Association between disruption of CD4 receptor dimerization and increased human immunodeficiency virus type 1 entry

Affiliation: Département de microbiologie et immunologie, Faculté de médecine, Université de Montréal & Institut de Recherches Cliniques de Montréal

Contribution of the C-terminal tri-lysine regions of human immunodeficiency virus type 1 integrase for efficient reverse transcription and viral DNA nuclear import

Affiliation: Zhujun Ao, Éric Cohen & Xiaojian Yao : Département de microbiologie et immunologie, Faculté de Médecine, Université de Montréal

Requirements for the selective degradation of CD4 receptor molecules by the human immunodeficiency virus type 1 Vpu protein in the endoplasmic reticulum.

BACKGROUND: HIV-1 Vpu targets newly synthesized CD4 receptor for rapid degradation by a process reminiscent of endoplasmic reticulum (ER)-associated protein degradation (ERAD). Vpu is thought to act as an adaptor protein, connecting CD4 to the ubiquitin (Ub)-proteasome degradative system through an interaction with beta-TrCP, a component of the SCFbeta-TrCP E3 Ub ligase complex. RESULTS: Here, we provide direct evidence indicating that Vpu promotes trans-ubiquitination of CD4 through recruitment of SCFbeta-TrCP in human cells. To examine whether Ub conjugation occurs on the cytosolic tail of CD4, we substituted all four Ub acceptor lysine residues for arginines. Replacement of cytosolic lysine residues reduced but did not prevent Vpu-mediated CD4 degradation and ubiquitination, suggesting that Vpu-mediated CD4 degradation is not entirely dependent on the ubiquitination of cytosolic lysines and as such might also involve ubiquitination of other sites. Cell fractionation studies revealed that Vpu enhanced the levels of ubiquitinated forms of CD4 detected in association with not only the ER membrane but also the cytosol. Interestingly, significant amounts of membrane-associated ubiquitinated CD4 appeared to be fully dislocated since they could be recovered following sodium carbonate salt treatment. Finally, expression of a transdominant negative mutant of the AAA ATPase Cdc48/p97 involved in the extraction of ERAD substrates from the ER membrane inhibited Vpu-mediated CD4 degradation. CONCLUSION: Taken together, these results are consistent with a model whereby HIV-1 Vpu targets CD4 for degradation by an ERAD-like process involving most likely poly-ubiquitination of the CD4 cytosolic tail by SCFbeta-TrCP prior to dislocation of receptor molecules across the ER membrane by a process that depends on the AAA ATPase Cdc48/p97.

Effect of calcium-modulating cyclophilin ligand on human immunodeficiency virus type 1 particle release and cell surface expression of Tetherin

The HIV-1 accessory protein Vpu enhances virus particle release by counteracting a host factor that retains virions at the cell surface of infected cells. It was recently demonstrated that cellular protein BST2/CD317/Tetherin restricts HIV-1 release in a Vpu-dependent manner. CAML was also proposed to be involved in this process. We investigated whether CAML is involved in Tetherin cell-surface expression. Here, we show that CAML over-expression in permissive Cos-7 cells or CAML depletion in restrictive HeLa cells has no effect on HIV-1 release nor on Tetherin surface expression, indicating that CAML is not required for Tetherin-mediated restriction of HIV-1 release.

Integrase, the central DNA flap and human immunodeficiency virus type 1 nuclear import

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Molecular and functional studies of human immunodeficiency virus type 1 accessory protein

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Manipulation of the ubiquitin-proteasome system by HIV-1 : role of the accessory protein Vpr

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1), l’agent étiologique du SIDA, est un rétrovirus complexe arborant plusieurs protéines accessoires : Nef, Vif, Vpr, et Vpu. Celles-ci sont impliquées dans la modulation de la réplication virale, dans l’évasion immunitaire et dans la progression de la pathogenèse du SIDA. Dans ce contexte, il a été démontré que la protéine virale R (Vpr) induit un arrêt de cycle cellulaire en phase G2. Le mécanisme par lequel Vpr exerce cette fonction est l’activation, ATR (Ataxia telangiectasia and Rad3 related)-dépendante, du point de contrôle de dommage à l’ADN, mais les facteurs et mécanismes moléculaires directement impliqués dans cette activité demeurent inconnus. Afin d’identifier de nouveaux facteurs cellulaires interagissant avec Vpr, nous avons utilisé une purification d’affinité en tandem (TAP) pour isoler des complexes protéiques natifs contenant Vpr. Nous avons découvert que Vpr s’associait avec CRL4A(VprBP), un complexe cellulaire d’E3 ubiquitine ligase, comprenant les protéines Cullin 4A, DDB1 (DNA damage-binding protein 1) et VprBP (Vpr-binding protein). Nos études ont mis en évidence que le recrutement de la E3 ligase par Vpr était nécessaire mais non suffisant pour l’induction de l’arrêt de cycle cellulaire en G2, suggérant ainsi que des événements additionnels seraient impliqués dans ce processus. À cet égard, nous apportons des preuves directes que Vpr détourne les fonctions de CRL4A(VprBP) pour induire la polyubiquitination de type K48 et la dégradation protéosomale de protéines cellulaires encore inconnues. Ces événements d’ubiquitination induits par Vpr ont été démontrés comme étant nécessaire à l’activation d’ATR. Finalement, nous montrons que Vpr forme des foyers ancrés à la chromatine co-localisant avec VprBP ainsi qu’avec des facteurs impliqués dans la réparation de l’ADN. La formation de ces foyers représente un événement essentiel et précoce dans l’induction de l’arrêt de cycle cellulaire en G2. Enfin, nous démontrons que Vpr est capable de recruter CRL4A(VprBP) au niveau de la chromatine et nous apportons des preuves indiquant que le substrat inconnu ciblé par Vpr est une protéine associée à la chromatine. Globalement, nos résultats révèlent certains des ménanismes par lesquels Vpr induit des perturbations du cycle cellulaire. En outre, cette étude contribue à notre compréhension de la modulation du système ubiquitine-protéasome par le VIH-1 et son implication fonctionnelle dans la manipulation de l’environnement cellulaire de l’hôte.

L’influence du réseau de chimiokines sur les lymphocytes T dans le contexte de l’infection à virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1)

Les chimiokines et leurs récepteurs respectifs jouent un rôle important dans l’immunité innée et adaptative. Les récepteurs de chimiokines identifient des cellules T CD4+ avec potentiel de migration dans des tissus spécifiques et à fonctionnalité distincte du point de vue de la spécificité antigénique et de la production de cytokines. L’identité de la population des cellules T CD4+ susceptibles versus résistantes à l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) reste mal définie. Le recrutement dans les muqueuses intestinales d’un excès de cellules T effectrices (CD8+) comparé aux cellules cibles (CD4+) représente un bon pronostic de l’infection par le virus de l’immunodéficience simienne (VIS), tandis que la déplétion des cellules Th17 dans les tissus lymphoïdes associés au tractus gastro-intestinal (GALT) est un marqueur de la progression de l’infection à VIH. L’effet régulateur des chimiokines sur l’activation de la réplication virale dans différentes sous-populations cellulaires T CD4+ reste peu étudié. Ce projet de maîtrise est divisé en 3 parties: (1) l’identification des récepteurs de chimiokines CCR4, CXCR3 et CCR6 comme marqueurs de surfaces des sous populations T CD4+ avec susceptibilité distincte à l’infection par le VIH; (2) la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des cellules T CD4+ et T CD8+ spécifiques au VIH de sujets à progression lente vers le stade sida (LTNP); et (3) les effets des chimiokines ligands de CCR4, CXCR3 et CCR6 sur l’activation cellulaire et la réplication virale in vitro. Nos résultats démontrent que les cellules T CD4+ CCR4+CCR6+ (profile cytokinique Th17) et CXCR3+CCR6+ (profile cytokinique Th1/Th17) sont hautement permissives à l’infection par le VIH. Nous proposons également de nouveaux corrélats de protection immunitaire contre le VIH chez les sujets LTNP: (i) le potentiel de co-localisation dans les muqueuses intestinales des cellules T CD4+ et CD8+ spécifiques au VIH via l’intégrine β7, (ii) le ratio élevé entre les cellules T effectrices (CD8+) versus les cellules cibles (CD4+) spécifiques au VIH, (iii) le profil cytokinique Th17 et (iv) la capacité des cellules T CD4+ et CD8+ spécifiques au VIH à produire des ligands de CCR5 bloquant l’entrée virale. Finalement, nos résultats sur l’effet co-stimulateur des chimiokines sur les cellules T et leurs effets opposés sur la réplication virale démontrent l’implication du réseau des chimiokines dans la régulation de la pathogenèse de l’infection à VIH.

Influence de l'initiation de la traduction sur le changement programmé du cadre de lecture en -1 responsable de la synthèse des enzymes du virus de l’immunodéficience humaine de type 1

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est responsable du syndrome de l’immunodéficience acquise (SIDA). Il faut identifier de nouvelles cibles pour le développement d’agents anti-VIH-1, car ce virus développe une résistance aux agents présentement utilisés. Notre but est d’approfondir la caractérisation de l’étape du changement de cadre de lecture ribosomique en -1 (déphasage -1) nécessaire à la production du précurseur des enzymes du VIH-1. Ce déphasage est programmé et effectué par une minorité de ribosomes lorsqu’ils traduisent la séquence dite glissante à un endroit spécifique de l’ARN messager (ARNm) pleine-longueur du VIH-1. L’efficacité de déphasage est contrôlée par le signal stimulateur de déphasage (SSF), une tige-boucle irrégulière située en aval de la séquence glissante. La structure du SSF est déroulée lors du passage d’un ribosome, mais elle peut se reformer ensuite. Nous avons montré que des variations de l’initiation de la traduction affectent l’efficacité de déphasage. Nous avons utilisé, dans des cellules Jurkat-T et HEK 293T, un rapporteur bicistronique où les gènes codant pour les luciférases de la Renilla (Rluc) et de la luciole (Fluc) sont séparés par la région de déphasage du VIH-1. La Rluc est produite par tous les ribosomes traduisant l’ARNm rapporteur alors que la Fluc est produite uniquement par les ribosomes effectuant un déphasage. L’initiation de ce rapporteur est coiffe-dépendante, comme pour la majorité des ARNm cellulaires. Nous avons examiné l’effet de trois inhibiteurs de l’initiation et montré que leur présence augmente l’efficacité de déphasage. Nous avons ensuite étudié l’effet de la tige-boucle TAR, qui est présente à l’extrémité 5’ de tous les ARNm du VIH-1. TAR empêche la liaison de la petite sous-unité du ribosome (40S) à l’ARNm et module aussi l’activité de la protéine kinase dépendante de l’ARN double-brin (PKR). L’activation de PKR inhibe l’initiation en phosphorylant le facteur d’initiation eucaryote 2 (eIF2) alors que l’inhibition de PKR a l’effet inverse. Nous avons étudié l’effet de TAR sur la traduction et le déphasage via son effet sur PKR en utilisant TAR en trans ou en cis, mais à une certaine distance de l’extrémité 5’ afin d’éviter l’interférence avec la liaison de la 40S. Nous avons observé qu’une faible concentration de TAR, qui active PKR, augmente l’efficacité de déphasage alors qu’une concentration élevée de TAR, qui inhibe PKR, diminue cette efficacité. Nous avons proposé un modèle où des variations de l’initiation affectent l’efficacité de déphasage en modifiant la distance entre les ribosomes parcourant l’ARNm et, donc, la probabilité qu’ils rencontrent un SSF structuré. Par la suite, nous avons déterminé l’effet de la région 5’ non traduite (UTR) de l’ARNm pleine-longueur du VIH-1 sur l’efficacité de déphasage. Cette 5’UTR contient plusieurs régions structurées, dont TAR à l’extrémité 5’, qui peut interférer avec l’initiation. Cet ARNm a une coiffe permettant une initiation coiffe-dépendante ainsi qu’un site d’entrée interne des ribosomes (IRES), permettant une initiation IRES-dépendante. Nous avons introduit cette 5’UTR, complète ou en partie, comme 5’UTR de notre ARNm rapporteur bicistronique. Nos résultats démontrent que cette 5’UTR complète inhibe l’initiation coiffe dépendante et augmente l’efficacité de déphasage et que ces effets sont dus à la présence de TAR suivie de la tige-boucle Poly(A). Nous avons aussi construit un rapporteur tricistronique où les ribosomes exprimant les luciférases utilisent obligatoirement l’IRES. Nous avons observé que cette initiation par l’IRES est faible et que l’efficacité de déphasage correspondante est également faible. Nous avons formulé une hypothèse pour expliquer cette situation. Nous avons également observé que lorsque les deux modes d’initiation sont disponibles, l’initiation coiffe dépendante est prédominante. Finalement, nous avons étudié l’effet de la protéine virale Tat sur l’initiation de la traduction et sur l’efficacité de déphasage. Nous avons montré qu’elle augmente l’initiation de la traduction et que son effet est plus prononcé lorsque TAR est située à l’extrémité 5’ des ARNm. Nous proposons un modèle expliquant les effets de Tat sur l’initiation de la traduction par l’inhibition de PKR ainsi que par des changements de l’expression de protéines cellulaires déroulant TAR. Ces résultats permettent de mieux comprendre les mécanismes régissant le déphasage du VIH-1, ce qui est essentiel pour le développement d’agents anti-déphasage.

Étude de l’évolution du tropisme et de la pression sélective exercée sur le gène de l’enveloppe du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 au cours de la grossesse et à l’échelle de la population.

Introduction. Le VIH-1 évolue en fonction de la réponse immunitaire spécifique de l’hôte. La pression sélective exercée par la réponse immunitaire VIH-spécifique de l’hôte entraine l’évolution des gènes viraux et à terme détermine l’évolution de la maladie. Cette évolution du virus à l’échelle d’un individu façonne également l’évolution du virus à l’échelle de la population et détermine le devenir de l’épidémie. Le VIH utilise les corécepteurs d’entrée CCR5 (virus R5) et CXCR4 (virus X4) afin d’infecter la cellule cible, et l’évolution du tropisme du virus de R5 vers X4, appelé switch du tropisme, est associé à la progression de la maladie. Les virus R5 sont rencontrés en début d’infection tandis que les virus X4 apparaissent en fin de maladie chez un certain de nombre de patients et sont considérés comme plus virulents. La pression sélective immunitaire exercée sur le gène de l’enveloppe (env) peut donc entrainer l’évolution du tropisme du VIH. La grossesse est un état immunitaire particulier considéré comme étant principalement caractérisé par un biais Th2 nécessaire à l’établissement de la tolérance materno-fétale. Le switch de tropisme de R5 vers X4 en grossesse n’a jamais été documenté, de même que l’évolution des déterminants du tropisme à l’échelle de la population. Hypothèses. Les changements immunitaires associés à l’initiation et la progression de la grossesse engendrent des changements dans la pression immunitaire exercée sur l’enveloppe et peuvent favoriser le switch du tropisme. L’évolution du tropisme du VIH-1 peut être observé à l’échelle de la population au même titre que l’évolution de l’enveloppe virale. Objectifs. Analyser l’évolution du tropisme et décrire la pression sélective sur l’enveloppe des femmes enceintes infectées par le VIH-1. Analyser l’évolution des déterminants du tropisme à l’échelle de la population. Méthodes. Nous avons dans un premier temps analysé l’évolution des déterminants du tropisme et déterminé le génotype et phénotype du VIH-1 chez 19 femmes enceintes issues de la cohorte du centre maternel et infantile sur le SIDA de l’hôpital Sainte-Justine (CMIS). Nous avons ensuite caractérisé et comparé la pression sélective exercée sur env, par une méthode bayésienne, chez 31 femmes enceinte et 29 femmes non-enceintes. Enfin, nous avons analysé et comparé des déterminants du tropisme entre des séquences d’enveloppe contemporaines et anciennes, issues des bases de données du NCBI. Résultats. Nos résultats montrent la présence de virus X4 chez la moitié de notre cohorte, et un switch de tropisme de R5 vers X4 chez 5/19 sujets. Les séquences des femmes enceintes présentaient des taux de substitutions plus élevées que celles des femmes non-enceintes. La pression sélective dans la région C2 était plus faible chez les femmes enceintes que chez les femmes non-enceintes, et différait dans 4 positions entre ces 2 groupes. Cette sélection diminuait au cours de la grossesse chez les patientes traitées. Enfin, une accumulation de mutations X4 a été observée dans les séquences R5 contemporaines par rapport aux séquences R5 anciennes. Conclusion. Les changements immunitaires associés à la grossesse semblent induire des modifications subtiles dans la pression sélective exercée sur env, suffisant à influencer l’évolution du tropisme de R5 vers X4. Un switch du tropisme à l’échelle de la population impliquerait une épidémie évoluant vers une plus grande virulence du virus. Nos résultats sont d’importance en ce qui concerne la prophylaxie antirétrovirale pour la santé de la mère et la prévention de la transmission mère-enfant du VIH-1. Ils sont aussi importants concernant l’avenir de la thérapie antirétrovirale dans le contexte d’une épidémie évoluant vers une plus grande virulence

Étude du mécanisme du changement programmé -1 du cadre de lecture par le ribosome

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Étude de la traduction IRES-dépendante du VIH-1

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est responsable de la pandémie du SIDA (syndrome de l’immunodéficience acquise). Des souches virales résistantes aux antirétroviraux actuellement utilisés apparaissent rapidement. Il est donc important d’identifier de nouvelles cibles dans le cycle de réplication du VIH-1 pour développer de nouveaux agents contre ce virus. La traduction des protéines de structure et des enzymes du VIH-1 est une étape essentielle du cycle de réplication virale. Ces protéines sont exprimées à partir de l’ARN messager (ARNm) pleine-longueur (ARNmPL) à la fin du cycle de réplication. L’ARNmPL du VIH-1 peut utiliser un mode d’initiation de la traduction coiffe-dépendant, comme la majorité des ARNm cellulaires, mais peut aussi utiliser un mode d’initiation alternatif, car sa région 5’ non-traduite (5’UTR) contient un site interne d’entrée du ribosome (IRES), ce qui lui permet d’initier la traduction suivant un mode IRES-dépendant. L’initiation IRES-dépendante permet à l’ARNmPL d’être traduit quand l’initiation coiffe-dépendante est inhibée. L’activité de l’IRES de la région 5’UTR de l’ARNmPL du VIH-1 (IRES5’UTR) est faible dans des conditions physiologiques, mais est stimulée lorsque la cellule est arrêtée à la transition G2/M du cycle cellulaire, un arrêt qu’induit l’infection par le VIH-1. Une grande portion de l’IRES5’UTR, que nous nommons IRES5’UTRc, est présente dans tous les ARNm viraux et a une activité semblable à celle de l’ IRES5’UTR, ce qui indique que le mode IRES-dépendant peut être utilisé par tous les messagers du VIH-1. Lors de mes études doctorales, j’ai caractérisé le fonctionnement de l’IRES5’UTR du VIH-1. J’ai transfecté des cellules lymphocytaires Jurkat T, dérivées des cibles naturelles du VIH-1, avec un vecteur dual-luciférase contenant les séquences codantes des luciférases de la Renilla (Rluc) et de la luciole (Fluc) séparées par la région 5’UTR de l’ARNmPL du VIH-1. La traduction de la Rluc est coiffe-dépendante alors que celle de la Fluc dépend de l’IRES5’UTR. J’ai d’abord effectué une analyse mutationnelle et j’ai identifié trois régions qui stimulent l’activité de l’IRES5’UTR et une tige-boucle qui réprime l’activité de cet IRES, que j’ai nommée IRENE (IRES negative element). J’ai montré que l’effet répresseur d’IRENE est aboli lorsque les cellules sont soumises à un stress oxydatif, un type de stress induit lors d’une infection par le VIH-1. Nous proposons que IRENE maintiendrait l’IRES5’UTR dans une conformation peu active dans des conditions physiologiques. On sait que les IRES sont activés par divers facteurs cellulaires, appelés ITAF (IRES trans-acting factors). Nous proposons que l’IRES5’UTR adopterait une conformation active suite à la liaison d’un ITAF exprimé ou relocalisé lors d’un stress oxydatif. Ces travaux ont fait l’objet d’une publication (Gendron et al., 2011, Nucleic Acids Research, 39, 902-912). J’ai ensuite étudié l’effet de la protéine virale Tat sur l’activité de l’IRES5’UTR. En plus de son rôle essentiel dans la transactivation de la transcription des ARNm viraux, Tat stimule leur traduction coiffe-dépendante, en empêchant l’inhibition d’un facteur d’initiation canonique, eIF2, induite par la protéine kinase modulée par l’ARN double-brin (PKR) et en déroulant la structure TAR présente à l’extrémité 5’ de tous les ARNm du VIH-1. Elle affecte aussi l’expression de plusieurs gènes cellulaires. J’ai montré que les isoformes Tat86 et Tat72, mais non Tat101, stimulent l’activité de l’IRES5’UTR. Cet effet est indépendant de PKR et de TAR, mais dépendrait de la conformation de Tat. Nous proposons que Tat activerait un facteur de transcription cellulaire qui déclenche l’expression d’un ITAF de l’IRES5’UTR ou encore qu’elle activerait directement un tel ITAF. J’ai de plus montré que PKR stimule l’activité de l’IRES5’UTR, ce qui est surprenant puisque PKR est une protéine antivirale. Cet effet est indépendant de l’inhibition d’eIF2 par PKR et pourrait résulter de l’activation d’un ITAF. Sachant qu’une portion active de l’IRES5’UTR, IRES5’UTRc, est présente dans tous les ARNm viraux, notre hypothèse est que la stimulation de cet IRES par PKR permettait de traduire l’ARNm de Tat au début du cycle de réplication, ce qui permettrait ensuite la traduction coiffe-dépendante des ARNm du VIH-1, qui est stimulée par Tat. Ces travaux font l’objet d’un manuscrit (Gendron et al., soumis à RNA). Mes résultats, couplés aux données de la littérature, me conduisent à la conclusion que, à la fin du cycle de réplication du VIH-1, l’activité de l’IRES5’UTR est stimulée par le stress oxydatif, l’arrêt en G2/M et la présence de quantités élevées de Tat, alors que la traduction coiffe-dépendante est compromise. L’initiation IRES-dépendante serait alors indispensable pour que le VIH-1 traduise l’ARNmPL. L’IRES5’UTR constituerait donc une cible très intéressante pour développer des agents anti-VIH.

Mécanismes moléculaires de la réplication préférentielle du VIH-1 dans les cellules à polarisation Th1Th17 versus Th1 : rôle de PPARG dans la régulation négative de la réplication virale

Les cellules T CD4+ humaines sont hétérogènes du point de vue de la permissivité à l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). Notre laboratoire a préalablement démontré que les cellules Th1 à phénotype CXCR3+CCR6- sont relativement résistantes à l’infection par le VIH-1 alors que les cellules Th1Th17 à phénotype CXCR3+CCR6+ y sont hautement permissives. La réplication du VIH dépend de plusieurs facteurs cellulaires de restriction ou de permissivité agissant à différentes étapes du cycle viral. Toutefois, malgré plusieurs avancées, la compréhension des voies de signalisation cellulaire impliquées dans la régulation de la réplication du VIH est encore limitée. L’objectif majeur de ce projet de maîtrise est de caractériser les mécanismes moléculaires de la permissivité et de la résistance au VIH respectivement dans les cellules Th1Th17 et Th1. Ce mémoire est divisé en quatre parties qui visent: (i) l’identification des voies canoniques et des fonctions biologiques différemment régulées dans les cellules Th1Th17 versus Th1 par l’analyse de leur transcriptome au niveau du génome entier; (ii) la validation de l’expression différentielle des gènes d’intérêt identifiés par biopuces au niveau des transcrits et des protéines; (iii) la caractérisation du rôle fonctionnel de certains de ces facteurs (i.e., PPARG, AhR) sur la réplication du VIH dans les cellules Th1Th17 versus Th1; et (iv) l’identification du niveau auquel ces facteurs interfèrent avec le cycle de réplication du VIH. Nos résultats d’analyse du transcriptome du génome entier par Gene Set Enrichment Analysis et Ingenuity Pathway Analysis indiquent que les cellules à profil Th1Th17 sont plus susceptibles à l’activation cellulaire et à l’apoptose, favorisent plus l’inflammation et expriment moins fortement les gènes liés à la dégradation protéosomale comparé aux cellules à profil Th1. Ces différences dans la régulation de diverses voies et fonctions biologiques permettent en partie d’expliquer la susceptibilité à l’infection par le VIH dans ces cellules. Nous avons ensuite confirmé l’expression différentielle de certains gènes d’intérêt dans les cellules Th1Th17 (CXCR6, PPARG, ARNTL, CTSH, PTPN13, MAP3K4) versus Th1 (SERPINB6, PTK2) au niveau de l’ARNm et des protéines. Finalement, nous avons démontré le rôle des facteurs de transcription PPARG et AhR dans la régulation de la réplication du VIH. L’activation de la voie PPARG par la rosiglitazone induit la diminution importante de la réplication du VIH dans les cellules T CD4+, alors que l’activation de la voie AhR par les ligands exogènes TCDD et FICZ augmente de façon significative la réplication virale. Nous proposons que la voie PPARG agit comme un régulateur négatif de la réplication du VIH dans ces cellules, en interférant avec la polarisation Th17 et probablement en inhibant l’activité transcriptionnelle du facteur NF-kB. Les rôles des formes nucléaires versus cytoplasmiques du récepteur Ahr semblent être diamétralement opposés, dans la mesure où l’interférence ARN contre AhR s’associe également à l’augmentation de la réplication virale. Il est ainsi possible que la forme cytoplasmique d’AhR, connue par son activité E3 ligase, participe à la dégradation protéosomale des particules virales. Le mécanisme par lequel le AhR nucléaire versus cytoplasmique interfère avec la réplication virale est en cours d’étude au laboratoire. Cette étude représente la première caractérisation de l’expression différentielle de gènes au niveau du génome entier de sous-populations T CD4+ permissives versus résistantes à l’infection par le VIH. Nos résultats identifient de nouvelles cibles moléculaires pour de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à limiter la réplication du VIH dans les lymphocytes T CD4+ primaires.

L'impact des cellules dendritiques dans la dérégulation des cellules B dans un contexte d'infection au virus d'immunodéficience humaine

Les cellules dendritiques (DC) sont parmi les premières cellules à rencontrer le virus d’immunodéficience humaine (VIH) au niveau des muqueuses. De plus, le fait que les DC sont, de manière directe ou indirecte par le virus et ses composantes, altérées tant par leur nombre, leur phénotype et leur fonction suggère leur implication dans les dérégulations des cellules B. Selon cette hypothèse, des études longitudinales impliquant des individus infectés au VIH-1 présentant différents profils de progression clinique menées dans notre laboratoire ont démontré que les altérations des cellules B sont concomitantes à une augmentation de l’expression de BLyS/BAFF dans le sang ainsi que par les DC myéloïdes (mDC) sanguines. De plus, lors de travaux antérieurs utilisant le modèle murin VIH-transgénique, les altérations des cellules B ont démontré une implication des DC et d’un excès de BLyS/BAFF, et ce, dépendamment du facteur négatif du VIH (Nef). Dans cette optique, nous investiguons dans cette présente étude l’implication de Nef dans la modulation du phénotype des DC ainsi que dans les dérégulations des cellules B. Chez tous les patients virémiques infectés au VIH-1, nous avons détecté la présence de Nef dans le plasma ainsi qu’au niveau des mDC et de leurs précurseurs d’origine monocytaire, tout au long du suivi de la progression clinique et au-delà de la thérapie antirétrovirale (ART). La surexpression de BLyS/BAFF est associée à la présence de Nef au niveau des mDC et de leur précurseur.. Des essais in vitro ont permis de démontrer l’induction d’un phénotype proinflammatoire par des mDC dérivés de monocytes lorsqu’en présence de Nef soluble, via l’augmentation de l’expression de BLyS/BAFF et de TNF-α, et où cet effet est bloqué par l’ajout de l’acide rétinoïque. Nos résultats suggèrent donc que Nef est impliquée dans le déclenchement et la persistance des dérégulations des cellules B retrouvées chez les individus infectés au VIH-1. Basé sur nos observations, une thérapie adjointe impliquant le blocage de BLyS/BAFF et/ou Nef pourrait contribuer au contrôle de l’inflammation et des altérations des cellules B. De plus, la quantification de Nef post-ART pourrait s’avérer utile dans l’évaluation du statut des réservoirs. Précédemment, nous avons démontré que les dérégulations des cellules B sanguines de ces mêmes individus présentant un profil de progression rapide et classique sont accompagnées par l’augmentation de la fréquence d’une population partageant des caractéristiques des cellules B transitionnelles immatures (TI) et des cellules B de la zone marginale (ZM), que nous avons nommé les cellules B précurseur de la ZM. Toutefois, cette population est préservée chez les contrôleurs élites, chez qui nous avons trouvé une diminution significative de la fréquence des cellules B de la ZM présentant des marqueurs phénotypiques plus matures. Récemment, ces cellules ont été associées à un potentiel de fonction régulatrice (Breg), motivant ainsi notre poursuite, dans cette étude, de la caractérisation de ces cellules B. Comme pour les individus non infectés au VIH-1, nous avons démontré que les cellules B matures de la ZM contrôlent leur capacité de production d’IL-10 chez les contrôleurs élites, contrairement à une augmentation chez les progresseurs rapides et classiques. Aussi, les cellules B précurseur de la ZM des contrôleurs élites fournissent une expression importante de LT-α lorsque comparés aux individus non infectés au VIH-1, alors que cet apport de LT-α est attribué aux cellules B TI chez les progresseurs. Le contrôle de la progression clinique semble associé à un ratio en faveur de LT-α vs IL-10 au niveau des cellules B précurseur de la ZM. Nos résultats suggèrent qu’un maintien de l’intégrité du potentiel régulateur ainsi qu’une expression augmentée de LT-α par les cellules B de première ligne, telles les populations de la ZM, sont impliqués dans le contrôle de la progression clinique du VIH-1, possiblement par leur contribution à la modulation et l’homéostasie immunitaire. De telles populations doivent être considérées lors de l’élaboration de vaccins, ces derniers cherchant à générer une réponse protectrice de première ligne et adaptative.

Étude du goulot d’étranglement dans la transmission mère-enfant du virus de l’hépatite C.

La transmission mère-enfant (TME) du virus de l’hépatite C (VHC) est la première cause d’acquisition de l’infection chez les enfants des pays développés. Celle-ci prend place dans <10% des cas. Toutefois, dans le cas d’une coinfection maternelle avec le virus de l’immunodéficience de type 1 (VIH-1), ce taux est accru alors qu’il n’existe aucune intervention préventive de la TME du VHC. Le VHC arbore une diversité importante qui est le résultat d’une réplication exempte de mécanisme de correction. Il est donc retrouvé chez son hôte sous la forme d’un spectre de virions génétiquement apparentés mais différents qu’on appelle quasiespèce. Lorsque le VHC est transmis entre adultes, seulement un nombre limité de variantes sont responsables de l’infection, c’est ce qu’on appelle un goulot d’étranglement génétique. L’existence d’un tel profil de transmission lors de la TME du VHC restait, jusqu’à maintenant, à confirmer. En se basant sur la détection par RT-PCR de la virémie à la naissance, la TME du VHC est réputée prendre place in utero et peripartum, une dynamique de transmission qui reste à démontrer. Ici, nous rapportons une analyse longitudinale de la TME du VHC par séquençage de nouvelle génération chez 5 paires mère-enfant dont 3 mères sont également coinfectées avec le VIH-1. L’analyse de l’identité des variantes virales basée sur la séquence nucléotidique des régions hypervariables 1-2 de la glycoprotéine E2 (positions 1491-1787 de l’isolat H77) révèle qu’un nombre limité de variantes virales sont transmises de la mère à l’enfant lorsque la mère est seulement infectée par le VHC (n = 1-4 variantes transmises). Dans le cas de la coinfection maternelle avec le VIH-1, ce nombre est toutefois drastiquement plus important (n = 111-118). La détection de variantes retrouvées chez la mère au deuxième trimestre et l’enfant mais non détectées subséquemment chez la mère témoigne que la TME du VHC peut prendre place aussi tôt que lors du deuxième trimestre de grossesse. Finalement, nous montrons que la dynamique d’infection chez l’enfant implique une augmentation transitoire de la virémie concomitante avec une perte de diversité de la quasiespèce. Dans l’ensemble ces résultats sont les premiers à démontrer directement l’existence d’un goulot d’étranglement lors de la TME du VHC. Celui-ci serait moins restringent dans le cas de la coinfection maternelle avec le VIH-1. Cette transmission peut prendre place aussi tôt que lors du deuxième trimestre de grossesse et il semblerait qu’un spectre limité de variantes soit responsable pour l’établissement de l’essentiel de la production virale chez le jeune enfant.