Identification of a novel herpesvirus associated with a penile proliferative lesion in a beluga (Delphinapterus leucas).

The carcass of an adult male beluga (Delphinapterus leucas) was found beach cast in 2008 on the shore of the St. Lawrence Estuary at Rivière-Ouelle, Quebec, Canada. The carcass was transported to the Faculté de médecine vétérinaire of the Université de Montréal for postmortem examination. Aspiration pneumonia was the probable cause of death. Necropsy revealed a focal papilloma-like penile lesion, characterized by focal mucosal thickening with disorganization of the epithelial layers and lymphoplasmacytic infiltration. A pan-herpesvirus nested PCR assay on frozen tissue from the penile lesion was positive. The PCR product sequencing revealed a partial herpesvirus DNA polymerase (DPOL) gene sequence of 600 nucleotides. Its nearest nucleotide identity was with the partial DPOL gene of an alphaherpesvirus, bovine herpesvirus 5 (79.5% identity). It also shared high identity with several other marine mammal herpesviruses (50.2 to 77.3% identity). This new herpesvirus was tentatively named beluga whale herpesvirus (BWHV). Virus isolation was unsuccessful. The pathogenic potential of BWHV is unknown, but the evaluation of archived tissues suggests that the virus is endemic in the St. Lawrence Estuary beluga population.

Identification of a novel herpesvirus associated with cutaneous ulcers in a fisher (Martes pennanti).

On December 8, 2008, a male fisher (Martes pennanti) housed in a quarantine enclosure at the St-Félicien Zoo was found dead with multiple skin ulcers on the muzzle and plantar pads. At necropsy, no major findings were found, and a specific cause of death was not determined microscopically. However, at the borders of ulcerated sites, there were increased numbers of koilocytes, with perinuclear vacuolation and nuclear enlargement. A pan-herpesvirus nested polymerase chain reaction (PCR) assay was conducted, and an expected PCR product of 230 nucleotides was obtained within tissues collected from around the skin ulcers. Other tissues, including intestines and pool of lung, liver, and kidney, tested negative. The obtained PCR amplicon was sequenced and was highly related to the partial viral DNA polymerase (DPOL) gene of Mustelid herpesvirus 1. Virus isolation was negative, and no virion was detected by electron microscopy. The pathogenic potential of this novel herpesvirus and its role in the death of the fisher are unknown.

Élaboration d’un anticorps chimère anti-gp350 comme traitement prophylactique éventuel des syndromes lymphoprolifératifs B chez les greffés

Le virus Epstein-Barr (VEB) est fortement associé au développement de syndromes lymphoprolifératifs (SLP) en greffe pédiatrique. Ce virus a la capacité d’immortaliser les lymphocytes B et de provoquer leur prolifération incontrôlée chez l’hôte immunodéprimé. Plusieurs études démontrent que le cycle lytique du virus jouerait un rôle primordial dans la genèse des SLP en produisant des particules virales pouvant infecter les cellules B adjacentes. Chez un individu immunodéprimé, ces cellules B nouvellement infectées peuvent donner naissance à une expansion lymphocytaire. Le projet présenté dans ce mémoire fait partie d’un programme de recherche visant à élucider le rôle de l’infection productive par le VEB dans le développement des SLP. L’objectif précis de ce projet est de développer un anticorps monoclonal chimère contre la glycoprotéine gp350 du VEB dans le but de neutraliser le virus et d’ainsi prévenir son entrée dans les cellules B. Notre laboratoire a construit une version chimère de l’anticorps monoclonal murin 72A1, lequel se lie à la gp350 et bloque l’infection. Les premiers essais ont révélé la présence de chaînes non fonctionnelles (aberrantes) dans l’hybridome produisant l’anticorps 72A1. La construction de la chaîne légère authentique est maintenant complète alors que celle de la chaîne lourde est toujours en cours. Le processus de caractérisation de l’anticorps chimère inclura des essais de cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps (ADCC). Dans cette optique, une lignée cellulaire exprimant de façon stable la gp350 a été établie. Notre anticorps chimère anti-gp350 pourrait éventuellement être utilisé comme thérapie préventive chez les greffés présentant un risque élevé de SLP en empêchant l’infection des cellules B adjacentes.

Étude de la sortie du virus herpès simplex de type 1 (HSV 1) hors du noyau

Le virus herpès simplex de type 1 (HSV 1) affecte la majorité de la population mondiale. HSV 1 cause de multiples symptômes délétères dont les plus communs sont les lésions orofaciales usuellement appelées feux sauvages. Le virus peut aussi causer des effets plus sérieux comme la cécité ou des troubles neurologiques. Le virus réside de façon permanente dans le corps de son hôte. Malgré l’existence de nombreux traitements pour atténuer les symptômes causés par HSV 1, aucun médicament ne peut éliminer le virus. Dans le but d’améliorer les connaissances concernant le cycle viral de HSV 1, ce projet cible l’étude du transport du virus dans la cellule hôte. Ce projet aura permis la collecte d’informations concernant le modus operandi de HSV 1 pour sortir des compartiments cellulaires où il séjourne. Les différentes expérimentations ont permis de publier 3 articles dont un article qui a été choisi parmi les meilleurs papiers par les éditeurs de « Journal of Virology » ainsi qu’un 4e article qui a été soumis. Premièrement, un essai in vitro reproduisant la sortie de HSV 1 du noyau a été mis sur pied, via l’isolation de noyaux issus de cellules infectées. Nous avons démontré que tout comme dans les cellules entières, les capsides s’évadent des noyaux isolés dans l’essai in vitro en bourgeonnant avec la membrane nucléaire interne, puis en s’accumulant sous forme de capsides enveloppées entre les deux membranes nucléaires pour finalement être relâchées dans le cytoplasme exclusivement sous une forme non enveloppée. Ces observations appuient le modèle de transport de dé-enveloppement/ré-enveloppement. Deuxièmement, dans le but d’identifier des joueurs clefs viraux impliqués dans la sortie nucléaire du virus, les protéines virales associées aux capsides relâchées par le noyau ont été examinées. La morphologie multicouche du virus HSV 1 comprend un génome d’ADN, une capside, le tégument et une enveloppe. Le tégument est un ensemble de protéines virales qui sont ajoutées séquentiellement sur la particule virale. La séquence d’ajout des téguments de même que les sites intracellulaires où a lieu la tégumentation sont l’objet d’intenses recherches. L’essai in vitro a été utilisé pour étudier cette tégumentation. Les données recueillies suggèrent un processus séquentiel qui implique l’acquisition des protéines UL36, UL37, ICP0, ICP8, UL41, UL42, US3 et possiblement ICP4 sur les capsides relâchées par le noyau. Troisièmement, pour obtenir davantage d’informations concernant la sortie de HSV 1 des compartiments membranaires de la cellule hôte, la sortie de HSV 1 du réseau trans golgien (TGN) a aussi été étudiée. L’étude a révélé l’implication de la protéine kinase D cellulaire (PKD) dans le transport post-TGN de HSV 1. PKD est connue pour réguler le transport de petits cargos et son implication dans le transport de HSV 1 met en lumière l’utilisation d’une machinerie commune pour le transport des petits et gros cargos en aval du TGN. Le TGN n’est donc pas seulement une station de triage, mais est aussi un point de rencontre pour différentes voies de transport intracellulaire. Tous ces résultats contribuent à une meilleure compréhension du processus complexe de maturation du virus HSV 1, ce qui pourrait mener au développement de meilleurs traitements pour combattre le virus. Les données amassées concernant le virus HSV 1 pourraient aussi être appliquées à d’autres virus. En plus de leur pertinence dans le domaine de la virologie, les découvertes issues de ce projet apportent également de nouveaux détails au niveau du transport intracellulaire.

Contribution de la Glycoprotéine M dans la Sortie de HSV-1

Le Virus Herpès Simplex de type 1 (HSV-1) est un agent infectieux qui cause l’herpès chez une grande proportion de la population mondiale. L’herpès est généralement considéré comme une maladie bénigne dont la forme la plus commune est l'herpès labial (communément appelé « bouton de fièvre »), mais elle peut se révéler très sérieuse et causer la cécité et l’encéphalite, voir létale dans certain cas. Le virus persiste toute la vie dans le corps de son hôte. Jusqu'à présent, aucun traitement ne peut éliminer le virus et aucun vaccin n’a été prouvé efficace pour contrôler l’infection herpétique. HSV-1 est un virus avec un génome d’ADN bicaténaire contenu dans une capside icosaèdrale entourée d’une enveloppe lipidique. Treize glycoprotéines virales se trouvent dans cette enveloppe et sont connues ou supposées jouer des rôles distincts dans différentes étapes du cycle de réplication viral, incluant l'attachement, l'entrée, l’assemblage, et la propagation des virus. La glycoprotéine M (gM) qui figure parmi ces glycoprotéines d’enveloppe, est la seule glycoprotéine non essentielle mais est conservée dans toute la famille herpesviridae. Récemment, l’homologue de gM dans le Pseudorabies virus (PRV), un autre herpesvirus, a été impliqué dans la phase finale de l’assemblage (i.e. l’enveloppement cytoplasmique) au niveau du réseau trans-Golgi (TGN) en reconnaissant spécifiquement des protéines tégumentaires et d’autres glycoprotéines d’enveloppe ([1]). Toutefois, il a été proposé que cette hypothèse ne s’applique pas pour le HSV-1 ([2]). De plus, contrairement à la localisation au TGN dans les cellules transfectées, HSV-1 gM se localise dans la membrane nucléaire et sur les virions périnucléaires durant une infection. L’objectif du projet présenté ici était d’éclaircir la relation de la localisation et la fonction de HSV-1 gM dans le contexte d’une infection. Dans les résultats rapportés ici, nous décrivons tout abord un mécanisme spécifique de ciblage nucléaire de HSV-1 gM. En phase précoce d’une infection, gM est ciblée à la membrane nucléaire d'une manière virus ii dépendante. Cela se produit avant la réorganisation du TGN normalement induite par l’infection et avant que gM n’entre dans la voie de sécrétion. Ce ciblage nucléaire actif et spécifique de gM ne semble pas dépendre des plusieurs des partenaires d’interaction proposés dans la littérature. Ces données suggèrent que la forme nucléaire de gM pourrait avoir un nouveau rôle indépendant de l’enveloppement final dans le cytoplasme. Dans la deuxième partie du travail présenté ici, nous avons concentré nos efforts sur le rôle de gM dans l’assemblage du virus en phase tardive de l’infection et en identifiant un domaine critique de gM. Nos résultats mettent en valeur l’importance du domaine carboxyl-terminal cytoplasmique de gM dans le transport de gM du réticulum endoplasmique (RE) à l’appareil de Golgi, dans l’enveloppement cytoplasmique et la propagation intercellulaire du virus. Ainsi, l’export du RE de gM a été complètement compromis dans les cellules transfectées exprimant un mutant de gM dépourvu de sa région C-terminale. La délétion la queue cytoplasmique de gM cause une réduction légère du titre viral et de la taille des plaques. L'analyse de ces mutants par microscopie électronique a démontré une accumulation des nucléocapsides sans enveloppe dans le cytoplasme par rapport aux virus de type sauvage. Étrangement, ce phénotype était apparent dans les cellules BHK mais absent dans les cellules 143B, suggérant que la fonction de gM dépende du type cellulaire. Finalement, le criblage de partenaires d’interaction du domaine C-terminal de gM identifiés par le système de double-hybride nous a permis de proposer plusieurs candidats susceptibles de réguler la fonction de gM dans la morphogénèse et la propagation de virus.

Études des mécanismes d’induction de l’immunosuppression par le virus Herpès Humain 6

HHV-6 is a ubiquitous human herpesvirus. Most individuals become infected at the age of 2 years. Primary infection by the virus causes a self-limiting febrile illness called exanthem subitum or roseola. In adults, primary infection may cause mononucleosis-like illnesses. The infection usually remains latent in healthy individuals, but often reactivates in immunocompromised individuals, for example, transplant patients and AIDS patients. The virus has also been associated with cancers and lymphoproliferative disorders. The virus encodes two proteins that interact with p53. However, little is known concerning the impact of the virus on cell cycle progression in human cells. The investigations reported in the thesis were focused on this issue. We show here that that HHV-6 infection delays the cell cycle progression in human T cell line HSB-2, as well as in primary human T cells and causes their accumulation in S and G2/M phase. By degrading the viral DNA in the virus-infected cells, we show that the infected cells accumulate in the G2/M and not in the S phase. We observed an increase in the kinase activity of cdc2 in virus-infected cells despite lower levels of its catalytic partners, cyclin A and cyclin B. We show here that the viral early antigen p41 associates with, and increases the kinase activity of, CDK1. Our studies have shown that there is a drastic reduction of p21 protein, despite the virus-induced stabilization and activation of p53 suggesting that p53 may be transcriptionally inactivated in the virus-infected cells. This decrease of p21 in infected cells was partially restored by proteasome inhibitors. These results suggest that HHV-6 causes perturbations in the normal progression of cell cycle in human T cells. Autophagy is a physiological cell process during which old cellular constituents and long-lived proteins in cells are degraded. This process is regulated in a cell cycle-dependent manner. We show here that infection with HHV-6 induces autophagy in HSB-2 cells. This was shown by the induction of LC-3 II as well as by the appearance of autophagic vacuoles in the virus-infected cells. However, we found that the virus inhibits fusion between autophagic vacuoles and lysosomes formed in infected cells, thus evading the autophagic response of infected host cells. Finally we tried to investigate replication of the virus in human cells in the absence of P53; a tumor suppressor gene which is also known as "the guardian of the genome ". During these investigations, we found that that inhibition of p53 gene expression mediated by siRNA as well as its inhibition by pharmacological inhibitors leads to massive cell death in human T cell line HSB-2 that carries a wild-type p53. We show that this death also occurs in another cell line CEM, which carries a transcriptionally mutated p53. Interestingly, the cell death could be prevented by pharmacological inhibitors of autophagy and necroptosis. Taken together, our results provide important novel insights concerning the impact of HHV-6 on cell cycle regulation and autophagy as well as of basal level p53 in cell survival.

Regenerative potential of corneal endothelium from patients with fuchs endothelial corneal dystrophy

La dystrophie cornéenne endothéliale de Fuchs (FECD, pour l’abréviation du terme anglais « Fuchs endothelial corneal dystrophy ») est une maladie de l'endothélium cornéen. Sa pathogenèse est mal connue. Aucun traitement médical n’est efficace. Le seul traitement existant est chirurgical et consiste dans le remplacement de l’endothélium pathologique par un endothélium sain provenant de cornées de la Banque des yeux. Le traitement chirurgical, en revanche, comporte 10% de rejet immunologique. Des modèles expérimentaux sont donc nécessaires afin de mieux comprendre cette maladie ainsi que pour le développement de traitements alternatifs. Le but général de cette thèse est de développer un modèle expérimental de la FECD en utilisant le génie tissulaire. Ceci a été réalisé en trois étapes. 1) Tout d'abord, l'endothélium cornéen a été reconstruit par génie tissulaire en utilisant des cellules endothéliales en culture, provenant de patients atteints de FECD. Ce modèle a ensuite été caractérisé in vitro. Brièvement, les cellules endothéliales cornéennes FECD ont été isolées à partir de membranes de Descemet prélevées lors de greffes de cornée. Les cellules au deuxième ou troisième passages ont ensuite été ensemencées sur une cornée humaine préalablement décellularisée. Suivant 2 semaines de culture, les endothélia cornéens reconstruits FECD (n = 6) ont été évalués à l'aide d'histologie, de microscopie électronique à transmission et d’immunomarquages de différentes protéines. Les endothélia cornéens reconstruits FECD ont formé une monocouche de cellules polygonales bien adhérées à la membrane de Descemet. Les immunomarquages ont démontré la présence des protéines importantes pour la fonctionnalité de l’endothélium cornéen telles que Na+-K+/ATPase α1 et Na+/HCO3-, ainsi qu’une expression faible et uniforme de la protéine clusterine. 2) Deux techniques chirurgicales (DSAEK ; pour « Descemet stripping automated endothelial keratoplasty » et la kératoplastie pénétrante) ont été comparées pour la transplantation cornéenne dans le modèle animal félin. Les paramètres comparés incluaient les défis chirurgicaux et les résultats cliniques. La technique « DSAEK » a été difficile à effectuer dans le modèle félin. Une formation rapide de fibrine a été observée dans tous les cas DSAEK (n = 5). 3) Finalement, la fonctionnalité in vivo des endothélia cornéens reconstruits FECD a été évaluée (n = 7). Les évaluations in vivo comprenaient la transparence, la pachymétrie et la tomographie par cohérence optique. Les évaluations post-mortem incluaient la morphométrie des cellules endothéliales, la microscopie électronique à transmission et des immunomarquage de protéines liées à la fonctionnalité. Après la transplantation, la pachymétrie a progressivement diminué et la transparence a progressivement augmenté. Sept jours après la transplantation, 6 des 7 greffes étaient claires. La microscopie électronique à transmission a montré la présence de matériel fibrillaire sous-endothélial dans toutes les greffes d’endothelia reconstruits FECD. Les endothélia reconstruits exprimaient aussi des protéines Na+-K+/ATPase et Na+/HCO3-. En résumé, cette thèse démontre que les cellules endothéliales de la cornée à un stade avancé FECD peuvent être utilisées pour reconstruire un endothélium cornéen par génie tissulaire. La kératoplastie pénétrante a été démontrée comme étant la procédure la plus appropriée pour transplanter ces tissus reconstruits dans l’œil du modèle animal félin. La restauration de l'épaisseur cornéenne et de la transparence démontrent que les greffons reconstruits FECD sont fonctionnels in vivo. Ces nouveaux modèles FECD démontrent une réhabilitation des cellules FECD, permettant d’utiliser le génie tissulaire pour reconstruire des endothelia fonctionnels à partir de cellules dystrophiques. Les applications potentielles sont nombreuses, y compris des études physiopathologiques et pharmacologiques.

La leptospirose féline : sondage sérologique et de PCR urinaire chez des chats sains et des chats atteints de maladie rénale

La leptospirose est une zoonose à distribution mondiale dont la prévalence chez le chat varie géographiquement de 4.8% à 35%. Bien que l’exposition féline à Leptospira spp. soit rapportée dans des études sérologiques, les conséquences cliniques de cette maladie chez le chat sont peu connues. Le but principal de cette étude était de comparer le statut sérologique et de porteur (PCR urinaire) de Leptospira spp. entre des chats sains et des chats atteints de maladie rénale (insulte rénale aigue et maladie rénale chronique de stades IIb, III et IV). Une étude préliminaire pour valider la sensibilité et la spécificité analytiques de la PCR de Leptospira spp. réalisée par le Laboratoire de Diagnostic Moléculaire de la FMV sur l’urine de chat a été effectuée. La validation in vitro a démontré que la technique de PCR est efficace pour déterminer la présence de leptospires pathogènes dans l’urine du chat. Dans le cadre de l’étude principale, 251 chats ont été recrutés entre janvier 2010 et mars 2012,. De ceux-ci, 240 ont été inclus et divisés en 2 groupes (chats sains (C=125) et chats atteints de maladie rénale (MR=115) en se basant sur un examen physique ainsi que sur des résultats d’hématologie, de biochimie et d’analyse d’urine. Tous les chats recrutés ont également été examinés sérologiquement par test de micro-agglutination pour la présence d’anticorps contre Leptospira spp. (résultat considéré positif si ≥1 :100) et par PCR pour la présence de Leptospira spp. dans l’urine. Le pourcentage prédit de séropositivité pour Leptospira spp. était significativement plus élevé chez les chats atteints de maladie rénale (13,7%) que chez les chats sains (5%) (p=0,02). Les sérovars impliqués étaient Pomona (n=16), Bratislava (n=8) et Grippotyphosa (n=1). De plus, les chats séropositifs pour Pomona présentaient des titres significativement plus élevés que pour les autres sérovars (p=0,04). L’excrétion de Leptospira spp. a été confirmée par PCR dans l’urine de huit chats. Des 26 chats séropositifs, quatre (C=2, MR=2) se sont également révélés PCR positifs. La prévalence a été plus élevée chez les chats du groupe MR (5.3%; 6/113) lorsque comparée à celle du groupe C (1.6%; 2/125), mais cette différence ne s’est pas révélée statistiquement significative (C=0,9% , MR= 5,5% ; p = 0,09). L’âge, le sexe et le milieu de vie (urbain versus rural) n’ont pas influencé le statut sérologique ou d’excrétion pour Leptospira spp. Le pourcentage prédit de séropositivité était significativement plus élevée chez les chasseurs (p<0.01) et pendant les mois de juin à août (p=0.02). La présence d’un autre chat à la maison a également significativement augmenté ce pourcentage (p<0.01), mais la présence d’un chien ne l’a pas influencé. Lors de l’évaluation du PCR par le modèle GGE, seules les variables « contact avec raton laveur » et « contact avec mouffettes » sont ressorties statistiquement significatives (p≤0.03). Le rôle que joue Leptospira spp. comme agent étiologique de maladie rénale chez le chat demeure incertain. Toutefois, la différence significative de statut sérologique entre les chats sains et les chats atteints de maladie rénale suggère que la leptospirose pourrait être une cause sous-diagnostiquée de maladie rénale chez cette espèce. Dans cette étude, plusieurs porteurs asymptomatiques ont été identifiés, ce qui suggère que l’espèce féline puisse être un acteur sous-estimé dans la transmission de la bactérie aux humains.

Évaluation objective de la douleur chronique secondaire à l’arthrose chez le chat

La prévalence de l’arthrose féline augmente fortement avec l’âge atteignant plus de 80% des chats de plus de 11 ans. L'arthrose induit une douleur chronique s’exprimant par des changements de comportements et une diminution de la mobilité. Il n'existe aucun outil validé pour évaluer la douleur chronique associée à l’arthrose chez le chat. Conséquemment, aucun traitement ciblant cette douleur n’a pu être validé. Notre hypothèse de recherche est que la douleur arthrosique chez le chat induit des handicaps fonctionnels, des changements neurophysiologiques et un état d'hypersensibilité qu'il faut évaluer pour quantifier de manière fiable cette douleur et ses répercussions sur la qualité de vie de l'animal. Nos objectifs étaient 1) de développer des outils adaptés aux chats mesurant les handicaps fonctionnels grâce à des outils cinématiques, cinétiques et de suivi de l'activité motrice ; 2) de caractériser les changements fonctionnels et neurophysiologiques secondaires à la douleur arthrosique et de tester avec ces outils un traitement analgésique à base d'anti-inflammatoire non stéroïdien ; 3) de développer une technique adaptée aux chats pouvant caractériser la présence du phénomène de sensibilisation centrale à l'aide d'une évaluation de la sommation temporelle mécanique ; 4) de tester la possibilité de mesurer le métabolisme glucidique cérébral par tomographie d’émission par positrons comme marqueur des changements supraspinaux secondaires à la chronicisation de la douleur. Grâce au développement d’outils de mesure de douleur chronique objectifs, sensibles et répétables nous avons caractérisé la douleur chez les chats arthrosiques. Ils présentent des signes de boiterie quantifiée par une diminution de l’amplitude de l’articulation ou par une diminution de la force verticale d’appui au sol et une diminution de l’activité motrice quotidienne. Ces deux derniers outils ont permis de démontrer qu’un anti-inflammatoire non stéroïdien (le méloxicam) administré pendant quatre semaines réduit la douleur arthrosique. De plus, grâce au développement de tests sensoriels quantitatifs et à l'utilisation d'imagerie cérébrale fonctionnelle, nous avons démontré pour la première fois que la douleur arthrosique conduisait à des modifications du système nerveux central chez le chat. Particulièrement, les chats arthrosiques développent le phénomène de sensibilisation centrale mis en évidence par un seuil de retrait aux filament de von Frey diminué (mesure réflexe) mais aussi par une facilitation de la sommation temporelle mécanique (mesure tenant compte de la composante cognitive et émotionnelle de la douleur). L'augmentation du métabolisme cérébral dans le cortex somatosensoriel secondaire, le thalamus et la substance grise périaqueducale, souligne aussi l'importance des changements liés à la chronicisation de la douleur. Un traitement analgésique adapté à l’arthrose permettra d’améliorer la qualité de vie des chats atteints, offrira une option thérapeutique valide aux praticiens vétérinaires, et profitera aux propriétaires qui retrouveront un chat actif et sociable. La découverte de l'implication du phénomène de sensibilisation central combiné à l'investigation des changements cérébraux secondaires à la douleur chronique associée à l'arthrose par imagerie fonctionnelle ouvre de nouvelles avenues de recherche chez le chat (développement et/ou validation de traitements adaptés à l'état d'hypersensibilité) et les humains (potentiel modèle naturel de douleur chronique associée à l'arthrose).

Caractérisation du rôle de l’amyline (IAPP) dans le diabète de type 2 : études de dérivés peptidiques et de composés inhibiteurs de la formation d’amyloïde

L’amyloïdose, une maladie progressive et incurable, implique une vaste panoplie de pathologies et de pathogénèses, qui est expliquée par la grande variabilité biologique et structurale des protéines responsables de la formation des dépôts d’amyloïde. L’amyline (polypeptide amyloïde des îlots pancréatiques, IAPP) est une protéine très susceptible de subir des changements de conformation impliquant les feuillets bêta et conférant aussi des propriétés physicochimiques distinctes. Cette protéine prend alors une forme fibrillaire et se dépose dans les îlots de Langerhans chez les humains atteints de diabète de type 2 ou d’insulinome. Ces dépôts d’amyloïde pancréatique (AIAPP) ont été décrits chez certaines espèces animales telles que les félins domestiques, les grands félins, le raton laveur et les primates non humains. La formation de dépôts d’amyloïde contribue à la pathogénèse du diabète de type 2, mais les mécanismes qui induisent la conversion de l’amyline (IAPP) en amyloïde (AIAPP) ne sont pas complètement compris. Les hypothèses du projet sont que certaines variations présentes dans les séquences peptidiques de l’IAPP provenant de différentes espèces animales jouent un rôle critique pour la formation de fibrilles et que plusieurs composés chimiques aromatiques/phénoliques sont capables d’abroger la formation de dépôts d’amyloïde. Le projet de recherche consiste donc à caractériser la propension des différentes isoformes animales d’IAPP à former de l’amyloïde in vitro afin d’identifier les acides aminés jouant un rôle clé dans cette transformation structurale et ultimement d’inhiber la formation d’amyloïde pancréatique. Le projet se divise en deux volets principaux. Le premier consiste à identifier les différentes séquences peptidiques de l’IAPP retrouvées chez les espèces animales. L’objectif est d’identifier les acides aminés jouant un rôle clé dans la formation d’amyloïde. Le gène de l’IAPP a été séquencé chez plus d’une quarantaine d’espèces. Le potentiel d’agrégation des séquences obtenues a été simulé à l’aide d’outils bioinformatique. Une librairie de 23 peptides a été commandée afin de procéder à des analyses physicochimiques in vitro permettant d’évaluer le potentiel amyloïdogénique (test fluorimétrique à la thioflavine T, essai de liaison au rouge Congo, dichroïsme circulaire, microscopie électronique à transmission) et cytotoxique (sur une lignée cellulaire provenant d’insulinome : INS-1). Les analyses effectuées à partir de la librairie constituée de 23 peptides ont permis d’identifier trois séquences ne formant pas d’amyloïde et qui proviennent des espèces animales suivantes : le tamarin lion doré (Leontopithecus rosalia), le grand dauphin (Tursiops truncatus) et l’alpaga (Vicugna pacos). Un site potentiellement critique est le segment 8-20 présentant le motif NFLVH qui ne forme plus d’amyloïde lorsqu’il est remplacé par le motif DFLGR ou KFLIR. Les acides aminés 29P, 14K et 18R sont également impliqués dans l’inhibition de la transformation structurale en fibrille. La dernière partie du projet consiste à inhiber la formation de l’amyloïde en utilisant des composés chimiques commercialisés (hypoglycémiants, anti-inflammatoires non stéroïdiens) ou nouvellement synthétisés dans notre laboratoire (les aryles éthyles urées). Un criblage d’une soixantaine de composés chimiques a été conduit dans cette étude. Leur efficacité a été testée sur l’IAPP humaine, qui possède un fort potentiel amyloïdogénique. Les techniques utilisées sont les mêmes que celles exploitées précédemment. L’essai de liaison croisée photo-induite ("photo-induced cross-linking of unmodified proteins", PICUP) a été réalisé afin d’étudier les formes intermédiaires (monomères, oligomères). Un total de 11 composés chimiques a démontré un potentiel à inhiber l’agrégation des fibrilles. Pour la classe des hypoglycémiants, le glyburide, le répaglinide et la troglitazone ont montré l’activité thérapeutique la plus élevée pour retarder et réduire la formation de fibrilles. Les anti-inflammatoires antiamyloïdogènes actifs incluaient le diclofenac, le méloxicam, le phénylbutazone, le sulindac et le ténoxicam. Les aryles étyles urées les plus intéressantes étaient la EU-362 et la EU-418. Tous ces composés ont conféré une protection cellulaire contre l’activité cytotoxique des fibrilles. Les molécules actives possèdent des éléments structuraux communs tels des substituants donneurs d’électrons (alcool, amine, halogène) sur un noyau benzène. En conclusion, ce projet de recherche a permis de caractériser l’IAPP chez diverses espèces animales, dont plusieurs chez lesquelles elle n’avait pas encore été décrite, de déterminer les sites jouant un rôle clé dans sa transformation en amyloïde et, ultimement, de tester le potentiel thérapeutique de nouveaux agents antiamyloïdogènes dans le diabète de type 2. Nous espérons que ce projet ouvrira ainsi la porte à de nouvelles stratégies de traitement.

Herpesviruses including novel gammaherpesviruses are widespread among phocid seal species in Canada.

Little is known about herpesviruses in Canadian pinnipeds. We measured prevalence of antibodies to herpesviruses in the sera from Canadian phocid seals by an indirect enzyme-linked immunosorbent assay. Wild harbor seals (Phoca vitulina) and captive harbor seals were positive for antibodies to Phocid herpesvirus 1 (PhoHV-1) at prevalences of 91% and 100%, respectively. Sera from wild hooded seals (Cystophora cristata), harp seals (Pagophilus groenlandica), and grey seals (Halichoerus grypus) were positive for antibodies to PhoHV-1 antigenically related herpesvirus antigens at 73%, 79%, and 96%, respectively. We isolated new herpesviruses in cell culture from two hunter-harvested ringed seals (Pusa hispida) in poor body condition from Ulukhaktok, Northwest Territories, Canada; one lethargic hooded seal from the St. Lawrence Estuary, Québec, Canada; and one captive, asymptomatic harp seal from the Magdalen Islands, Québec. Partial sequencing of the herpesvirus DNA polymerase gene revealed that all four virus isolates were closely related to PhoHV-2, a member of the Gammaherpesvirinae subfamily, with nucleotide similarity ranging between 92.8% and 95.3%. The new seal herpesviruses were genetically related to other known pinniped herpesviruses, such as PhoHV-1, Otariid herpesvirus 3, Hawaiian monk (Monachus schauinslandi) seal herpesvirus, and Phocid herpesvirus 5 with 47–48%, 55%, 77%, and 70–77% nucleotide similarities, respectively. The harp seal herpesvirus and both ringed seal herpesviruses were almost identical to each other, whereas the hooded seal herpesvirus was genetically different from the three others (92.8% nucleotide similarity), indicating detection of at least two novel seal herpesviruses. These findings are the first isolation, partial genome sequencing, and identification of seal gammaherpesviruses in three species of Canadian phocid seals; two species of which were suspected of exposure to one or more antigenically related herpesviruses based on serologic analyses.

L'hepcidine : un possible lien entre l'inflammation chronique et le métabolisme du fer dans les maladies rénales chroniques félines

Le rôle de l'inflammation dans le développement et la progression des maladies rénales chroniques (MRC) chez le chat a été peu étudié. L'hepcidine est une protéine de la phase aigue (PPA) de l'inflammation qui contribue au développement des anémies lors de MRC chez l'homme. Les objectifs de cette étude sont de comparer les concentrations en PPAs, en erythropoietine (EPO) ainsi que le statut en fer entre un groupe de chats sains et en MRC. 18 chats sains et 38 chats en MRC ont été recrutés de façon prospective. Les examens réalisés incluaient hématologie, biochimie, analyse d'urine, Serum amyloid A (SAA), haptoglobine (HAP), EPO, hepcidine,fer, TIBC et ferritinne. Nous avons observé une augmentation significative des concentrations en SAA et en hepcidine ainsi qu'une diminution significative du fer et du TIBC dans le groupe MRC (P < .05). Une corrélation positive entre la créatinine et certaines PPAs (SAA and hepcidin; P < .05) était présente. L'augmentation de SAA et hepcidine était significativement associé avec une diminution du TIBC et de l'hématocrite dans le groupe MRC. Les 14 (37%) chats anémiques du groupe MRC avaient une concentration significativement plus basse en fer et en TIBC (P < .05), changements compatibles avec une déficience fonctionelle en fer. Aucun chat n'avait un panel de fer compatible avec une carence en fer absolue. En conclusion, les résultats de cette étude suggèrent que les MRC chez le chat sont des conditions pro-inflammatoires, ayant un impact sur le métabolisme du fer.

Fonctionnalité in vivo d’un endothélium cornéen reconstitué par injection de cellules endothéliales cornéennes dans la chambre antérieure d’un modèle félin

Introduction : Malgré leur état non-prolifératif in vivo, les cellules endothéliales cornéennes (CEC) peuvent être amplifiées in vitro. Leur transplantation subséquente par injection intracamérale pourrait surmonter la pénurie de tissus associée à l’allo-greffe traditionnelle – l’unique traitement définitif disponible pour les endothéliopathies cornéennes. Objectif : Évaluer la fonctionnalité d’un endothélium cornéen reconstitué par injection de CEC dans la chambre antérieure du félin. Méthodes : Les yeux droits de 16 animaux ont été opérés. Huit ont été désendothélialisés centralement avec injection de 2x10e5 (n=4) ou 1x10e6 (n=4) CEC félines supplémentées avec Y-27632 et marquées avec SP-DiOC18(3). Deux ont été désendothélialisés complètement et injectés avec 1x10e6 CEC et Y-27632. Six contrôles ont été désendothélialisés centralement (n=3) ou complètement (n=3) et injectés avec Y-27632 sans CEC. La performance clinique, l’intégrité anatomique, le phénotype fonctionnel et l’expression de SP-DiOC18(3) du nouvel endothélium ont été étudiés. Résultats : Les cornées greffées avec 2x10e5 CEC et les contrôles désendothélialisés centralement ont réussi le mieux cliniquement. Les contrôles désendothélialisés complètement sont restés opaques. L’histopathologie a révélé une monocouche endothéliale fonctionnelle dans les cornées greffées avec 2x10e5 CEC et les contrôles désendothélialisés centralement, une multicouche endothéliale non-fonctionnelle dans les cornées désendothélialisées centralement et greffées avec 1x10e6 CEC, et un endothélium fibrotique non-fonctionnel dans les cornées désendothélialisées complètement. L’expression de SP-DiOC18(3) était rare dans les greffes. Conclusion : La thérapie par injection cellulaire a reconstitué un endothélium partiellement fonctionnel, auquel les CEC injectées n’ont contribué que peu. L’injection de Y-27632 sans CEC a reconstitué l’endothélium le plus sain. Des études additionnelles investiguant l’effet thérapeutique de Y-27632 seul sont justifiées.