Characterization of polycystin-1 in ADPKD pathogenetic mechanism : biogenesis and functional implications by genetic approaches in mouse

La polykystose rénale autosomique dominante (ADPKD) est une des maladies génétiques les plus communes. ADPKD se manifeste le plus souvent au stade adulte par la présence de kystes rénaux, et bien souvent de kystes hépatiques, avec une progression très variable. ADPKD mène à une insuffisance rénale: les seuls recours sont la dialyse puis la transplantation rénale. Les mutations dispersées sur les gènes PKD1 (majoritairement; la protéine polycystine-1, PC1) et PKD2 (la protéine polycystine-2, PC2) sont responsables de l’ADPKD. Le mécanisme pathogénétique de perte de fonction (LOF) et donc d’un effet récessif cellulaire est évoqué comme causatif de l’ADPKD. LOF est en effet supporté par les modèles murins d’inactivation de gènes PKD1/PKD2, qui développent de kystes, quoique in utéro et avec une rapidité impressionnante dans les reins mais pas dans le foie. Malgré de nombreuses études in vitro, le rôle de PC1/PC2 membranaire/ciliaire reste plutôt hypothétique et contexte-dépendant. Ces études ont associé PC1/PC2 à une panoplie de voies de signalisation et ont souligné une complexité structurelle et fonctionnelle exceptionnelle, dont l’implication a été testée notamment chez les modèles de LOF. Toutefois, les observations patho-cellulaires chez l’humain dont une expression soutenue, voire augmentée, de PKD1/PC1 et l’absence de phénotypes extrarénaux particuliers remet en question l’exclusivité du mécanisme de LOF. Il était donc primordial 1) d’éclaircir le mécanisme pathogénétique, 2) de générer des outils in vivo authentiques d’ADPKD en terme d’initiation et de progression de la maladie et 3) de mieux connaitre les fonctions des PC1/PC2 indispensables pour une translation clinique adéquate. Cette thèse aborde tous ces points. Tout d’abord, nous avons démontré qu’une augmentation de PKD1 endogène sauvage, tout comme chez l’humain, est pathogénétique en générant et caractérisant en détail un modèle murin transgénique de Pkd1 (Pkd1TAG). Ce modèle reproduit non seulement les caractéristiques humaines rénales, associées aux défauts du cil primaire, mais aussi extrarénales comme les kystes hépatiques. La sévérité du phénotype corrèle avec le niveau d’expression de Pkd1 ce qui supporte fortement un modèle de dosage. Dans un deuxième temps, nous avons démontré par les études de complémentations génétiques que ces deux organes reposent sur une balance du clivage GPS de Pc1, une modification post-traductionelle typique des aGPCR, et dont l’activité et l’abondance semblent strictement contrôlées. De plus, nous avons caractérisé extensivement la biogénèse de Pc1 et de ses dérivés in vivo générés suite au clivage GPS. Nous avons identifié une toute nouvelle forme et prédominante à la membrane, la forme Pc1deN, en plus de confirmer deux fragments N- et C-terminal de Pc1 (NTF et CTF, respectivement) qui eux s’associent de manière non-covalente. Nous avons démontré de façon importante que le trafic de Pc1deN i.e., une forme NTF détachée du CTF, est toutefois dépendant de l’intégrité du fragment CTF in vivo. Par la suite, nous avons généré un premier modèle humanisant une mutation PKD1 non-sens tronquée au niveau du domaine NTF(E3043X) en la reproduisant chez une souris transgénique (Pkd1extra). Structurellement, cette mutation, qui mimique la forme Pc1deN, s’est également avérée causative de PKD. Le modèle Pkd1extra a permis entre autre de postuler l’existence d’une cross-interaction entre différentes formes de Pc1. De plus, nos deux modèles murins sont tous les deux associés à des niveaux altérés de c-Myc et Pc2, et soutiennent une implication réelle de ces derniers dans l’ADPKD tou comme une interaction fonctionnelle entre les polycystines. Finalement, nous avons démontré un chevauchement significatif entre l’ADPKD et le dommage rénal aigüe (ischémie/AKI) dont une expression augmentée de Pc1 et Pc2 mais aussi une stimulation de plusieurs facteurs cystogéniques tel que la tubérine, la β-caténine et l’oncogène c-Myc. Nos études ont donc apporté des évidences cruciales sur la contribution du gène dosage dans l’ADPKD. Nous avons développé deux modèles murins qui serviront d’outil pour l’analyse de la pathologie humaine ainsi que pour la validation préclinique ADPKD. L’identification d’une nouvelle forme de Pc1 ajoute un niveau de complexité supplémentaire expliquant en partie une capacité de régulation de plusieurs voies de signalisation par Pc1. Nos résultats nous amènent à proposer de nouvelles approches thérapeutiques: d’une part, le ciblage de CTF i.e., de style chaperonne, et d’autre part le ciblage de modulateurs intracellulaires (c-Myc, Pc2, Hif1α). Ensemble, nos travaux sont d’une importance primordiale du point de vue informatif et pratique pour un avancement vers une thérapie contre l’ADPKD. Le partage de voies communes entre AKI et ADPKD ouvre la voie aux approches thérapeutiques parallèles pour un traitement assurément beaucoup plus rapide.

La discrimination génétique dans l'emploi : une étude des protections offertes par les chartes canadiennes et québécoise

"Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures en vue de l'obtention du grade de maître en droit option Droit des biotechnologies". Ce mémoire a été accepté à l'unanimité et classé parmi les 10% des mémoires de la discipline.

Discrimination génétique lors de la pré-embauche : élaboration d'une politique d'encadrement

"Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures En vue de l'obtention du grade de maîtrise en droit"

Identification des bases génétiques des myopathies à multi-minicores avec ou sans cardiomyopathie

Thèse réalisée en cotutelle avec l'Université Pierre et Marie Curie, Paris 6(UPMC, Paris, France).

Régulation de la kinase Ste20 Slik de Drosophila par phosphorylation de la boucle d'activation

Les kinases constituent une famille majeure de protéines qui régulent divers processus par la phosphorylation de leurs substrats, mais aussi par leur activité non- catalytique. Ce rôle indépendant de l’activité kinase a été observé chez quelques protéines dont des membres de la famille Sterile-20. La kinase Ste20 Slik de Drosophila aide au maintien de l’intégrité des tissus épithéliaux en phosphorylant l’ERM Moesin et peut aussi induire une prolifération cellulaire non-autonome indépendamment de son activité catalytique. La méthode de régulation de ces deux rôles était jusqu’ici inconnue. Nous avons identifié 19 sites de phosphorylation chez Slik par spectrométrie de masse. À l’aide de mutants, nous démontrons que les deux fonctions de Slik sont régulées par la phosphorylation d’au moins 2 résidus conservés de son segment d’activation par un mécanisme d’auto- et/ou trans-phosphorylation. Cette étude amène une meilleure compréhension de la régulation de l’intégrité épithéliale et de la croissance, deux processus clés qui sont souvent déréglés dans le cancer et certaines maladies génétiques.

Whither Pediatric Research and Predisposition Genetic Testing?

Research in which children undergo genetic testing for predisposition to adult-onset diseases or disorders can lead to a better understanding of these conditions. It can possibly also help encourage early detection and the development of clinical and preventive interventions for those found to be at increased hereditary risk. Increasingly, predisposition testing is becoming part of pediatric genetic research. However, the paucity of normative texts about the conduct of pediatric research using predisposition genetic testing generates complex legal and ethical issues. Drawing on the current texts that govern predisposition genetic testing in research and the norms of pediatric research, we outline points of consensus and divergence as well as recommendations regarding predisposition genetic testing in pediatric research.

Alternative strategies for deciphering the genetic architecture of childhood Pre-B acute lymphoblastic leukemia

La leucémie lymphoblastique aigüe (LLA) est une maladie génétique complexe. Malgré que cette maladie hématologique soit le cancer pédiatrique le plus fréquent, ses causes demeurent inconnues. Des études antérieures ont démontrées que le risque à la LLA chez l’enfant pourrait être influencé par des gènes agissant dans le métabolisme des xénobiotiques, dans le maintient de l’intégrité génomique et dans la réponse au stress oxydatif, ainsi que par des facteurs environnementaux. Au cours de mes études doctorales, j’ai tenté de disséquer davantage les bases génétiques de la LLA de l’enfant en postulant que la susceptibilité à cette maladie serait modulée, au moins en partie, par des variants génétiques agissant dans deux voies biologiques fondamentales : le point de contrôle G1/S du cycle cellulaire et la réparation des cassures double-brin de l’ADN. En utilisant une approche unique reposant sur l’analyse d’une cohorte cas-contrôles jumelée à une cohorte de trios enfants-parents, j’ai effectué une étude d’association de type gènes/voies biologiques candidats. Ainsi, j’ai évaluer le rôle de variants provenant de la séquence promotrice de 12 gènes du cycle cellulaire et de 7 gènes de la voie de réparation de l’ADN, dans la susceptibilité à la LLA. De tels polymorphismes dans la région promotrice (pSNPs) pourraient perturber la liaison de facteurs de transcription et mener à des différences dans les niveaux d’expression des gènes pouvant influencer le risque à la maladie. En combinant différentes méthodes analytiques, j’ai évalué le rôle de différents mécanismes génétiques dans le développement de la LLA chez l’enfant. J’ai tout d’abord étudié les associations avec gènes/variants indépendants, et des essaies fonctionnels ont été effectués afin d’évaluer l’impact des pSNPs sur la liaison de facteurs de transcription et l’activité promotrice allèle-spécifique. Ces analyses ont mené à quatre publications. Il est peu probable que ces gènes de susceptibilité agissent seuls; j’ai donc utilisé une approche intégrative afin d’explorer la possibilité que plusieurs variants d’une même voie biologique ou de voies connexes puissent moduler le risque de la maladie; ces travaux ont été soumis pour publication. En outre, le développement précoce de la LLA, voir même in utero, suggère que les parents, et plus particulièrement la mère, pourraient jouer un rôle important dans le développement de cette maladie chez l’enfant. Dans une étude par simulations, j’ai évalué la performance des méthodes d’analyse existantes de détecter des effets fœto-maternels sous un design hybride trios/cas-contrôles. J’ai également investigué l’impact des effets génétiques agissant via la mère sur la susceptibilité à la LLA. Cette étude, récemment publiée, fût la première à démontrer que le risque de la leucémie chez l’enfant peut être modulé par le génotype de sa mère. En conclusions, mes études doctorales ont permis d’identifier des nouveaux gènes de susceptibilité pour la LLA pédiatrique et de mettre en évidence le rôle du cycle cellulaire et de la voie de la réparation de l’ADN dans la leucémogenèse. À terme, ces travaux permettront de mieux comprendre les bases génétiques de la LLA, et conduiront au développement d’outils cliniques qui amélioreront la détection, le diagnostique et le traitement de la leucémie chez l’enfant.

Genetic Landscape of Joubert syndrome in French Canadians

Le syndrome de Joubert est une maladie récessive caractérisée par une malformation congénitale distincte du tronc cérébral et du cervelet, associée à une anomalie des mouvements oculaires (apraxie oculomotrice), une respiration irrégulière, un retard de développement, et une ataxie à la démarche. Au cours de la dernière décennie, plus de 20 gènes responsables ont été identifiés, tous ayant un rôle important dans la structure et la fonction des cils primaires. Ainsi, le syndrome de Joubert est considéré une ciliopathie. Bien que le Syndrome de Joubert ait été décrit pour la première fois dans une famille canadienne-française en 1969, le(s) gène(s) causal demeurait inconnu dans presque tous les cas de syndrome de Joubert recensés en 2010 dans la population canadienne-française, soit début de mon projet doctoral. Nous avons identifié un total de 43 individus canadiens-français (35 familles) atteints du syndrome de Joubert. Il y avait un regroupement de familles dans la région du Bas-Saint-Laurent de la province de Québec, suggérant la présence d'un effet fondateur. L’objectif de ce projet était de caractériser la génétique du syndrome de Joubert dans la population canadienne-française. Notre hypothèse était qu’il existait un effet fondateur impliquant au moins un nouveau gène JBTS. Ainsi, dans un premier temps, nous avons utilisé une approche de cartographie par homozygotie. Cependant, nous n’avons pas identifié de région d’homozygotie partagée parmi les individus atteints, suggérant la présence d’une hétérogénéité génétique ou allélique. Nous avons donc utilisé le séquençage exomique chez nos patients, ce qui représente une approche plus puissante pour l’étude de conditions génétiquement hétérogènes. Nos travaux ont permis l’identification de deux nouveaux gènes responsables du syndrome de Joubert: C5orf42 et TMEM231. Bien que la localisation cellulaire et la fonction de C5orf42 soient inconnus au moment de cette découverte, nos résultats génétiques combinés avec des études ultérieures ont établi un rôle important de C5orf42 dans la structure et la fonction ciliaire, en particulier dans la zone de transition, qui est une zone de transition entre le cil et le reste de la cellule. TMEM231 avait déjà un rôle établi dans la zone de transition ciliaire et son interaction avec d’autres protéines impliquées dans le syndrome de Joubert était connu. Nos études ont également identifié des variants rares délétères chez un patient JBTS dans le gène ciliaire CEP104. Nous proposons donc CEP104 comme un gène candidat JBTS. Nous avons identifié des mutations causales dans 10 gènes, y compris des mutations dans CC2D2A dans 9 familles et NPHP1 dans 3 familles. Au total, nous avons identifié les mutations causales définitives chez 32 des 35 familles étudiées (91% des cas). Nous avons documenté un effet fondateur complexe dans la population canadienne-française avec de multiples mutations récurrentes dans quatre gènes différents (C5orf42, CC2D2A, TMEM231, NPHP1). Au début de ce projet de recherche, l’étiologie génétique était inconnue chez les 35 familles touchées du syndrome de Joubert. Maintenant, un diagnostique moléculaire définitif est identifié chez 32 familles, et probable chez les 3 autres. Nos travaux ont abouti à la caractérisation génétique du syndrome de Joubert dans la population canadienne-française grâce au séquençage exomique, et révèlent la présence d'un effet fondateur complexe avec une l'hétérogénéité allélique et intralocus importante. Ces découvertes ont éclairé la physiologie de cette maladie. Finalement, l’identification des gènes responsables ouvre de nouvelles perspectives diagnostiques ante-natales, et de conseils génétique, très précieuses pour les familles.

The French Canadian founder population : lessons and insights for genetic epidemiological research

La population canadienne-française a une histoire démographique unique faisant d’elle une population d’intérêt pour l’épidémiologie et la génétique. Cette thèse vise à mettre en valeur les caractéristiques de la population québécoise qui peuvent être utilisées afin d’améliorer la conception et l’analyse d’études d’épidémiologie génétique. Dans un premier temps, nous profitons de la présence d’information généalogique détaillée concernant les Canadiens français pour estimer leur degré d’apparentement et le comparer au degré d’apparentement génétique. L’apparentement génétique calculé à partir du partage génétique identique par ascendance est corrélé à l’apparentement généalogique, ce qui démontre l'utilité de la détection des segments identiques par ascendance pour capturer l’apparentement complexe, impliquant entre autres de la consanguinité. Les conclusions de cette première étude pourront guider l'interprétation des résultats dans d’autres populations ne disposant pas d’information généalogique. Dans un deuxième temps, afin de tirer profit pleinement du potentiel des généalogies canadienne-françaises profondes, bien conservées et quasi complètes, nous présentons le package R GENLIB, développé pour étudier de grands ensembles de données généalogiques. Nous étudions également le partage identique par ascendance à l’aide de simulations et nous mettons en évidence le fait que la structure des populations régionales peut faciliter l'identification de fondateurs importants, qui auraient pu introduire des mutations pathologiques, ce qui ouvre la porte à la prévention et au dépistage de maladies héréditaires liées à certains fondateurs. Finalement, puisque nous savons que les Canadiens français ont accumulé des segments homozygotes, à cause de la présence de consanguinité lointaine, nous estimons la consanguinité chez les individus canadiens-français et nous étudions son impact sur plusieurs traits de santé. Nous montrons comment la dépression endogamique influence des traits complexes tels que la grandeur et des traits hématologiques. Nos résultats ne sont que quelques exemples de ce que nous pouvons apprendre de la population canadienne-française. Ils nous aideront à mieux comprendre les caractéristiques des autres populations de même qu’ils pourront aider la recherche en épidémiologie génétique au sein de la population canadienne-française.