter la relâche de particules virales infectieuses et d’éviter que la cellule soit surinfectée. L’un de ces mécanismes est la dégradation, induite par la protéine virale Vpu, du CD4 nouvellement synthétisé au niveau du réticulum endoplasmique (RE). Vpu doit lier CD4 et recruter l’ubiquitine ligase cellulaire SCFβ-TrCP, via sa liaison à β-TrCP, afin de dégrader CD4. Puisque CD4 doit être retenu au RE pour permettre à Vpu d’induire sa dégradation via le système ubiquitine-protéasome, il a été suggéré que ce processus implique un mécanisme semblable à une voie cellulaire de dégradation des protéines mal-repliées appelée ERAD (« endoplasmic reticulum-associated degradation »). La dégradation par ERAD implique généralement la dislocation des protéines du RE vers le cytoplasme afin de permettre leur poly-ubiquitination et leur dégradation par le protéasome. Nous avons démontré que Vpu induit la poly-ubiquitination de CD4 dans des cellules humaines. Nos résultats suggèrent aussi que CD4 doit subir une dislocation afin d’être dégradé par le protéasome en présence de Vpu. De plus, un mutant transdominant négatif de l’ATPase p97, qui est impliquée dans la dislocation des substrats ERAD, inhibe complètement la dégradation de CD4 par Vpu. Enfin, nos résultats ont montré que l’ubiquitination sur des résidus accepteurs de l’ubiquitine (lysines) de la queue cytoplasmique de CD4 n’était pas essentielle, mais que la mutation des lysines ralentit le processus de dégradation de CD4. Ce résultat suggère que l’ubiquitination de la queue cytosolique de CD4 pourrait représenter un événement important dans le processus de dégradation induit par Vpu. L’attachement de l’ubiquitine a généralement lieu sur les lysines de la protéine ciblée. Toutefois, l’ubiquitination sur des résidus non-lysine (sérine, thréonine et cystéine) a aussi été démontrée. Nous avons démontré que la mutation de tous les sites potentiels d’ubiquitination cytoplasmiques de CD4 (K, C, S et T) inhibe la dégradation par Vpu. De plus, la présence de cystéines dans la queue cytoplasmique apparaît suffisante pour rendre CD4 sensible à Vpu en absence de lysine, sérine et thréonine. Afin d’expliquer ces résultats, nous proposons un modèle dans lequel l’ubiquitination de la queue cytosolique de CD4 serait nécessaire à sa dégradation et où les sites d’ubiquitination de CD4 seraient sélectionnés de façon non spécifique par l’ubiquitine ligase recrutée par Vpu. Enfin, nous avons observé que la co-expression d’une protéine Vpu incapable de recruter β-TrCP (Vpu S52,56/D) semble stabiliser le CD4 qui est retenu au RE. De plus, d’autres mutants de Vpu qui semblent capables de recruter β-TrCP et CD4 sont toutefois incapables d’induire sa dégradation. Ces résultats suggèrent que l’association de Vpu à CD4 et β-TrCP est essentielle mais pas suffisante pour induire la dégradation de CD4. Par conséquent, ces résultats soulèvent la possibilité que Vpu puisse recruter d’autres facteurs cellulaires pour induire la dégradation de CD4. Les résultats présentés ont permis de mieux définir le mécanisme de dégradation de CD4 par Vpu dans des cellules humaines. De plus, ces résultats nous ont permis d’élaborer un modèle dans lequel l’ubiquitine ligase cellulaire SCFβ-TrCP démontre de la flexibilité dans le choix des résidus à ubiquitiner afin d’induire la dégradation de CD4. Enfin, ces études jettent un oeil nouveau sur le rôle de Vpu dans ce processus puisque nos résultats suggèrent que Vpu doive recruter d’autres partenaires cellulaires, mis à part β-TrCP, pour induire la dégradation de CD4.

Caractérisation fonctionnelle de la GTPase Ran dans le cancer épithélial de l'ovaire

Le cancer épithélial de l’ovaire est le plus létal des cancers gynécologiques. Les tumeurs de l’ovaire se divisent en différentes classes reflétant l’étendue de la maladie. Les tumeurs à faible potentiel de malignité présentent une survie relative à 5 ans de 90%, alors que pour les tumeurs invasives, la survie à 5 ans chute drastiquement à 35-40%. Au laboratoire, nous avons précédemment identifié la protéine Ran, un membre de la superfamille des GTPases Ras, comme marqueur fortement exprimé dans les cancers épithéliaux de l’ovaire de haut grade et de haut stade dont la surexpression est associée à un mauvais pronostic. Ran est déjà connue pour contribuer au transport nucléocytoplasmique et à la progression du cycle cellulaire, mais son rôle dans le cancer ovarien n’est pas bien défini. En utilisant une approche de shRNA inductibles à la tétracycline basée sur les lentivirus, nous avons montré que la diminution de l’expression de Ran dans des lignées cellulaires agressives du cancer de l’ovaire affecte drastiquement la prolifération cellulaire par l’induction d’une apoptose caspase-3 dépendante. Par un essai de tumeurs en xénogreffes, nous avons démontré que la déplétion de Ran résulte en une diminution de la tumorigenèse et que la formation éventuelle de tumeurs est associée à une sélection des cellules tumorales ayant la capacité de ré-exprimer la protéine Ran. Ces résultats suggèrent un rôle critique pour Ran dans la survie et la tumorigénicité des cellules du cancer ovarien, indiquant que Ran pourrait être une cible thérapeutique intéressante.

Characterization of the mammalian homologs of the Drosophila Melanogaster Endocytic protein lethal (2) giant discs 1

Endocytose joue un rôle dans l'activation du récepteur Notch. Des mutations dans le gène drosophilien lethal giant discs (lgd), provoque une prolifération cellulaire en perturbant l'endocytose de Notch. Les orthologues murins mlgd1 et 2 peuvent sauver ce phénotype, démontrant une fonction conservée. Cependant, des publications récentes suggèrent que les orthologs humains de lgd (hgd1/2) sont nucléaires. Dans cette étude, il est démontré que chez la Drosophile, le mutant dlgd(08) provoque l'accumulation de Notch dans des vésicules et une surprolifération de neuroblastes . Ceci suggère que Notch est activé a l'intérieur des endosomes dans les neuroblastes. L'immunohistochimie de cellules Hela indique que hlgd1 et 2 ne sont pas nucléaires, mais associés à des strctures endosomales. Enfin, la baisse d'expression par shRNA des gènes murins mlgd1 et mlgd2 provoque une différenciation accélérée des cellules souches hématopoïétiques dans la lignée lymphopoïèse T et bloque la transition DN3 / CD4+CD8+, suggérant une suractivation de Notch.

The proprotein convertase PC5/6 is protective against intestinal tumorigenesis: In vivo mouse model

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Implications d'AXIN2 et de l'instabilité microsatellite dans le développement des tumeurs du cortex-surrénalien

Les lésions tumorales cortico-surrénaliennes sont majoritairement des adénomes bénins et très rarement des carcinomes. Les altérations génétiques impliquées dans le développement des tumeurs cortico-surrénaliennes sporadiques, plus particulièrement au stade malin, demeurent à ce jour très peu connues. Lors de travaux récents menant à l’identification d’altérations génétiques de β-CATÉNINE nous avons constaté que plusieurs tumeurs présentaient une accumulation nucléo/cytoplasmique de la protéine β-CATÉNINE sans toutefois contenir de mutations pour ce gène. Nous avons donc émis l’hypothèse que, comme pour d’autres types de cancers, d’autres composants de la voie de signalisation Wnt/β-CATÉNINE, tel qu’AXIN2, pourrait être impliqués dans le développement des tumeurs du cortex surrénalien. De plus, plusieurs aberrations dans l’expression d’AXIN2 et de β-CATÉNINE sont associées à des tumeurs présentant de l’instabilité microsatellite dans d’autres types de cancer, notamment le cancer gastrique et colorectal. Nous avons donc étudié une cohorte de 30 adénomes, 6 carcinomes, 5 AIMAH, 3 hyperplasies ACTH-dépendante et 5 PPNAD ainsi que les lignées cellulaires de carcinomes cortico-surrénaliens humains H295R et SW13. Une étude préliminaire du statut MSI a également été réalisée sur 10 tumeurs contenant une mutation pour AXIN2 et/ou β-CATÉNINE. Nous avons trouvé des mutations d’AXIN2 dans 7% des adénomes (2/30) et 17% des carcinomes (1/6) cortico-surrénaliens. L’analyse fonctionnelle des mutations par immunohistochimie, analyse western blot et analyse de RT-PCR en temps réel a révélé une diminution de l’expression d’AXIN2 associée à cette mutation. L’analyse préliminaire MSI a démontré 1 échantillon AIMAH MSI-H, c’est-à-dire instable pour le locus BAT-25 et BAT-26 et 3 autres adénomes sécrétant de l’aldostérone instables seulement pour le locus BAT-26. Ainsi, ces travaux permirent d’identifier une nouvelle altération génétique associée au développement des tumeurs du cortex surrénalien en plus de rapporter pour la première fois la présence de MSI-H dans ce type de tumeurs.

Analytical strategies for the comprehensive profiling of histone post translational modifications by mass spectrometry and implications for functional analyses

Le long bio-polymère d'ADN est condensé à l’intérieur du noyau des cellules eukaryotes à l'aide de petites protéines appelées histones. En plus de leurs fonctions condensatrices,ces histones sont également la cible de nombreuses modifications post-traductionnelles(MPT), particulièrement au niveau de leur section N-terminale. Ces modifications réversibles font partie d’un code d’histones épi-génétique transmissible qui orchestre et module dynamiquement certains événements impliquant la chromatine, tels l’activation et la désactivation de gènes ainsi que la duplication et la réparation d’ADN. Ces modifications sont impliquées subséquemment dans la signalisation et la progression de cancers, tels que la leucémie. En conséquence, l'élucidation des modifications d’histones est importante pour comprendre leurs fonctions biologiques. Une méthodologie analytique a été mise au point en laboratoire pour isoler, détecter, et quantifier les MPT d’histones en utilisant une approche rapide à deux volets à l’aide d’outils bioinformatiques spécialisés. La méthodologie développée en laboratoire a été validée en utilisant des histones de souche sauvage ainsi que deux types d’histones mutants déficients en enzymes acétyltransferase. Des trois sources d’histones utilisées, la seule MPT qui a démontré un changement significatif est l’acétylation de l’histone H3 à lysine 56 (H3K56ac). L’expression et la stoechiométrie de cette MPT, issue de cellules de souche sauvage et de cellules mutantes, ont été déterminées avec précision et comparées. Les fonctions de balayage polyvalentes d'un instrument à trappe ionique quadrupôle linéaire hybride ont été utilisées pour améliorer la détection de protéines intactes. Le mode de balayage « enhanced multiply charged » (EMC) a été modifié pour contenir et détecter les ions de protéines intactes situées dans la trappe ionique linéaire. Ce mode de balayage nommé « targeted EMC » (tEMC) a permis de quadrupler le niveau de sensibilité (signal/interférence), et quintupler la résolution du mode de balayage conventionnel. De plus, la capacité de séparation des charges du tEMC a réduit de façon significative les effets de « space charge » dans la trappe ionique linéaire. La résolution supérieure du mode tEMC a permis de différencier plusieurs isoformes modifiées, particulièrement pour l’histone H3. L’analyse des peptides d’histones trypsiques à l’aide du mode de balayage « MRM » a permis le séquençage et la quantification de MPT avec un haut degré de précision. La seule MPT qui était sous-exprimée entre l’histone de souche sauvage et le mutant DOT1L fut la méthylation de l’histone H3 lysine 79(H3K79me1). Les effets de deux inhibiteurs d’enzymes HDAC (HDACi) sur l’expression de MPT d’histone ont été évalués en utilisant la méthodologie analytique mentionnée. Les histones extraites de cellules normales et cancéreuses ont été exposées à du Vorinostat(SAHA) ou du Entinostat (MS-275) pour une période de 24 à 72 heures. Deux histones furent principalement affectées, soit H3 et H4. Étonnamment, les mêmes effets n'ont pas été détectés lorsque les cellules normales ont été traitées avec le HDACi pour une période de 48 à 72 heures. Une méthode absolue de quantification avec une courbe d’étalonnage a été développée pour le peptide H3K56ac. Contrairement à certaines publications, nos résultats démontrent que cette MPT est présente dans les cellules mammifères avec une stoechiométrie très basse (< 0,1%) et n'est pas surexprimée de façon significative après le traitement au HDACi.

Effect of mindfulness meditation on the neural substrates of emotion processing and resting state in experienced and beginner meditators

La méditation par le ‘mindfulness’ favorise la stabilité émotionelle, mais les mécanismes neuroneux qui sous-tendent ces effets sont peu connus. Ce projet investiga l’effet du ‘mindfulness’ sur les réponses cérébrales et subjectives à des images négatives, positives et neutres chez des méditants expérimentés et des débutants au moyen de l’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf). Le ‘mindfulness’ atténua l’intensité émotionelle via différents mécanismes cérébraux pour chaque groupe. Comparés aux méditants, les débutants manifestèrent une déactivation de l’amygdale en réponse aux stimuli émotifs durant le ‘mindfulness’. Comparés aux débutants, les méditants exhibèrent une déactivation de régions du réseau du mode par défaut (RMD) pendant le ‘mindfulness’ pour tous stimuli (cortex médian préfrontal [CMP], cortex cingulaire postérieur [CCP]). Le RMD est constitué de régions fonctionnellement connectées, activées au repos et déactivées lors de tâches explicites. Cependant, nous ne connaissons pas les impacts de l’entraînement par la méditation sur la connectivité entre régions du RMD et si ces effets persistent au-delà d’un état méditatif. La connectivité fonctionnelle entre régions du RMD chez les méditants et débutants au repos fut investiguée au moyen de l’IRMf. Comparés aux débutants, les méditants montrèrent une connectivité affaiblie entre subdivisions du CMP, et une connectivité accrue entre le lobule pariétal inférieur et trois regions du RMD. Ces résultats reflètent que les bienfaits immédiats du ‘mindfulness’ sur la psychopathologie pourraient être dûs à une déactivation de régions limbiques impliquées dans la réactivité émotionelle. De plus, les bienfaits à long-terme de la méditation sur la stabilité émotionelle pourrait être dûs à une déactivation de régions corticales et cingulaires impliquées dans l’évaluation de la signification émotive et une connectivité altérée entre régions du RMD à l’état de repos.

Assessing the Activity of Agonistic Autoantibodies in Systemic Sclerosis and their Effects on Cultured Vascular Smooth Muscle Cells

La sclérose systémique (ScS) est une maladie auto-immune dévastatrice d'étiologie inconnue. Le dysfonctionnement immunitaire, la fibrose et la vasculopathie sont les trois principales caractéristiques de cette maladie. Une récente étude a révélé un nouveau lien entre l'auto-immunité et la fibrose, par la présence d'auto-anticorps stimulant le récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFR) des fibroblastes. Ces auto-anticorps sont capables de stimuler les espèces réactives de l'oxygène et d’activer la kinase régulée par un signal extracellulaire (ERK1/2). L’hypothèse que nous formulons est que les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMCs) exprimant conjointement les PDGFR, répondront elles aussi aux autoanticorps anti-PDGF-R. Le travail présenté ici vise à valider la présence d'auto-anticorps PDGFR dans les sérums de patients ScS, et à caractériser ensuite la réponse de VSMCs exposées à de l'immunoglobuline G (IgG) de ces sérums, en mesurant l’activation des cascades de signalisation spécifiques, ainsi que l'induction des gènes impliqués dans la réponse fibrotique. Nos résultats démontrent la présence d'une fraction IgG stimulant une réponse phénotypique dans les cultures de VSMCs. Notamment, d’importantes régulations positive et négative des gènes pro-fibrotiques tgfb1 et tgfb2 respectivement, ont été observées dans les VSMCs exposées à des fractions de ScS-IgG. Les fractions de IgG positives pour l'activation de ERK étaient présentes dans la plupart, mais pas dans tous les échantillons de SSc (68%, 19/28), et moins présentes dans les contrôles 27% (11/3). Bien que, les fractions de SSc-IgG ont pu considérablement immunoprécipiter le PDGFR, l'utilisation d'un inhibiteur spécifique des récepteurs au PDGF (AG1296), n'a pas inhibé l'activation de ERK médiée par les fractions de SSc-IgG. Globalement, nos résultats indiquent la présence d'autoanticorps stimulants avec activité pro-fibrotique dans les sérums des patients ScS. Des travaux sont en cours pour identifier l'entité moléculaire responsable de la réponse d’IgG observée dans les cultures de VSMCs.