La Visualisation in vivo des « espèces oxygénées radiculaires» au niveau des cellules ganglionnaires de la rétine.

Titre: La Visualisation in vivo des « espèces oxygénées radiculaires» au niveau des cellules ganglionnaires de la rétine. Le But : Les espèces d'oxygène réactives sont non seulement produites à la suite de la blessure cellulaire, mais servent aussi des molécules faisantes des signes pour une variété de processus critiques, en incluant mitosis et de mort de cellule. Nous avons auparavant dit que la blessure à RGC axons incite un éclatement de superoxyde dans le corps de cellule, probablement de l'origine mitochondrial (Lieven et al, 2006). Nous décrivons maintenant une méthode pour refléter des espèces d'oxygène réactives dans la rétine de l'animal vivant en utilisant un confocal le lisant rapidement du laser ophthalmoscope a appelé la Rétine de Heidelberg Angiograph 2 (HRA2) équipé avec les lasers doubles. La méthodolologie : Après les études préliminaires en utilisant d'autres indicateurs (hydroethidium; HEt) pour les espèces d'oxygène réactives, nous avons essayé de refléter des espèces d'oxygène réactives dans le dans le modèle de vivo l'utilisation 5-(et 6)-chloromethyl-2', 7 '-dichlorodihydrofluorescein diacetate, l'acétyle ester (le CM-H2DCFDA). Un nerf optique de Longs-Evans rats a été écrasé intraorbitalement, en épargnant la circulation retinal. Dans certains rats colliculi supérieur de Longs rats Evans avait été auparavant exposé via craniotomy et surposé avec Gelfoam saturé avec le vert indocyanine (ICG). Aux points de temps variables les animaux ont été injectés intraveineusement ou intravitreally avec HEt ou le CM-H2DCFDA et reflétés avec fluorescein et-ou les filtres d'ICG en utilisant le HRA2. Les résultats: Nous avons démontré le foyer brillant multiple de fluorescence dans la couche de cellule de ganglion quand nous avons rétrogradement étiqueté d'ICG bilatéralement, en indiquant qu'ICG était un colorant rétrogradement transporté qui pourrait être découvert avec le HRA2. Après axotomy et l'injection intravitreal de CM-H2DCFDA, il y avait la fluorescence brillante dans le canal fluorescein dans quelques cellules dans la couche de cellule de ganglion, en accord avec la production d'une ou plusieurs espèces d'oxygène réactives. Les conclusions : RGCs peut être identifié et les niveaux d'espèces d'oxygène réactives mesurés en utilisant une fréquence double confocal Mots-clés : cellules ganglionnaires de la rétine; especes oxygenique radiculaire; la visualisation;

Régulation de la lipoprotéine lipase macrophagique et de LOX-1 par des facteurs métaboliques. Implications dans l’athérosclérose associée au diabète de type 2.

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la principale cause de décès dans les pays occidentaux et constituent la principale complication associée au diabète. La lipoprotéine lipase (LPL) est une enzyme clé du métabolisme des lipides et est responsable de l'hydrolyse des lipoprotéines riches en triglycérides (TG). Plusieurs études ont démontré que la LPL sécrétée par les macrophages dans la paroi artérielle est pro-athérogénique. La dysfonction endothéliale caractérise les stades précoces du processus athérosclérotique. Il a été observé qu’un récepteur nouvellement identifié des lipoprotéines de basse densité oxydées (LDLox), le récepteur de type lectine des LDLox (LOX-1), est fortement exprimé dans les lésions athérosclérotiques humaines et dans l’aorte de rats diabétiques, suggérant un rôle clé de LOX-1 dans la pathogénèse de l’athérosclérose diabétique. Au vu du rôle potentiel de la LPL macrophagique et du LOX-1 dans l’athérosclérose associée au diabète de type 2, nous avons évalué la régulation de ces deux molécules pro-athérogéniques par des facteurs métaboliques et inflammatoires augmentés dans le diabète, soit la leptine, l’acide linoléique (LA) et la protéine C-réactive (CRP). Nos résultats démontrent que : 1) Dans les cellules endothéliales aortiques humaines (HAECs), LA augmente l’expression protéique de LOX-1 de façon temps- et dose-dépendante; 2) La pré-incubation de HAECs avec des antioxydants et des inhibiteurs de la NADPH oxydase, de la protéine kinase C (PKC) et du facteur nucléaire-kappa B (NF-kB), inhibe l’effet stimulant de LA sur l’expression protéique de LOX-1; 3) Dans les HAECs traitées avec LA, on observe une augmentation d’expression des isoformes classiques de la PKC; 4) LA augmente de manière significative l’expression génique de LOX-1 ainsi que la liaison des protéines nucléaires extraites des HAECs à la séquence régulatrice NF-kB présente dans le promoteur du gène de LOX-1; 5) LA augmente, via LOX-1, la captation des LDLox par les cellules endothéliales. Pris dans leur ensemble, ces résultats démontrent que LA augmente l’expression endothéliale de LOX-1 in vitro et appuient le rôle clé de LA dans la dysfonction endothéliale associée au diabète. Au vu de nos études antérieures démontrant qu’une expression accrue de LPL macrophagique chez les patients diabétiques de type 2 et que l’augmentation de facteurs métaboliques dans cette maladie, soit l’homocystéine (Hcys), les acides gras et les produits terminaux de glycation (AGE), accroissent l’expression de la LPL macrophagique, nous avons par la suite déterminé l’effet, in vitro, de deux autres facteurs métaboliques et inflammatoires surexprimés dans le diabète, soit la leptine et la CRP, sur l’expression de la LPL macrophagique. Les concentrations plasmatiques de leptine sont élevées chez les patients diabétiques et sont associées à un accroissement des risques cardiovasculaires. Nous avons démontré que : 1) Dans les macrophages humains, la leptine augmente l’expression de la LPL, tant au niveau génique que protéique; 2) L’effet stimulant de la leptine sur la LPL est aboli par la pré-incubation avec un anticorps dirigé contre les récepteurs à la leptine (Ob-R), des inhibiteurs de la PKC et des antioxydants; 3) La leptine augmente l’expression membranaire des isoformes classiques de la PKC et la diminution de l’expression endogène de la PKC, abolit l’effet de la leptine sur l’expression de la LPL macrophagique; 4) Dans les macrophages murins, la leptine augmente le taux de synthèse de la LPL et augmente la liaison de protéines nucléaires à la séquence protéine activée-1 (AP-1) du promoteur du gène de la LPL. Ces observations supportent la possibilité que la leptine puisse représenter un facteur stimulant de la LPL macrophagique dans le diabète. Finalement, nous avons déterminé, in vitro, l’effet de la CRP sur l’expression de la LPL macrophagique. La CRP est une molécule inflammatoire et un puissant prédicteur d’événements cardiovasculaires. Des concentrations élevées de CRP sérique sont documentées chez les patients diabétiques de type 2. Nous avons démontré que : 1) Dans les macrophages humains, la CRP augmente l’expression de la LPL au niveau génique et protéique et la liaison de la CRP aux récepteurs CD32 est nécessaire pour médier ses effets; 2) La pré-incubation de macrophages humains avec des antioxydants, des inhibiteurs de la PKC et de la protéine kinase mitogénique activée (MAPK), prévient l’induction de la LPL par la CRP; 3) La CRP augmente l’activité de la LPL, la génération intracellulaire d’espèces radicalaires oxygénées (ROS), l’expression d’isoformes classiques de la PKC et la phosphorylation des kinases extracellulaires régulées 1/2 (ERK 1/2); 4) Les macrophages murins traités avec la CRP démontrent une augmentation de la liaison des protéines nucléaires à la séquence AP-1 du promoteur du gène de la LPL. Ces données suggèrent que la LPL puisse représenter un nouveau facteur médiant les effets délétères de la CRP dans la vasculopathie diabétique. Dans l’ensemble nos études démontrent le rôle clé de facteurs métaboliques et inflammatoires dans la régulation vasculaire de la LPL et du LOX-1 dans le diabète. Nos données suggèrent que la LPL et le LOX-1 puissent représenter des contributeurs clé de l’athérogénèse accélérée associée au diabète chez l’humain. Mots-clés : athérosclérose, maladies cardiovasculaires, diabète de type 2, macrophage, LPL, cellules endothéliales, LOX-1, stress oxydatif, leptine, LA, CRP.

Rôle de l’extrémité C-terminale dans l’expression du canal calcique Cav1.2 à la membrane plasmique

Le canal calcique de type L, Cav1.2, joue un rôle clé dans le couplage excitation-contraction des myocytes ventriculaires. Il a été montré que la sous-unité Cavα1 était sujette à l’épissage alternatif et que ce phénomène pouvait mener à une protéine tronquée en C-terminal au niveau de l’exon 45 (Liao, Yong et al. 2005). D’autres groupes ont étudié différentes délétions au niveau de l’extrémité C-terminale (De Jongh, Warner et al. 1991; Gao, Cuadra et al. 2001). Les courants mesurés dans la configuration cellule entière, était significativement plus grands que le canal « pleine longueur ». Nous avons décidé de tester certaines de ces délétions (ΔC2030, ΔC1935, ΔC1856, ΔC1733, ΔC1700) en présence ou en absence de la sous-unité auxiliaire Cavβ3, susceptible d’interagir avec l’extrémité C-terminale de la sous-unité Cavα1 par l’intermédiaire de son domaine SH3 (Lao, Kobrinsky et al. 2008). Les résultats obtenus dans les ovocytes de Xénope ont mis en évidence que les sous-unités Cavα1.2 tronquées montraient des courants globaux plus élevés que le canal « pleine longueur » en présence de la sous-unité auxiliaire Cavβ3 et que les sous-unités Cavα1.2 tronquées donnaient des courants en absence de la sous-unité Cavβ3 contrairement à la sous-unité Cavα1.2 « pleine longueur ». Afin de vérifier si l’augmentation des courants macroscopiques était le résultat d’une augmentation du nombre de sous-unités Cavα1.2 à la membrane, nous avons choisi de quantifier la fluorescence spécifiquement due à cette sous-unité en utilisant la méthode de cytométrie de flux (FACS : « Fluorescence Activated Cell Sorting »). L’épitope HA a été inséré dans une région extracellulaire de la sous-unité Cavα1 du canal calcique Cav1.2 et un anticorps anti-HA couplé au FITC (« Fluorescein IsoThioCyanate ») a été utilisé pour observer la fluorescence. Nos résultats confirment que la sous-unité Cavα1-HA du canal calcique Cav1.2, s’exprime à la membrane plasmique en présence de la sous-unité auxiliaire Cavβ3, et qu’en absence de celle-ci, ne s’exprime que peu ou pas à la membrane. Les mêmes résultats ont été obtenus pour les trois délétions testées dans les mêmes conditions soit Cavα1.2-HA ΔC1935, Cavα1.2-HA ΔC1856 et Cavα1.2-HA ΔC1733. Ensemble, ces résultats suggèrent que l’augmentation des courants macroscopiques observés après une délétion partielle du C-terminal n’est pas causée par une augmentation du nombre de protéines Cavα1.2 à la membrane.

Modification d'acides biliaires à l'aide de polymères pour en moduler les propriétés d'agrégation

Les polymères amphiphiles sont largement utilisés pour les applications biomédicales et pharmaceutiques. Afin d’améliorer les chances de biocompatibilité des nouveaux polymères que nous voulons développer, nous avons utilisé des composés naturels, les acides biliaires, comme produits de départ dans la synthèse de ces polymères. De nouveaux polymères anioniques amphiphiles dérivés de l’acide cholique ont été préparés par polymérisation radicalaire par transfert d’atomes. Par un contrôle rigoureux des conditions de polymérisation, des bras de poly(acide acrylique) de différentes longueurs ont été greffés sur le squelette de l’acide cholique. L’architecture moléculaire des polymères a été étudiée par spectroscopie 1H RMN et par spectrométrie de masse. Ces polymères en étoile formés par l’acide biliaire modifié sont capables de s’agréger dans l’eau même si les groupements hydroxyles ont été remplacés par des segments plus volumineux. Il a été observé que les liaisons ester entre le polymère et le cœur d’acide cholique sont sensibles à l’hydrolyse en solution aqueuse. Pour remédier au problème de stabilité en solution aqueuse et pour avoir, en même temps, des bras hydrophiles non ioniques et biocompatibles, de l’oxyde d’éthylène a été polymérisé sur l’acide cholique par polymérisation anionique. Les liaisons éther formées entre le polymère et les groupements hydroxyles de l’acide biliaire sont plus stables que les liaisons ester sur le polymère de poly(acide acrylique). Les conditions de réaction de la polymérisation anionique ont été optimisées et ont donné des polymères aux architectures et aux masses molaires contrôlées. Les nouveaux polymères forment des agrégats sphériques tel qu’observé par microscopie électronique à transmission avec des échantillons préparés par la méthode de fracture à froid. Leur morphologie est différente de celle des agrégats cylindriques formés par les acides biliaires. Avec la méthode optimisée pour la polymérisation anionique, l’éther d’allyle et glycidyle a été polymérisé sur un dérivé d’acide cholique, suivi par une thiolation des liaisons doubles pour introduire l’amine ou l’acide sur la chaîne polymère. Cette addition radicalaire est efficace à plus de 90%. Les polymères qui en résultent sont solubles dans l’eau et s’agrègent à une certaine concentration critique. Il est particulièrement intéressant d’observer la thermosensibilité des polymères ayant des groupements amine, laquelle peut être modulée en acétylant partiellement les amines, donnant des points nuages entre 15 et 48°C.

Développement de méthodes analytiques de séparation des produits de digestion enzymatique des dérivés de cellulose

La cellulose et ses dérivés sont utilisés dans un vaste nombre d’applications incluant le domaine pharmaceutique pour la fabrication de médicaments en tant qu’excipient. Différents dérivés cellulosiques tels que le carboxyméthylcellulose (CMC) et l’hydroxyéthylcellulose (HEC) sont disponibles sur le commerce. Le degré de polymérisation et de modification diffèrent énormément d’un fournisseur à l’autre tout dépendamment de l’origine de la cellulose et de leur procédé de dérivation, leur conférant ainsi différentes propriétés physico-chimiques qui leurs sont propres, telles que la viscosité et la solubilité. Notre intérêt est de développer une méthode analytique permettant de distinguer la différence entre deux sources d’un produit CMC ou HEC. L’objectif spécifique de cette étude de maitrise était l’obtention d’un profil cartographique de ces biopolymères complexes et ce, par le développement d’une méthode de digestion enzymatique donnant les oligosaccharides de plus petites tailles et par la séparation de ces oligosaccharides par les méthodes chromatographiques simples. La digestion fut étudiée avec différents paramètres, tel que le milieu de l’hydrolyse, le pH, la température, le temps de digestion et le ratio substrat/enzyme. Une cellulase de Trichoderma reesei ATCC 26921 fut utilisée pour la digestion partielle de nos échantillons de cellulose. Les oligosaccharides ne possédant pas de groupements chromophores ou fluorophores, ils ne peuvent donc être détectés ni par absorbance UV-Vis, ni par fluorescence. Il a donc été question d’élaborer une méthode de marquage des oligosaccharides avec différents agents, tels que l’acide 8-aminopyrène-1,3,6-trisulfonique (APTS), le 3-acétylamino-6-aminoacridine (AA-Ac) et la phénylhydrazine (PHN). Enfin, l’utilisation de l’électrophorèse capillaire et la chromatographie liquide à haute performance a permis la séparation des produits de digestion enzymatique des dérivés de cellulose. Pour chacune de ces méthodes analytiques, plusieurs paramètres de séparation ont été étudiés.

Marquage fluorescent des protéines pour étudier les enzymes protéolytiques solubles et immobilisées par la cartographie peptidique électrophorétique

La cartographie peptidique est une méthode qui permet entre autre d’identifier les modifications post-traductionnelles des protéines. Elle comprend trois étapes : 1) la protéolyse enzymatique, 2) la séparation par électrophorèse capillaire (CE) ou chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) des fragments peptidiques et 3) l’identification de ces derniers. Cette dernière étape peut se faire par des méthodes photométriques ou par spectrométrie de masse (MS). Au cours de la dernière décennie, les enzymes protéolytiques immobilisées ont acquis une grande popularité parce qu’elles peuvent être réutilisées et permettent une digestion rapide des protéines due à un rapport élevé d’enzyme/substrat. Pour étudier les nouvelles techniques d’immobilisation qui ont été développées dans le laboratoire du Professeur Waldron, la cartographie peptidique par CE est souvent utilisée pour déterminer le nombre total de peptides détectés et leurs abondances. La CE nous permet d’avoir des séparations très efficaces et lorsque couplée à la fluorescence induite par laser (LIF), elle donne des limites de détection qui sont 1000 fois plus basses que celles obtenues avec l’absorbance UV-Vis. Dans la méthode typique, les peptides venant de l’étape 1) sont marqués avec un fluorophore avant l’analyse par CE-LIF. Bien que la sensibilité de détection LIF puisse approcher 10-12 M pour un fluorophore, la réaction de marquage nécessite un analyte dont la concentration est d’au moins 10-7 M, ce qui représente son principal désavantage. Donc, il n’est pas facile d’étudier les enzymes des peptides dérivés après la protéolyse en utilisant la technique CE-LIF si la concentration du substrat protéique initial est inférieure à 10-7 M. Ceci est attribué à la dilution supplémentaire lors de la protéolyse. Alors, afin d’utiliser le CE-LIF pour évaluer l’efficacité de la digestion par enzyme immobilisée à faible concentration de substrat,nous proposons d’utiliser des substrats protéiques marqués de fluorophores pouvant être purifiés et dilués. Trois méthodes de marquage fluorescent de protéine sont décrites dans ce mémoire pour étudier les enzymes solubles et immobilisées. Les fluorophores étudiés pour le marquage de protéine standard incluent le naphtalène-2,3-dicarboxaldéhyde (NDA), la fluorescéine-5-isothiocyanate (FITC) et l’ester de 6-carboxyfluorescéine N-succinimidyl (FAMSE). Le FAMSE est un excellent réactif puisqu’il se conjugue rapidement avec les amines primaires des peptides. Aussi, le substrat marqué est stable dans le temps. Les protéines étudiées étaient l’-lactalbumine (LACT), l’anhydrase carbonique (CA) et l’insuline chaîne B (INB). Les protéines sont digérées à l’aide de la trypsine (T), la chymotrypsine (CT) ou la pepsine (PEP) dans leurs formes solubles ou insolubles. La forme soluble est plus active que celle immobilisée. Cela nous a permis de vérifier que les protéines marquées sont encore reconnues par chaque enzyme. Nous avons comparé les digestions des protéines par différentes enzymes telles la chymotrypsine libre (i.e., soluble), la chymotrypsine immobilisée (i.e., insoluble) par réticulation avec le glutaraldéhyde (GACT) et la chymotrypsine immobilisée sur billes d’agarose en gel (GELCT). Cette dernière était disponible sur le marché. Selon la chymotrypsine utilisée, nos études ont démontré que les cartes peptidiques avaient des différences significatives selon le nombre de pics et leurs intensités correspondantes. De plus, ces études nous ont permis de constater que les digestions effectuées avec l’enzyme immobilisée avaient une bonne reproductibilité. Plusieurs paramètres quantitatifs ont été étudiés afin d’évaluer l’efficacité des méthodes développées. La limite de détection par CE-LIF obtenue était de 3,010-10 M (S/N = 2,7) pour la CA-FAM digérée par GACT et de 2,010-10 M (S/N = 4,3) pour la CA-FAM digérée par la chymotrypsine libre. Nos études ont aussi démontrées que la courbe d’étalonnage était linéaire dans la région de travail (1,0×10-9-1,0×10-6 M) avec un coefficient de corrélation (R2) de 0,9991.

Poly(ethylene-co-acrylic acid) random copolymers : amphiphilic properties and self-assembly in aqueous medium

Les travaux de recherche présentés ici avaient pour objectif principal la synthèse de copolymères statistiques à base d’éthylène et d’acide acrylique (AA). Pour cela, la déprotection des groupements esters d’un copolymère statistique précurseur, le poly(éthylène-co-(tert-butyl)acrylate), a été effectuée par hydrolyse à l’aide d’iodure de triméthylsilyle. La synthèse de ce précurseur est réalisée par polymérisation catalytique en présence d’un système à base de Palladium (Pd). Le deuxième objectif a été d’étudier et de caractériser des polymères synthétisés à l’état solide et en suspension colloïdale. Plusieurs copolymères précurseurs comprenant différents pourcentages molaires en tert-butyl acrylate (4 à 12% molaires) ont été synthétisés avec succès, puis déprotégés par hydrolyse pour obtenir des poly(éthylène-coacide acrylique) (pE-co-AA) avec différentes compositions. Seuls les copolymères comprenant 10% molaire ou plus de AA sont solubles dans le Tétrahydrofurane (THF) et uniquement dans ce solvant. De telles solutions peuvent être dialysées dans l’eau, ce qui conduit à un échange lent entre cette dernière et le THF, et l’autoassemblage du copolymère dans l’eau peut ensuite être étudié. C’est ainsi qu’ont pu être observées des nanoparticules stables dans le temps dont le comportement est sensible au pH et à la température. Les polymères synthétisés ont été caractérisés par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) ainsi que par spectroscopie Infra-Rouge (IR), avant et après déprotection. Les pourcentages molaires d’AA ont été déterminés par combinaison des résultats de RMN et ii de titrages conductimètriques. A l’état solide, les échantillons ont été analysés par Calorimétrie différentielle à balayage (DSC) et par Diffraction des rayons X. Les solutions colloïdales des polymères pE-co-AA ont été caractérisées par Diffusion dynamique de la lumière et par la DSC-haute sensibilité. De la microscopie électronique à transmission (TEM) a permis de visualiser la forme et la taille des nanoparticules.

Complexes pinceurs de type POCOP de Nickel (II) : synthèse, caractérisation, réactivité et applications catalytiques

Ce mémoire décrit la synthèse, la caractérisation spectroscopique et l’étude de la réactivité catalytique d’une nouvelle série de complexes pinceurs de Ni(II) formés à partir du ligand POCOPPh (P,C,P-2,6-{Ph2PO}2C6H4), très peu étudié dans le cas du nickel. Les études décrites dans ce mémoire examinent l’effet des substituants des phosphines sur les propriétés spectroscopiques et électrochimiques ainsi que les activités catalytiques. La synthèse du ligand a été améliorée par rapport à la procédure connue dans la littérature en diminuant le temps de réaction à 30 min et la température jusqu'à température ambiante. Les composés pinceur (P,C,P-2,6-{Ph2PO}2C6H3)NiX ont été obtenus avec des rendements variant entre 60% et 88%. Le premier complexe a été synthétisé en faisant réagir le précurseur NiBr2(NCCH3)x avec le ligand POCOPPh pour donner (POCOPPh)NiBr. Ce dernier réagit par la suite avec les sels d’argent et de potassium pour donner 4 nouveaux complexes soient : (POCOPPh)NiCN, (POCOPPh)NiOTf, (POCOPPh)NiOAc et (POCOPPh)NiONO2 (OTf = triflate et OAc = acetate). Vu la réactivité limitée du dérivé bromure, le dérivé (POCOPPh)NiOTf a été utilisé pour la préparation du composé (POCOPPh)NiCCPh. Le dérivé Ni-OTf a été utilisé également pour la synthèse des complexes (POCOPPh)NiR qui ont été détectés par RMN. Ces complexes (POCOPPh)NiR ont montré une stabilité trop faible et donnent des nouveaux complexes de type (POCOPPh)NiX en échangeant l’halogène avec le Mg ou de type (POCOPPh)NiOH en s’hydrolysant. Les espèces cationiques [(POCOPPh)NiNCR][OTf] (R= Me, CHCH2, CHCHMe, C(Me)CH2, NCCH2CH2N(Ph)H) ont été obtenues facilement et avec des bon rendements à partir du (POCOPPh)NiOTf. Tous les composés obtenus ont été caractérisés par la spectroscopie RMN (1H, 13C{1H}, 31P{1H}, 19F{1H}), la spectroscopie IR et la spectroscopie UV-vis. L’analyse élémentaire et l’analyse par la diffraction des rayons X, dont le but est de résoudre la structure à l’état solide, ont été utilisées pour la plupart des complexes. Des études de voltampérométrie cyclique ont été menées pour déterminer la densité électronique des centres métalliques et l’effet des phosphines sur cette propriété électrochimique. Dans le but de déterminer l’effet des substituants des phosphines sur l’activité catalytique des complexes, nous avons évalué les réactivités catalytiques des deux complexes (POCOPPh)NiOTf et (POCOPi-Pr)NiOTf dans la réaction d’hydroamination des oléfines activés et plus spécifiquement l’acrylonitrile. Après optimisation des conditions expérimentales, on a constaté que la réactivité des deux composés sont similaires mais une grande différence apparaît après l’ajout des additifs. En effet, le complexe (POCOPi-Pr)NiOTf donne une bonne activité catalytique en présence de la triéthylamine, tandis que cette activité diminue considérablement en présence d’eau, contrairement au complexe (POCOPPh)NiOTf qui est plus actif en présence d’eau. Dans le cas du complexe (POCOPPh)NiOTf, on a pu montrer que la base se coordonne au nickel dans le produit formé après la réaction d’hydroamination, ce qui diminue l’activité de ce complexe dans certains cas. Également on a exploré la réaction de l’addition du lien O-H sur l’acrylonitrile, et étonnamment le complexe (POCOPPh)NiOTf est beaucoup plus actif que son homologue (POCOPi-Pr)NiOTf dans le cas des alcools aromatiques. Par contre, les alcools aliphatiques restent un défi majeur pour ce genre de complexe. Le mécanisme de cette réaction qui a été proposé montre que l’alcoolyse passe par les deux intermédiaires (POCOPPh)NiOAr et [(POCOPPh)NiOAr][HOAr] mais l’isolation de ces intermédiaires observés par RMN semble être difficile.

Monoacylglycerol as a metabolic coupling factor in glucose-stimulated insulin secretion

Les cellules beta pancréatiques sécrètent l’insuline lors d’une augmentation post-prandiale du glucose dans le sang. Ce processus essentiel est contrôlé par des facteurs physiologiques, nutritionnels et pathologiques. D’autres sources d’énergie, comme les acides aminés (leucine et glutamine) ou les acides gras potentialisent la sécrétion d’insuline. Une sécrétion d’insuline insuffisante au besoin du corps déclanche le diabète. Le rôle que joue l’augmentation du calcium intracellulaire et les canaux K+/ATP dans la sécrétion d’insuline est bien connu. Bien que le mécanisme exact de la potentialisation de la sécrétion d’insuline par les lipides est inconnu, le cycle Glycérolipides/Acides gras (GL/FFA) et son segment lipolytique ont été reconnu comme un composant essentiel de la potentialisation lipidique de la sécrétion d’insuline. Le diacylglycérol, provenant de la lipolyse, a été proposé comme un signal lipidique important d’amplification. Cependant, l’hydrolyse des triglycérides et des diacylglycérides a été démontrée essentielle pour la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose, en suggérant un rôle du monoacylglycérol (MAG) dans ce processus. Dans cette étude, on démontre que la réduction de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose, lors d’une inhibition de la lipolyse, est restaurée par l’addition de MAG. Dans les cellules beta pancréatiques, le niveau de MAG augmente en présence des concentrations élevées du glucose, et également lorsqu’on inhibe l’enzyme MAG hydrolase abhydrolase-6 (ABHD6) avec l’inhibiteur spécifique WWL70. L’analyse lipidomique a démontré qu’après la stimulation des cellules beta pancréatiques avec le glucose et aussi avec le WWL70, l’espèce la plus accumulée de MAG était le 1-stearoylglycérol (1-SG). L’addition de 1-SG, de 1-palmitoylglycérol (1-PG) ou de WWL70 augmente la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose, et cette augmentation est indépendante de la génération de acides gras à partir de MAG. Cela suggère que le MAG est un signal lipidique pour la potentialisation de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose. De plus, la surexpression du gène d’ABHD6 dans les cellules INS832/13 cause une réduction de la sécrétion d’insuline, due probablement à la diminution des niveaux intracellulaire de MAG. Avec le but de comprendre le mécanisme moléculaire impliqué dans la potentialisation de la sécrétion d’insuline par le MAG, on a bloqué l’action du récepteur vanilloid-1 (TRPV1) liant le MAG par l’agent pharmacologiste, AMG9810. Le traitement des cellules beta pancréatique par AMG9810 entraîne une diminution de la potentialisation de la sécrétion de l’insuline induite par le MAG. Il est a noter que le MAG pourrait activer TRPV1 par une liaison physique dans la membrane cellulaire interne; ce qui entraînerai l’entrée du calcium dans la cellule, et ensuite la stimulation de l’exocytose des granules à insuline. En soutien de cette hypothèse, on a trouvé une diminution du calcium intracellulaire lorsqu’on traite au AMG9810 des cellules beta pancréatique de rat (provenant des îlots dispersés) stimulées au glucose et au WWL70. L’ensemble des résultats suggère que le MAG est un médiateur de la potentialisation lipidique de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose. Vu que l’inhibition pharmacologique d’ABHD6 augmente la sécrétion d’insuline, on pourra conclure que cette enzyme représente une cible thérapeutique potentielle dans le développement des médicaments anti-diabétiques, visant une augmentation de la sécrétion d’insuline.

Anaerobic Digestibility of Microalgae : Fate and Limitations of Long Chain Fatty Acids in the Biodegradation of Lipids

La digestion anaérobie est un processus biologique dans lequel un consortium microbien complexe fonctionnant en absence d’oxygène transforme la matière organique en biogaz, principalement en méthane et en dioxyde de carbone. Parmi les substrats organiques, les lipides sont les plus productifs de méthane par rapport aux glucides et aux protéines; mais leur dégradation est très difficile, en raison de leur hydrolyse qui peut être l’étape limitante. Les algues peuvent être une source importante pour la production de méthane à cause de leur contenu en lipides potentiellement élevé. L’objectif de cette étude était, par conséquent, d’évaluer la production en méthane des microalgues en utilisant la technique du BMP (Biochemical méthane Potential) et d’identifier les limites de biodégradion des lipides dans la digestion anaérobie. Le plan expérimental a été divisé en plusieurs étapes: 1) Comparer le potentiel énergétique en méthane des macroalgues par rapport aux microalgues. 2) Faire le criblage de différentes espèces de microalgues d’eau douce et marines afin de comparer leur potentiel en méthane. 3) Déterminer l'impact des prétraitements sur la production de méthane de quelques microalgues ciblées. 4) Identifier les limites de biodégradation des lipides algaux dans la digestion anaérobie, en étudiant les étapes limitantes de la cinétique des lipides et de chacun des acides gras à longues chaines. Les résultats ont montré que les microalgues produisent plus de méthane que les macroalgues. Les BMP des microalgues d'eau douce et marines n'ont montré aucune différence en termes de rendement en méthane. Les résultats des prétraitements ont montré que le prétraitement thermique (microonde) semblait être plus efficace que le prétraitement chimique (alcalin). Les tests de contrôle du BMP faits sur l'huile de palme, l’huile de macadamia et l'huile de poisson ont montré que l'hydrolyse des huiles en glycérol et en acides gras à longues chaines n'était pas l'étape limitante dans la production de méthane. L'ajout de gras dans les échantillons de Phaeodactylum dégraissée a augmenté le rendement de méthane et cette augmentation a été corrélée à la quantité de matières grasses ajoutées.

Le rôle des apoB-lipoprotéines sur la clairance des gras dans le tissu adipeux blanc sous-cutané humain

OBJECTIF: La mauvaise clairance des lipoprotéines riches en triglycérides par le tissu adipeux blanc (TAB) entraîne l’hypertriglycéridémie, la résistance à l’insuline et la sécrétion hépatique d’apolipoprotéine B (apoB). Ce mémoire tente de déterminer si le LDL entraîne une clairance réduite des lipoprotéines riches en triglycérides par le TAB. MÉTHODES/RÉSULTATS: Suivant l’ingestion d’un repas riche en gras marqué à la trioléine-13C, des femmes obèses postménopausées avec apoB plasmatique élevé (> médiane 0.93 g/L, N=22, 98% sous forme de IDL/LDL) avaient une clairance réduite de triglycérides-13C et acides gras non-estérifiés-13C (AGNE), comparées à celles avec un apoB plus bas. L'aire sous la courbe à 6 heures des triglycérides-13C et AGNE-13C plasmatiques corrélait avec l'apoB, suggérant une moindre captation dans les tissus périphériques chez les femmes avec apoB élevé. Ex vivo, suivant une incubation de 4 heures de biopsies de TAB avec de la trioléine-3H, l’apoB des patientes corrélait négativement avec les lipides-3H intracellulaires. Le traitement des biopsies de TAB des participantes avec leur propre LDL menait à une réduction de l’hydrolyse et de la captation de la trioléine-3H et à l’accumulation d’AGNE-3H dans le médium. In vitro, le LDL inhibait l’activité de la LPL. De plus, les adipocytes 3T3-L1 différenciés en présence de LDL avaient une hydrolyse et une captation réduite des lipoprotéines riches en trioléine-3H. CONCLUSION: Ce mémoire suggère que le LDL diminue la clairance des lipoprotéines riches en triglycérides par le TAB humain, ce qui pourrait expliquer la résistance à l’insuline observée chez des sujets avec apoB élevé.

Hydrolyse assistée par micro-ondes : synthèse de cystéines a-substituées sur échelle multi-grammes; Synthèse catalytique énantiosélective d’alkylidènecyclopropanes 1,1-di-accepteurs

Le présent mémoire est subdivisé en deux principaux sujets. Le premier porte sur le développement d’une hydrolyse de thiazolidines assistée par micro-ondes en vue d’obtenir des cystéines a-substituées. Le second est axé sur le développement d’une méthodologie pour la synthèse catalytique énantiosélective d’alkylidènecyclopropanes 1,1-di-accepteurs. Dans un premier temps, les rôles et les utilités des acides aminés quaternaires, plus spécifiquement des cystéines a-substituées, seront abordés, puis une revue des différentes méthodes énantiosélectives pour accéder à ces unités sera effectuée. Par la suite, le développement d’une méthode rapide et efficace d’hydrolyse sous irradiation aux micro-ondes de thiazolines sera présenté. Finalement, les études menant à l’application de cette méthode à la synthèse de cystéines -substituées sur grande échelle au moyen de réacteurs en écoulement dynamique et à haut criblage seront détaillées. Dans la seconde partie, les applications ainsi que les synthèses générales des alkylidènecyclopropanes en synthèse organique seront décrites. Plus particulièrement, les applications spécifiques des alkylidènecyclopropanes 1,1-di-accepteurs ainsi que leurs synthèses seront traitées de manière exhaustive. Par la suite, le développement d’une méthodologie énantiosélective catalytique pour la synthèse d’alkylidènecyclopropanes 1,1-di-accepteurs sera présenté. L’extension de cette méthodologie à la synthèse de dérivés cyclopropanes et cyclopropènes, ainsi que l’application de réactions stéréospécifiques pour les alkylidènecyclopropanes 1,1-di-accepteurs seront brièvement discutées.

High-amylose carboxymethyl starch matrices for oral sustained drug-release : in vitro and in vivo evaluation

Les amidons non modifiées et modifiés représentent un groupe d’excipients biodégradables et abondants particulièrement intéressant. Ils ont été largement utilisés en tant qu’excipients à des fins diverses dans des formulations de comprimés, tels que liants et/ou agents de délitement. Le carboxyméthylamidon sodique à haute teneur en amylose atomisé (SD HASCA) a été récemment proposé comme un excipient hydrophile à libération prolongée innovant dans les formes posologiques orales solides. Le carboxyméthylamidon sodique à haute teneur en amylose amorphe (HASCA) a d'abord été produit par l'éthérification de l'amidon de maïs à haute teneur en amylose avec le chloroacétate. HASCA a été par la suite séché par atomisation pour obtenir le SD HASCA. Ce nouvel excipient a montré des propriétés présentant certains avantages dans la production de formes galéniques à libération prolongée. Les comprimés matriciels produits à partir de SD HASCA sont peu coûteux, simples à formuler et faciles à produire par compression directe. Le principal objectif de cette recherche était de poursuivre le développement et l'optimisation des comprimés matriciels utilisant SD HASCA comme excipient pour des formulations orales à libération prolongée. A cet effet, des tests de dissolution simulant les conditions physiologiques du tractus gastro-intestinal les plus pertinentes, en tenant compte de la nature du polymère à l’étude, ont été utilisés pour évaluer les caractéristiques à libération prolongée et démontrer la performance des formulations SD HASCA. Une étude clinique exploratoire a également été réalisée pour évaluer les propriétés de libération prolongée de cette nouvelle forme galénique dans le tractus gastro-intestinal. Le premier article présenté dans cette thèse a évalué les propriétés de libération prolongée et l'intégrité physique de formulations contenant un mélange comprimé de principe actif, de chlorure de sodium et de SD HASCA, dans des milieux de dissolution biologiquement pertinentes. L'influence de différentes valeurs de pH acide et de temps de séjour dans le milieu acide a été étudiée. Le profil de libération prolongée du principe actif à partir d'une formulation de SD HASCA optimisée n'a pas été significativement affecté ni par la valeur de pH acide ni par le temps de séjour dans le milieu acide. Ces résultats suggèrent une influence limitée de la variabilité intra et interindividuelle du pH gastrique sur la cinétique de libération à partir de matrices de SD HASCA. De plus, la formulation optimisée a gardé son intégrité pendant toute la durée des tests de dissolution. L’étude in vivo exploratoire a démontré une absorption prolongée du principe actif après administration orale des comprimés matriciels de SD HASCA et a montré que les comprimés ne se sont pas désintégrés en passant par l'estomac et qu’ils ont résisté à l’hydrolyse par les α-amylases dans l'intestin. Le deuxième article présente le développement de comprimés SD HASCA pour une administration orale une fois par jour et deux fois par jour contenant du chlorhydrate de tramadol (100 mg et 200 mg). Ces formulations à libération prolongée ont présenté des valeurs de dureté élevées sans nécessiter l'ajout de liants, ce qui facilite la production et la manipulation des comprimés au niveau industriel. La force de compression appliquée pour produire les comprimés n'a pas d'incidence significative sur les profils de libération du principe actif. Le temps de libération totale à partir de comprimés SD HASCA a augmenté de manière significative avec le poids du comprimé et peut, de ce fait, être utilisé pour moduler le temps de libération à partir de ces formulations. Lorsque les comprimés ont été exposés à un gradient de pH et à un milieu à 40% d'éthanol, un gel très rigide s’est formé progressivement sur leur surface amenant à la libération prolongée du principe actif. Ces propriétés ont indiqué que SD HASCA est un excipient robuste pour la production de formes galéniques orales à libération prolongée, pouvant réduire la probabilité d’une libération massive de principe actif et, en conséquence, des effets secondaires, même dans le cas de co-administration avec une forte dose d'alcool. Le troisième article a étudié l'effet de α-amylase sur la libération de principe actif à partir de comprimés SD HASCA contenant de l’acétaminophène et du chlorhydrate de tramadol qui ont été développés dans les premières étapes de cette recherche (Acetaminophen SR et Tramadol SR). La modélisation mathématique a montré qu'une augmentation de la concentration d’α-amylase a entraîné une augmentation de l'érosion de polymère par rapport à la diffusion de principe actif comme étant le principal mécanisme contrôlant la libération de principe actif, pour les deux formulations et les deux temps de résidence en milieu acide. Cependant, même si le mécanisme de libération peut être affecté, des concentrations d’α-amylase allant de 0 UI/L à 20000 UI/L n'ont pas eu d'incidence significative sur les profils de libération prolongée à partir de comprimés SD HASCA, indépendamment de la durée de séjour en milieu acide, le principe actif utilisé, la teneur en polymère et la différente composition de chaque formulation. Le travail présenté dans cette thèse démontre clairement l'utilité de SD HASCA en tant qu'un excipient à libération prolongée efficace.

A study of chymotrypsin immobilization conditions for improved peptide mapping

La cartographie peptidique est une technique de grande importance utilisée lors de l’identification des protéines et la caractérisation des modifications post-traductionnelles des protéines. Deux méthodes sont utilisées afin de couper les protéines en peptides pour la cartographie : les méthodes chimiques et les méthodes enzymatiques. Dans ce projet, l’enzyme chymotrypsine a été utilisée pour l’hydrolyse (la digestion) des liens peptidiques. Cependant, l’autoprotéolyse des enzymes peut augmenter la complexité des échantillons, rendant ainsi ardue l’obtention de pics résolus suite à l’apparition de pics non-désirés dans la carte peptidique. Par conséquent, nous avons utilisé la réticulation des enzymes protéolytiques par réaction avec le glutaraldéhyde (GA) donnant une enzyme insoluble afin de réduire l’autoprotéolyse. L’immobilisation de la chymotrypsine par GA a été effectuée selon une méthode rapportée précédemment par le groupe Waldron. L’électrophorèse capillaire (CE) couplée à l’absorption UV-visible a été utilisée pour la séparation et la détection de peptides et pour obtenir ainsi une cartographie peptidique. Deux tampons différents ont été évalués afin d’obtenir les meilleures conditions pour la digestion de substrats protéiques par la chymotrypsine libre (soluble) ou la GAchymotrypsine et l’analyse par CE. Les cartes des peptides autoprotéolytiques ont été comparées entre les deux formats de chymotrypsine. Afin d’améliorer la cartographie peptidique, nous avons évalué trois méthodes de conditionnement du capillaire CE et deux méthodes pour stopper la digestion. Le bicarbonate d’ammonium s’est avéré être le tampon optimal pour la digestion en solution et l’utilisation d’un bain d’acétone et de glace sèche s’est avérée être la méthode optimale pour stopper la digestion. Une solution de SDS, 25 mM, dans l’étape de rinçage a été utilisée après chaque analyse CE et a permis d’améliorer la résolution des cartes peptidiques. La comparaison entre l’autoprotéolyse de la chymotrypsine libre et de celle immobilisé par GA a été effectuée par des tests utilisant une gamme de six différentes combinaisons de conditions afin d’évaluer le temps (30 et 240 min) et la température de digestion (4, 24 et 37°C). Dans ces conditions, nos résultats ont confirmé que le GA-chymotrypsine réduit l’autoprotéolyse par rapport à l’enzyme libre. La digestion (à 37°C/240 min) de deux substrats modèles par la chymotrypsine libre et immobilisée en fonction de la température de dénaturation du substrat a été étudiée. iii Avant la digestion, les substrats (l’albumine de sérum bovine, BSA, et la myoglobine) ont été dénaturés par chauffage pendant 45 min à trois températures différentes (60, 75 et 90°C). Les résultats ont démontré que la dénaturation par chauffage du BSA et de la myoglobine n’a pas amélioré la cartographie peptidique pour la GA-chymotrypsine, tandis que la digestion de ceux-ci en présence de la chymotrypsine libre a amélioré de façon quantifiable à des températures élevées. Ainsi, le chauffage du substrat à 90°C avec l’enzyme soluble facilite le dépliement partiel du substrat et sa digestion limitée, ce qui a été mieux pour la myoglobine que pour la BSA.

Synthesis of polyelectrolyte brushes on silica-based substrates through surface-initiated polymerization : brush characterization and responsiveness to variation in pH and ionic strength

Les brosses de polyélectrolytes font l’objet d’une attention particulière pour de nombreuses applications car elles présentent la capacité de changer de conformation et, par conséquent, de propriétés de surface en réponse aux conditions environnementales appliquées. Le contrôle des principaux paramètres de ces brosses telles que l'épaisseur, la composition et l'architecture macromoléculaire, est essentiel pour obtenir des polymères greffés bien définis. Ceci est possible avec la Polymérisation Radicalaire par Transfert d’Atomes - Initiée à partir de la Surface (PRTA-IS), qui permet la synthèse de brosses polymériques de manière contrôlée à partir d’une couche d'amorceurs immobilisés de manière covalente sur une surface. Le premier exemple d’une synthèse directe de brosses de poly(acide acrylique) (PAA) par polymérisation radicalaire dans l’eau a été démontré. Par greffage d’un marqueur fluorescent aux brosses de PAA et via l’utilisation de la microscopie de fluorescence par réflexion totale interne, le dégreffage du PAA en temps réel a pu être investigué. Des conditions environnementales de pH ≥ 9,5 en présence de sel, se sont avérées critiques pour la stabilité de la liaison substrat-amorceur, conduisant au dégreffage du polymère. Afin de protéger de l’hydrolyse cette liaison substrat-amorceur sensible et prévenir le dégreffage non souhaité du polymère, un espaceur hydrophobique de polystyrène (PS) a été inséré entre l'amorceur et le bloc de PAA stimuli-répondant. Les brosses de PS-PAA obtenues étaient stables pour des conditions extrêmes de pH et de force ionique. La réponse de ces brosses de copolymère bloc a été étudiée in situ par ellipsométrie, et le changement réversible de conformation collapsée à étirée, induit par les variations de pH a été démontré. De plus, des différences de conformation provenant des interactions du bloc de PAA avec des ions métalliques de valence variable ont été obtenues. Le copolymère bloc étudié semble donc prometteur pour la conception de matériaux répondant rapidement a divers stimuli. Par la suite, il a été démontré qu’un acide phosphonique pouvait être employé en tant qu’ amorceur PRTA-IS comme alternative aux organosilanes. Cet amorceur phosphonate a été greffé pour la première fois avec succès sur des substrats de silice et une PRTA-IS en milieux aqueux a permis la synthèse de brosses de PAA et de poly(sulfopropyl méthacrylate). La résistance accrue à l’hydrolyse de la liaison Sisubstrat-O- Pamorceur a été confirmée pour une large gamme de pH 7,5 à 10,5 et a permis l’étude des propriétés de friction des brosses de PAA sous différentes conditions expérimentales par mesure de forces de surface. Malgré la stabilité des brosses de PAA à haute charge appliquée, les études des propriétés de friction ne révèlent pas de changement significatif du coefficient de friction en fonction du pH et de la force ionique.