Métastases osseuses : bonnes pratiques éthiques et cliniques en physiothérapie

Travail d'intégration présenté à la Faculté de médecine en vue de l’obtention de la maîtrise en physiothérapie

Prise en charge clinique en physiothérapie oncologique: promotion d’une décision partagée dans le contexte des soins palliatifs

Article

Evaluating DNA damage response (DDR) activation in human prostate cancer

Introduction: Au Canada, le cancer de la prostate est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez les hommes et le plus mortel après les cancers du poumon et du côlon. Il y a place à optimiser le traitement du cancer de la prostate de manière à mettre en œuvre une médecine personnalisée qui s’adapte aux caractéristiques de la maladie de chaque patient de façon individuelle. Dans ce mémoire, nous avons évalué la réponse aux dommages de l’ADN (RDA) comme biomarqueur potentiel du cancer de la prostate. Les lésions potentiellement oncogènes de l'ADN déclenche une cascade de signalisation favorisant la réparation de l'ADN et l’activation des points de contrôle du cycle cellulaire pour préserver l’intégrité du génome. La RDA est un mécanisme central de suppression tumorale chez l’homme. La RDA joue un rôle important dans l’arrêt de la prolifération des cellules dont les génomes sont compromis, et donc, prévient la progression du cancer en agissant comme une barrière. Cette réponse cellulaire détermine également comment les cellules normales et cancéreuses réagissent aux agents utilisés pour endommager l'ADN lors du traitement du cancer comme la radiothérapie ou la chimiothérapie, en plus la présence d,un certain niveau de RDA dans les cellules du cancer de la prostate peuvent également influer sur l'issue de ces traitements. L’activation des signaux de la RDA peut agir comme un frein au cancer dans plusieurs lésions pré-néoplasiques de l'homme, y compris le cancer de la prostate. Il a été démontré que la RDA est augmentée dans les cellules de néoplasie intra- épithéliale (PIN) comparativement aux cellules prostatiques normales. Toutefois, le devient de la RDA entre le PIN et l’adénocarcinome est encore mal documenté et aucune corrélation n'a été réalisée avec les données cliniques des patients. Notre hypothèse est que les niveaux d’activation de la RDA seront variables selon les différents grades et agressivité du cancer de la prostate. Ces niveaux pourront être corrélés et possiblement prédire les réponses cliniques aux traitements des patients et aider à définir une stratégie plus efficace et de nouveaux biomarqueurs pour prédire les résultats du traitement et personnaliser les traitements en conséquence. Nos objectifs sont de caractériser l'activation de la RDA dans le carcinome de la prostate et corréler ses données avec les résultats cliniques. Méthodes : Nous avons utilisé des micro-étalages de tissus (tissue microarrays- TMAs) de 300 patients ayant subi une prostatectomie radicale pour un cancer de la prostate et déterminé le niveau d’expression de protéines de RDA dans le compartiment stromal et épithélial des tissus normaux et cancéreux. Les niveaux d’expression de 53BP1, p-H2AX, p65 et p-CHK2 ont été quantifiés par immunofluorescence (IF) et par un logiciel automatisé. Ces marqueurs de RDA ont d’abord été validés sur des TMAs-cellule constitués de cellules de fibroblastes normales ou irradiées (pour induire une activation du RDA). Les données ont été quantifiées à l'aide de couches binaires couramment utilisées pour classer les pixels d'une image pour que l’analyse se fasse de manière indépendante permettant la détection de plusieurs régions morphologiques tels que le noyau, l'épithélium et le stroma. Des opérations arithmétiques ont ensuite été réalisées pour obtenir des valeurs correspondant à l'activation de la RDA qui ont ensuite été corrélées à la récidive biochimique et l'apparition de métastases osseuses. Résultats : De faibles niveaux d'expression de la protéine p65 dans le compartiment nucléaire épithélial du tissu normal de la prostate sont associés à un faible risque de récidive biochimique. Par ailleurs, nous avons aussi observé que de faibles niveaux d'expression de la protéine 53BP1 dans le compartiment nucléaire épithéliale du tissu prostatique normal et cancéreux ont été associés à une plus faible incidence de métastases osseuses. Conclusion: Ces résultats confirment que p65 a une valeur pronostique chez les patients présentant un adénocarcinome de la prostate. Ces résultats suggèrent également que le marqueur 53BP1 peut aussi avoir une valeur pronostique chez les patients avec le cancer de la prostate. La validation d'autres marqueurs de RDA pourront également être corrélés aux résultats cliniques. De plus, avec un suivi des patients plus long, il se peut que ces résultats se traduisent par une corrélation avec la survie. Les niveaux d'activité de la RDA pourront éventuellement être utilisés en clinique dans le cadre du profil du patient comme le sont actuellement l’antigène prostatique spécifique (APS) ou le Gleason afin de personnaliser le traitement.

Biomarqueurs pronostiques dans le cancer de la prostate : mieux prédire pour mieux traiter

Le cancer de la prostate (CP) est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué en Amérique du Nord et est au troisième rang en termes de létalité chez les hommes. Suite aux traitements de première ligne, 20 à 30% des patients diagnostiqués avec un cancer localisé auront une récidive biochimique de la maladie. La déplétion androgénique mène fréquemment au développement du stade de résistance à la castration (RC). Ce dernier est associé avec une augmentation de la morbidité (métastases osseuses) et de la mortalité avec une survie moyenne inférieure à deux ans. L’évolution du CP est très hétérogène dans la population et il n’existe actuellement aucun biomarqueur pronostique permettant d’identifier les patients à risque de récurrence biochimique, de métastases osseuses et de développement d’une résistance à la castration. De nombreuses études ont démontré que les cytokines inflammatoires IL-6 et IL-8 jouent un rôle dans la pathogénèse du CP, notamment dans le développement de la résistance à la castration. Par ailleurs, les niveaux sériques élevés de ces cytokines ont été associés à un mauvais pronostic. Précédemment, notre laboratoire a démontré in vitro que la protéine IKKε entraîne une augmentation de la sécrétion de ces cytokines dans les cellules du CP et qu’elle est exprimée davantage dans les tissus de cancers plus avancés. Le premier objectif du présent mémoire fut d’évaluer dans des tissus humains la corrélation d’IKKε, IL-6 et IL-8 avec des paramètres cliniques. Nos résultats soulignent le potentiel d’IKKε comme biomarqueur tissulaire pronostique de récurrence biochimique et de métastases osseuses. Nous n’avons trouvé aucune association entre IL-6/IL-8 et les paramètres cliniques inclus dans l’étude. Le second objectif de ce projet fut d’évaluer la coexpression de ces trois molécules dans l’épithélium du CP. Nos résultats confirment les observations in vitro en mettant en évidence une forte association entre l’expression d’IKKε, IL-6 et IL-8. Le troisième objectif fut d’évaluer la relation entre les niveaux sériques et tissulaires d’IL-6 et d’IL-8. Aucune relation significative n’a été établie, suggérant que les cytokines sériques ne sont pas uniquement d’origine prostatique. En conclusion, mon projet de maîtrise aura permis de préciser le potentiel d’IKKε comme biomarqueur tissulaire pronostique et de valider pour la première fois dans des tissus humains sa co-expression avec les cytokines IL-6 et IL-8, dont le rôle dans la pathogénèse de la maladie est bien établi. Une étude plus exhaustive des voies de signalisation d’IKKε reste d’intérêt pour élucider notamment les mécanismes par lesquels IKKε stimule la production de cytokines et par quels moyens cette protéine pourrait être impliquée dans le développement d’un état résistant à la castration.

Détection moléculaire des métastases des ganglions lymphatique dans le cancer du col de l'utérus

Le Cancer du Col Utérin (CCU) chez la femme est provoqué par le virus oncogénique VPH. La métastase lymphatique ganglionnaire est un facteur pronostique majeur pour l’évolution de ce cancer et sa présence influence la décision thérapeutique. En général, l’envahissement ganglionnaire est diagnostiqué par histologie, mais cette méthode est laborieuse et parfois prise en défaut pour détecter les micrométastases et les cellules cancéreuses isolées et pour donner des résultats rapides en per opératoire. L’outil moléculaire que nous désirons développer pour combler cette lacune est basé sur une analyse d’ARN des gènes du VPH exprimés par les cellules du CCU. Ceci sera fait par transcription réverse de l’ARN cellulaire couplé à une réaction quantitative en chaine par polymérase en temps réel (RT-qPCR). Cette technique devrait nous permettre une détection et une évaluation rapide des micrométastases pour aider à déterminer immédiatement un pronostic fiable et la thérapie associée. C’est un test précis, sensible et rapide pour détecter un envahissement ganglionnaire dans le CCU visant à améliorer la gestion thérapeutique. Le projet est basé sur trois objectifs. En premier lieu, valider les marqueurs moléculaires E6 et E7 de VPH16 et 18 à partir des échantillons frais et des échantillons fixés dans des blocs de paraffine. En deuxième lieu, déterminer la fiabilité et la sensibilité des marqueurs pour la détection des macrométastases, des micrométastases et les cellules tumorales isolées en utilisant la technique de RT-qPCR. En troisième lieu et parallèlement au travail présenté dans ce mémoire, il est nécessaire de constituer une base de données des patientes qui ont le virus VPH16 et 18 intégré dans leur génome, qui ont été traitées et dont nous connaissons déjà le diagnostic final afin de valider la méthode (biobanque). Nous avons réussi à extraire de l’ARNm de haute qualité à partir d’échantillons complexes, à détecter les gènes E6 et E7 de VPH16 et 18 en RT-qPCR, et à déterminer précisément la limite de détection de E6 et E7 dans les échantillons frais qui est une proportion de 0,008% de cellules cancéreuses. Dans les échantillons fixés dans la paraffine, cette limite est de 0,02% et 0,05% pour E6-E7-VPH16 et E6-E7-VPH18 respectivement. Ceci comparativement à une limite de détection histologique de 1% qui est déterminée par immunohistochimie de CK19. Enfin, notre protocole est validé pour VPH18 dans les ganglions lymphatiques du CCU.

L’effet des différents facteurs de croissance sur la viabilité et la prolifération des ostéoblastes scoliotiques

Résumé: La Scoliose Idiopathique de l’Adolescent (SIA) est une condition débilitante qui peut avoir comme résultat une douleur importante, une altération du fonctionnement quotidien et une détérioration de la qualité de vie. Pour les patients qui ne répondent pas au traitement conservateur, la fusion vertébrale, en utilisant des greffes osseuses, est devenue un traitement de choix pour stabiliser la colonne. Des connaissances plus pointues à propos des facteurs impliqués dans l’ostéogénèse et la formation de l’os peuvent raccourcir le processus de guérison et permettre aux patients de réintégrer leurs activités dans un laps de temps plus court. Les plaquettes peuvent jouer un rôle important dans la première étape de la guérison des fractures car elles sont une source autologue de plusieurs facteurs de croissance qui soutiennent la prolifération et la différenciation des ostéoblastes in vivo et in vitro. Au cours des dernières années, plusieurs tentatives ont été réalisées afin de trouver des traitements additionnels pour : 1) Raccourcir le temps de guérison des fractures relativement long ; 2) Obtenir une plus courte période de convalescence pour les patients qui ont besoin de prothèses ; 3) Corriger plus facilement plusieurs maladies congénitales; 4) Améliorer le processus de fusion vertébrale et 5) Développer de nouvelles approches thérapeutiques, notamment au niveau des processus régularisant le remodelage osseux et la régénération des tissus osseux. Dans le cadre de la présente étude, j’ai étudié la contribution possible du facteur de croissance de l’insuline (IGF) et du facteur vasculaire endothélial de croissance (VEGF) sur la maturation de l’ostéoblaste scoliotique dans des cultures cellulaires in vitro et j’ai comparé les résultats avec celles obtenues dans les mêmes conditions mais en stimulant les ostéoblastes avec de la mélatonine. Cette étude préliminaire a été réalisée sur des échantillons d’os récoltés de quatre patients atteints par la Scoliose Idiopathique de l‘Adolescent (SIA), ainsi que sur des échantillons d’os issus de quatre sujets témoins (cas traumatiques). Les résultats montrent que l’IGFs et le VEGFs possèdent une action d’inhibition sur la prolifération d’ostéoblastes scoliotiques et non scoliotiques, et que cette action est proportionnelle à la concentration de ces facteurs. Les ostéoblastes scoliotiques tendent à avoir une prolifération cellulaire plus rapide et plus élevée que les témoins non scoliotiques. De façon générale les ostéoblastes provenant de patients scoliotiques ont une ostéogénèse in vitro plus accélérée que le sujet non scoliotique. De plus, il semble que la mélatonine joue un rôle physiologique dans la différenciation de l’ostéoblaste scoliotique et elle semble aider à avoir une différenciation plus précoce que chez les non traités. Les ostéoblastes scoliotiques expriment un défaut d’expression de l’IGF 1 et d’IGF 1R en présence de la mélatonine. En conclusion, le VEGF A et l’IGF 1 peuvent également promouvoir la différenciation et la prolifération des ostéoblastes humains scoliotiques en culture primaire.

Étude de l'activité anti-cancéreuse du PCK3145, un peptide dérivé de PSP-94, sur les cancers hématologiques

Le PCK3145 est un peptide de 15 acides aminés inhibant la sécrétion de MMP-9 et démontrant une activité anti-tumorale contre le cancer de la prostate. Comme les cancers hématologiques sécrètent MMP-9, nous avons donc évalué l’effet du PCK3145 sur ces cancers. Nous avons démontré que les lignées humaines de lymphome non- Hodgkinien (LNH) SR et de myélome multiple RPMI-8226 ainsi que la lignée murine de mastocytome P815 ont une prolifération réduite suite à une exposition au PCK3145. Ce peptide diminue également la clonogénicité de ces cellules. In vivo, le PCK3145 diminue significativement la croissance des tumeurs sous-cutanées P815 comparativement au PBS (p<0.001) et aux peptides contrôles (« scrambled peptide » (p<0.05) et PCK5266 (p<0.01)). De plus, le traitement au PCK3145 diminue le nombre de métastases au niveau du foie par rapports aux contrôles (p<0.05). Les niveaux de MMP-9 dans le sang des souris traitées au PCK3145 sont similaires à ceux dans le sang des souris sans tumeur. Par contre, chez les souris recevant le PBS ou le « scrambled peptide », les niveaux de MMP-9 étaient significativement plus élevés que dans les souris sans tumeur et les souris traitées au PCK3145 (p<0.05). De surcroît, dans un modèle de xénogreffe, le PCK3145 diminue significativement la croissance des lymphomes SR par rapport au PBS (p<0.01) et au « scrambled peptide » (p<0.001). Ces résultats indiquent que le PCK3145 possède une activité anti-tumorale et pourrait représenter un agent intéressant pour le traitement de plusieurs cancers hématologiques.

Implication de l'endosome de recyclage dans la migration cellulaire in vivo

Au cours de l’ovogenèse chez la mouche du vinaigre: Drosophila melanogaster, un groupe de cellules folliculaires appelées cellules de bord, migrent à travers les cellules nourricières pour atteindre l’ovocyte. Cet événement, nécessitant la transition épithélio- mésenchymateuse (TEM), la réorientation, puis l’arrêt, ressemble à la formation de métastases. L’endocytose est un régulateur clé de plusieurs événements polarisés, y compris la migration cellulaire. En effet, différentes protéines impliquées dans la migration, comme les intégrines et les E-cadhérines (cadhérines épithéliales), sont régulées par transport à travers les endosomes. De même, l’endocytose restreint au front de migration l’activité des récepteurs tyrosine kinases (RTKs) qui guident les cellules de bord dans leur mouvement. Cependant les mécanismes moléculaires de cette restriction spatiale de l’activité des RTKs demeurent largement inconnus. Nous avons testé l’implication du trafic vésiculaire à travers la machinerie d’endocytose, dans la migration dirigée des cellules de bord, car ce système est facilement accessible pour l’expression de protéines et l’analyse de mutants. Nous avons commencé par confirmer une observation précédente du rôle de l’endosome précoce dans la migration des cellules de bord. Ensuite, nous avons identifié l’endosome de recyclage (ER) comme un régulateur clé de cette migration. En effet, nous avons démontré que l’expression dans les cellules de bord d’une forme dominante négative de Rab11, la petite GTPase régulant le transport vésiculaire à travers l’ER, bloque la migration ou entraîne de sévères défauts de migration dans environ 80% des chambres d’œufs examinées. De plus, nous observons par immunofluorescence une relocalisation de l’activité des RTKs alors que d’autres protéines de migration ne sont pas affectées par Rab11 dominant négatif. Ce résultat a été par la suite confirmé par une interaction génétique entre Rab11 et les RTKs. D’autre part, nous avons montré que le complexe exocyste, un effecteur de Rab11, est impliqué dans la migration des cellules de bord. Nous avons trouvé par microscopie confocale en tissu fixé et par microscopie en temps réel que Sec15, un composant de ce complexe, est polarisé, de façon Rab11- dépendante, dans des vésicules qui s’accumulent au front de migration tout au long du mouvement des cellules de bord. De plus, la perte de l’activité de Sec15 perturbe à son tour la migration. Ainsi, toutes ces données démontrent le rôle fondamental d’un cycle d’endo- exocytose dans le maintien des RTKs actifs au niveau du front de migration des cellules de bord le long de leur mouvement.

Caractérisation du potentiel métastatique des carcinomes mammaires de phénotype basal

Au Canada, on estime qu'une femme sur neuf développera un cancer du sein et qu'une femme sur vingt-huit en mourra. Les carcinomes mammaires de phénotype basal qui comprennent environ 15 à 25% des cancers envahissants du sein sont des tumeurs malignes ayant un très mauvais pronostic. Dans ce type tumoral, les métastases sont fréquentes et les décès nombreux. La formation des métastases est un processus complexe qui comprend plusieurs étapes; chacune peut être étudiée par des marqueurs spécifiques. Notre hypothèse de recherche est que le carcinome mammaire de phénotype basal possède des caractéristiques spécifiques qui permettent d'expliquer son potentiel métastatique élevé. Six micromatrices tissulaires comprenant un total de 213 tumeurs mammaires ont été confectionnées. L'expression des marqueurs usuels de la métastase et celle de nouveaux marqueurs a été étudiée par des techniques d'immunohistochimie. L'étude comparative de l’expression des marqueurs du potentiel métastatique par les carcinomes mammaires de phénotype basal indique que les protéines Ki-67, EGFR, CD276 et galectine-7 sont étroitement reliées à ce type de cancer. De plus, l'expression du marqueur GATA-3, un marqueur anti-métastatique, fait complètement défaut. Nos résultats confirment que le cancer du sein de phénotype basal possède un plus grand potentiel métastatique que les autres sous-types génétiques et suggèrent que la galectine-7 puisse être impliquée.

Étude du rôle de l'adaptateur Nck2 dans la progression métastatique du mélanome humain

La dissémination métastatique est associée à de faibles chances de survie dans les cas de mélanomes humains, comme pour d’autres cancers. Le développement de métastases est un processus qui se fait en plusieurs étapes et nécessite la réorganisation du cytosquelette d’actine pour permettre la migration et l’invasion cellulaire. La protéine Nck2 est un adaptateur protéique principalement impliqué dans la réorganisation du cytosquelette. Une étude préliminaire réalisée dans notre laboratoire avait révélé que les niveaux de la protéine Nck2 et de son ARNm sont augmentés dans les lignées de mélanome métastatiques en comparaison aux lignées primaires. Le but de la présente recherche était donc d’étudier le rôle de l’adaptateur Nck2 dans la progression métastatique. Les résultats obtenus confirment que l’expression de Nck2 augmente de façon marquée au cours de la progression métastatique du mélanome humain. Cette étude révèle en plus que l’expression de hauts niveaux de Nck2 dans les cellules de mélanome primaire stimule la prolifération cellulaire et la migration, n’affecte pas l’invasion d’une matrice de collagène de type I, mais semble affaiblir les contacts cellule-cellule et l’adhésion au substrat. Une étude préliminaire effectuée in vivo révèle que ces phénomènes se traduisent par une légère augmentation de la tumorigenèse et de la croissance tumorale. Dans l’ensemble, les résultats obtenus suggèrent que Nck2 pourrait effectivement jouer un rôle dans la progression métastatique du mélanome en favorisant la prolifération des cellules tumorales et en facilitant leur détachement de la tumeur primaire, les rendant plus aptes à se disperser dans l’organisme et à établir des colonies métastatiques. Au niveau moléculaire, nous proposons que Nck2 est recruté dans les invadopodes pour favoriser la formation de complexes protéiques qui stimulent l’invasion. La mobilisation de Nck2 dans ces structures membranaires diminuerait sa disponibilité pour l’établissent d’autres complexes protéiques, entre autres dans les complexes d’adhésion focaux (FAs) et dans les jonctions adhérentes, diminuant ainsi les contacts des cellules cancéreuses avec la matrice extracellulaire et les cellules avoisinantes.

Évaluation des désordres cardiovasculaires chez des souris bêta-thalassémiques

L’hémoglobine est une protéine contenue dans les globules rouges dont la principale fonction est le transport de l’oxygène. Chaque molécule d’hémoglobine est un tétramère constitué de deux paires de globines identiques de type α et β. La β-thalassémie est une maladie génétique hématopoïétique provenant de mutations du gène encodant l'hémoglobine. Ce désordre se caractérise par une diminution ou une absence totale de la synthèse de la chaîne β-globine résultant principalement en une anémie hémolytique sévère ainsi que des complications multisystémiques, telles que la splénomégalie, des déformations osseuses et une dysfonction hépatique et rénale. Actuellement, les transfusions sanguines chroniques représentent le traitement standard des patients β-thalassémiques. Cette thérapie nécessite l’administration conjointe d’un traitement chélateur de fer puisqu’elle entraîne une accumulation pathologique du fer, considéré à ce jour comme la source principale des complications cardiovasculaires de la β-thalassémie. Néanmoins, malgré le traitement efficace de la surcharge de fer transfusionnelle, l’insuffisance cardiaque demeure encore la principale cause de mortalité chez les patients atteints de β-thalassémie. Cette observation indique possiblement la présence d’un mécanisme complémentaire dans le développement de la physiopathologie cardiaque β-thalassémique. L’objectif du présent projet consistait donc à étudier les altérations cardiovasculaires de la β-thalassémie indépendamment de la surcharge de fer transfusionnelle. En utilisant un modèle murin non-transfusé de la β-thalassémie majeure, nous avons d’abord évalué in vivo, par méthode d’imagerie novatrice échographique à haute fréquence, les propriétés hémodynamiques vasculaires. Nos résultats d’index de Pourcelot ainsi que de résistance vasculaire périphérique totale ont démontré une perturbation de l’écoulement microcirculatoire chez les souris β-thalassémiques non-transfusées. Subséquemment, nous avons étudié la fonction endothéliale de régulation du tonus vasculaire de vaisseaux mésentériques isolés. Nos résultats ont révélé un dysfonctionnement de la réponse vasodilatatrice dépendante de l’endothélium chez les souris β-thalassémiques malgré une augmentation de l’expression de l’enzyme de synthèse du monoxyde d’azote ainsi qu’un remodelage de la carotide commune caractérisé par un épaississement de la paroi vasculaire. Finalement, notre étude échocardiographique de la fonction et la morphologie cardiaque a montré, chez les souris β-thalassémiques, le développement d’une hypertrophie et une dysfonction ventriculaire gauche en l’absence de transfusions sanguines chroniques ou de dépôts directs de fer dans le myocarde. L’ensemble des résultats présentés dans le cadre de cette thèse indique la présence d’une pathologie cardiovasculaire chez les souris β-thalassémiques non-transfusés. Nos travaux permettent de proposer un mécanisme de la pathophysiologie cardiovasculaire β-thalassémique, indépendant de la charge de fer transfusionnelle, impliquant les effets compensatoires d’une anémie chronique combinés à une vasculopathie complexe initiée par les érythrocytes endommagés et l’hémolyse intravasculaire.

Rôle du monoxyde d'azote dans la calcification vasculaire et la rigidité artérielle dans un modèle d'hypertension systolique isolée

L’hypertension systolique isolée (HSI) est le résultat de changements au niveau de la paroi vasculaire qui ont pour conséquence d’augmenter la rigidité artérielle. Ces modifications surviennent surtout au niveau des grosses artères comme l’aorte et sont associées au vieillissement. La fragmentation des fibres élastiques, leur calcification (élastocalcinose) et la fibrose font partie des changements majeurs observés avec l’âge. En plus de ces changements, le vieillissement vasculaire provoque des modifications au niveau des cellules qui composent la paroi. Les cellules endothéliales sécrètent moins de monoxyde d’azote (NO) provoquant une dysfonction endothéliale et les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLVs) synthétisent maintenant des protéines matricielles et osseuses. Situé entre le sang et les CMLVs, l’endothélium contrôle le tonus vasculaire par la sécrétion de plusieurs substances vasoactives qui interagissent entre elles afin de maintenir l’homéostasie du système vasculaire. Parmi celles-ci, on note l’endothéline (ET), un puissant vasoconstricteur et le NO, un gaz vasorelaxants. Ce dernier est aussi reconnu pour bloquer la production d’ET par un mécanisme dépendant du guanosine monophosphate cyclique (GMPc). Comme il y a une interaction entre le NO et l’ET, et que cette dernière est impliquée dans la calcification artérielle, le NO pourrait être impliqué dans la modulation de l’élastocalcinose et de la rigidité artérielle par l’inhibition de l’ET et la modification de la composition de la paroi. Cet effet, qui se produirait au delà des effets vasorelaxants du NO, offre un potentiel thérapeutique intéressant pour l’HSI. Afin d’évaluer l’implication du NO dans la calcification vasculaire et la rigidité artérielle, un modèle animal d’HSI a été utilisé (modèle warfarine vitamine K, WVK). Ce modèle d’élastocalcinose est basé sur l’inhibition de la maturation d’une protéine anti-calcifiante, la matrix Gla protein (MGP), par la warfarine. Afin de déterminer l’implication physiologique du NO dans l’initiation et la progression de l’élastocalcinose, sa production a été inhibée par un analogue de la L-arginine, le L-NG-nitroarginine methyl ester (L-NAME). Lors des processus d’initiation de la calcification, le L-NAME a prévenu l’élastocalcinose sans toutefois modifier la vitesse de l’onde de pouls (PWV). Suite au traitement L-NAME, l’expression de la NO synthase inductible (iNOS) a été diminuée alors qu’elle a été augmentée lors du traitement WVK. Elle pourrait donc être impliquée dans les processus de calcification vasculaire. De plus, la NO synthase endothéliale (eNOS) semble également impliquée puisqu’elle a été augmentée dans le modèle WVK. Cette hausse pourrait être bénéfique pour limiter l’élastocalcinose alors que l’expression de la iNOS serait délétère. Lors de la progression de la calcification, le L-NAME a augmenté l’élastocalcinose et le PWV. Dans ce contexte, l’ET serait impliquée dans l’amplification de la calcification vasculaire entrainant une hausse de la rigidité artérielle. Comme le NO endogène limite la progression de la calcification et conséquemment la rigidité artérielle, il semble être protecteur. L’efficacité d’une modulation de la voie du NO dans le modèle WVK a été étudiée par l’administration d’un donneur de NO, le sinitrodil, ou d’un inhibiteur de la phosphosdiestérase 5 (PDE5), le tadalafil. La modulation de la voie du NO semble être bénéfique sur la rigidité artérielle, mais seulement de façon aiguë. En effet, le sinitrodil a modifié de transitoirement la rigidité au niveau de l’aorte possiblement par la modulation du tonus vasculaire sans toutefois avoir des effets sur la composition de la paroi. Comme le modèle WVK n’affecte pas la fonction endothéliale, les concentrations endogènes de NO semblent être optimales puisque le sinitrodil provoque une augmentation de l’élastocalcinose possiblement par le développement d’une tolérance. Tout comme le sinitrodil, le tadalafil a modulé de manière aiguë la rigidité artérielle sans modifier la composition de la paroi. Globalement, ces travaux ont permis de mettre en évidence les effets bénéfiques du NO endogène pour limiter le développement de l’HSI, suggérant qu’une dysfonction endothéliale, tel qu’observé lors du vieillissement, a un impact négatif sur la maladie.

Structure quaternaire des récepteurs de chimiokines CXCR4 et CCR2 et interaction avec leurs effecteurs

Thèse réalisée en cotutelle avec l'université Montpellier2 dans le laboratoire de pharmacologie moléculaire de Jean-Philippe Pin à l'institut de génomique fonctionnelle (IGF), Montpellier, France.

Rôle de la synthèse de l'acide rétinoïque dans le contrôle de la prolifération et de la différenciation des cellules épithéliales mammaires

L’acide rétinoïque (AR) est le ligand des récepteurs nucléaires RAR et RXR qui agissent comme facteurs de transcription ligand-inductibles et médient ses effets biologiques. Il est connu que l’AR a des propriétés prodifférenciatrices et antiprolifératives, notamment sur les cellules de l’épithélium mammaire. Une perte de sensibilité de l’AR a toutefois été mise en évidence dans plusieurs lignées cellulaires mammaires cancéreuses, ce qui pourrait faciliter la croissance des tumeurs. Or jusqu’ici cette perte de sensibilité avait été attribuée à des défauts de la voie de signalisation de l’AR, causée par la perte de l’expression des récepteurs à l’AR dans la tumeur, bien que plusieurs lignées de cellules cancéreuses y soient tout de même très sensibles. Peu d’études se sont intéressées au rôle de la voie de synthèse de l’AR dans la transformation des cellules mammaires. En effet, l’AR est synthétisé à partir de la vitamine A, ou rétinol, son précurseur sanguin provenant de la diète. Les cellules de l’épithélium mammaire normales ont la capacité de synthétiser l’AR à partir du rétinol. Nos rapportons pour la première fois que l’épithélium mammaire est probablement le siège de la synthèse et de la signalisation de l’AR. Cela est dû, au moins en partie, à l’expression d’une enzyme de synthèse de l’AR, RALDH3, dans l’épithélium mammaire normal. Dans cette étude, nous démontrons que les cellules cancéreuses de type luminal, qui ont sensibles à l’AR (et qui expriment le récepteur des estrogènes ER, catégorie qui regroupe 75 % des tumeurs diagnostiquées) n’ont au contraire pas la capacité de sythétiser l’AR, probablement en raison d’une faible expression de RALDH3 dans les tumeurs, sous l’effet des estrogènes. Cela pourrait représenter un nouveau mécanisme favorisant la croissance des tumeurs luminales dont les cellules proliférent en présence du rétinol sanguin. RALDH1, une autre enzyme de la voie de synthèse de l’AR, et qui partage 70 % d’identité de séquence avec RALDH3, est un marqueur de tumeurs plus agressives et de la formation de métastase. Nous montrons au contraire, que RALDH3 est un marqueur d’une moindre probabilité de développer des métastases chez les patientes atteintes d’une tumeur luminale. Cela suggère des rôles different pour ces deux enzymes dans la glande mammaire. Nos résultats indiquent que RALDH1 et 3 ont des propriétés enzymatiques très différentes, ce qui est en accord avec cette dernière hypothèse. Nos données suggèrent aussi que RALDH1 et 3 pourraient être des marqueurs de populations distinctes de cellules dans la glande mammaire normale. Nous proposons d’exploiter les diffèrences entre RALDH1 et 3 afin de mettre au point des méthodes de séparation des différentes population de cellules de l’épithélium mammaire ce qui pourrait aider à comprendre le rôle de la synthèse d’AR dans ce tissu.

Étude de la relation entre les conformations et la signalisation des 7TMRs

L’interaction d’un ligand avec un récepteur à sept domaines transmembranaires (7TMR) couplé aux protéines G, mène à l’adoption de différentes conformations par le récepteur. Ces diverses conformations pourraient expliquer l’activation différentielle des voies de signalisation. Or, le lien entre la conformation et l’activité du récepteur n’est pas tout à fait claire. Selon les modèles classiques pharmacologiques, comme le modèle du complexe ternaire, il n’existe qu’un nombre limité de conformations qu’un récepteur peut adopter. Afin d’établir un lien entre la structure et la fonction des récepteurs, nous avons choisi dans un premier temps, le récepteur de chimiokine CXCR4 comme récepteur modèle. Ce dernier, est une cible thérapeutique prometteuse, impliqué dans l’entrée du VIH-1 dans les cellules cibles et dans la dissémination de métastases cancéreuses. Grâce au transfert d’énergie par résonance de bioluminescence (BRET) nous pouvons détecter les changements conformationnels des homodimères constitutifs de CXCR4 dans les cellules vivantes. En conséquence, nous avons mesuré les conformations de mutants de CXCR4 dont les mutations affecteraient sa fonction. Nous montrons que la capacité des mutants à activer la protéine Galphai est altérée suite au traitement avec l’agoniste SDF-1. Notamment, ces mutations altèrent la conformation du récepteur à l’état basal ainsi que la réponse conformationnelle induite suite au traitement avec l’agoniste SDF-1, l’agoniste partiel AMD3100 ou l’agoniste inverse TC14012. Ainsi, différentes conformations de CXCR4 peuvent donner lieu à une activation similaire de la protéine G, ce qui implique une flexibilité des récepteurs actifs qui ne peut pas être expliquée par le modèle du complexe ternaire (Berchiche et al. 2007). Également, nous nous sommes intéressés au récepteur de chimiokine CCR2, exprimé à la surface des cellules immunitaires. Il joue un rôle important dans l’inflammation et dans des pathologies inflammatoires telles que l’asthme. CCR2 forme des homodimères constitutifs et possède différents ligands naturels dont la redondance fonctionnelle a été suggérée. Nous avons étudié le lien entre les conformations et les activations d’effecteurs (fonctions) de CCR2. Notre hypothèse est que les différents ligands naturels induisent différentes conformations du récepteur menant à différentes fonctions. Nous montrons que les réponses de CCR2 aux différents ligands ne sont pas redondantes au niveau pharmacologique et que les chimiokines CCL8, CCL7 et CCL13 (MCP-2 à MCP-4) sont des agonistes partiels de CCR2, du moins dans les systèmes que nous avons étudiés. Ainsi, l’absence de redondance fonctionnelle parmi les chimiokines liant le même récepteur, ne résulterait pas de mécanismes complexes de régulation in vivo, mais ferait partie de leurs propriétés pharmacologiques intrinsèques (Berchiche et al. 2011). Enfin, nous nous sommes intéressés au récepteur de chimiokine CXCR7. Récemment identifié, CXCR7 est le deuxième récepteur cible de la chimiokine SDF-1. Cette chimiokine a été considérée comme étant capable d’interagir uniquement avec le récepteur CXCR4. Notamment, CXCR4 et CXCR7 possèdent un patron d’expression semblable dans les tissus. Nous avons évalué l’effet de l’AMD3100, ligand synthétique de CXCR4, sur la conformation et la signalisation de CXCR7. Nos résultats montrent qu’AMD3100, tout comme SDF-1, lie CXCR7 et augmente la liaison de SDF-1 à CXCR7. Grâce au BRET, nous montrons aussi qu’AMD3100 seul est un agoniste de CXCR7 et qu’il est un modulateur allostérique positif de la liaison de SDF-1 à CXCR7. Aussi, nous montrons pour la première fois le recrutement de la beta-arrestine 2 à CXCR7 en réponse à un agoniste. L’AMD3100 est un ligand de CXCR4 et de CXCR7 avec des effets opposés, ce qui appelle à la prudence lors de l’utilisation de cette molécule pour l’étude des voies de signalisation impliquant SDF-1 (Kalatskaya et al. 2009). En conclusion, nos travaux amènent des évidences qu’il existe plusieurs conformations actives des récepteurs et appuient les modèles de structure-activité des récepteurs qui prennent en considération leur flexibilité conformationnelle.