The expression and production of piano timbre : gestural control and technique, perception and verbalisation in the context of piano performance and practice

La version intégrale de cette thèse est disponible uniquement pour consultation individuelle à la Bibliothèque de musique de l’Université de Montréal (http://www.bib.umontreal.ca/MU).

L'émergence des limites à la liberté de tester en droit québécois : étude socio-juridique de la production du droit

"Thèse présentée à la Faculté des études supérieures en vue de l'obtention du grade de docteur en droit (LL.D.)". Cette thèse a été acceptée à l'unanimité et classée parmi les 10% des thèses de la discipline.

La réponse au Farnésol de Candida albicans : production de biofilms et Parenté génétique

C. albicans est une levure pathogène opportuniste. Elle est un agent causal fréquent des infections muco-cutanées. C. albicans peut alterner entre la forme blastospore et mycélium. Cette dernière forme est impliquée dans la formation des biofilms. Le dimorphisme de C. albicans est contrôlé en partie par le phénomène de perception du quorum (quorum sensing) qui en autre, est associé à la molécule farnésol, produit par cette levure. La présence de cette molécule, inhibe la formation d’hyphe par C. albicans et par conséquent limite la formation de biofilms. Certaines souches ne répondent pas au farnésol et nous avons vérifié les hypothèses que : 1) la proportion des Non-Répondeurs (NR) au farnésol est similaire entre les souches de provenance orale et vaginale; 2) la capacité de formation de biofilm varie d’une souche à une autre mais les Non-Répondeurs en produisent en plus grande quantité; 3) la technique RAPD-PCR permettra de regrouper les souches de cette levure suivant leur provenance, leur capacité de formation de biofilm et leur aptitude à répondre au farnésol. La découverte d’une souche vaginale Non-Répondeur nous permet de croire que la proportion de ces souches est similaire entre les deux types de provenance. Les souches caractérisées Non-Répondeurs produisent 30 % plus de biofilm que les Répondeurs en absence de farnésol exogène dans le milieu. En présence de farnésol exogène, les Non-Répondeurs produisent 70 % plus de biomasse que les Répondeurs. De plus, la technique RAPD ne nous a pas permis de classer nos souches d’après les caractéristiques proposées. En conclusion, les souches orales de C. albicans semblent produire en moyenne plus de biomasse que les souches vaginales. Aussi, les NR semblent moins affectés par la présence du farnésol, ce qui pourrait causer la présence de biofilms tenaces. Les amorces utilisées pour la technique RAPD n’ont pas été efficace à la classification des souches dépendamment de leur provenance, de leur capacité à former un biofilm et à répondre au farnésol. Mots clés : Candida albicans, biofilm, perception du quorum (quorum sensing), farnésol, Non-Répondeur

Développement de procédés efficaces pour la construction et la production de vecteurs adénoviraux

L’adénovirus possède plusieurs caractéristiques faisant de ce virus un candidat de choix pour la construction de vecteurs utiles dans les études de génomique fonctionnelle. Dans la majorité de ces applications, on a recours à un vecteur adénoviral de première génération délété de sa région E1. L’utilisation de vecteurs adénoviraux comprend deux maillons faibles : la construction du vecteur et la production subséquente de ce dernier. Le développement de méthodes alternatives est donc nécessaire pour renforcer ces deux maillons, permettant ainsi une utilisation étendue de ces vecteurs. Ce développement va s’articuler sur deux axes : l’ingénierie du vecteur de transfert pour la construction de l’adénovirus recombinant et l’ingénierie d’une lignée cellulaire pour la production du vecteur. En utilisant un vecteur de transfert adénoviral co-exprimant, à partir d’un promoteur régulable à la tétracycline, la protéase de l’adénovirus et une protéine de fluorescence verte (GFP) par l’intermédiaire d’un site d’entrée ribosomal interne (IRES), notre groupe a établi que la sélection positive, via l’expression ectopique de la protéase, est un processus efficace pour la création de librairie d’adénovirus recombinants. Par contre, la diversité atteinte dans ce premier système est relativement faible, environ 1 adénovirus recombinant par 1 000 cellules. Le travail effectué dans le cadre de cette thèse vise à construire un nouveau transfert de vecteur dans lequel l’expression de la protéase sera indépendante de celle du transgène permettant ainsi d’optimiser l’expression de la protéase. Ce travail d’optimisation a permis de réduire le phénomène de transcomplémentation du virus parental ce qui a fait grimper la diversité à 1 virus recombinant par 75 cellules. Ce système a été mis à l’épreuve en générerant une librairie adénovirale antisens dirigée contre la GFP. La diversité de cette librairie a été suffisante pour sélectionner un antisens réduisant de 75% l’expression de la GFP. L’amplification de ce vecteur adénoviral de première génération doit se faire dans une lignée cellulaire exprimant la région E1 telle que les cellules 293. Par contre, un adénovirus de première génération se répliquant dans les cellules 293 peut échanger, par recombinaison homologue, son transgène avec la région E1 de la cellule créant ainsi un adénovirus recombinant réplicatif (RCA), compromettant ainsi la pureté des stocks. Notre groupe a déjà breveté une lignée cellulaire A549 (BMAdE1) exprimant la région E1, mais qui ne peut pas recombiner avec le transgène du virus. Par contre, le niveau de réplication de l’adénovirus dans les BMAdE1 est sous-optimal, à peine 15-30% du niveau obtenu dans les cellules 293. Le travail fait dans le cadre de cette thèse a permis de mettre en évidence qu’une expression insuffisante d’E1B-55K était responsable de la mauvaise réplication du virus dans les BMAdE1. Nous avons produit de nouveaux clones à partir de la lignée parentale via une transduction avec un vecteur lentiviral exprimant E1B-55K. Nous avons confirmé que certains clones exprimaient une plus grande quantité d’E1B-55K et que ces clones amplifiaient de manière plus efficace un vecteur adénoviral de première génération. Ce clone a par la suite été adapté à la culture en suspension sans sérum.

Production and immunogenicity of selected proteins of Salmonella Enteritidis

Au cours des dernières années, Salmonella Enteritidis est devenus les sérotypes les plus souvent isolés chez les patients canadiens, les cas étant liés à la consommation de viande de poulet et d’œufs crus. Les vaccins tués commercialement disponibles pour la volaille, stimulent mal l'immunité mucosale, tandis que l'utilisation de vaccins vivants reste controversée. Par conséquent, un vaccin sous-unitaire par voie orale peut être une solution. Cinq protéines bactériennes ont été choisies comme candidates potentielles et identifiées, soit Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, Enolase, Lipoamide dehydrogenase, DNA protection during starvation protein et Elongation factor-Tu. Notre objectif a été de produire et de purifier ces protéines et de démontrer leur immunogénicité. Les gènes des protéines ont été amplifiés et clonés dans le vecteur pQE-30 pour expression dans Escherichia coli M15. La purification a été effectuée par FPLC. Des poules pondeuses SPF ont été séparées en 6 groupes et injectées par voie intramusculaire à different âges avec une des 5 protéines, ou le PBS chez le groupe témoin. Les œufs ont été ramassés pendant l'expérience et du sang a été prélevé à 36 semaines d'âge. Les anticorps IgY ont été extraits à partir du jaune d'oeuf et du sérum, et les IgA à partir du blanc d'oeuf. Des immunodots, westernblots et ELISA ont évalué l'immunogénicité des protéines et les niveaux d'anticorps induits . Nous avons constaté que ces cinq protéines pourraient stimuler la production d'anticorps spécifiques in vivo. GAPDH, Enolase et DPS ont induit des titres d'anticorps plus élevés que LpdA et EF-Tu.

Évaluation de la production morphosyntaxique chez un enfant québécois francophone porteur d'implant cochléaire.

Cette étude décrit le développement des structures morphosyntaxiques et morphophonologiques chez les enfants francophones âgés entre 3 et 6 ans. Ces données pourront contribuer à particulariser certaines difficultés morphosyntaxiques et morphophonologiques retrouvées chez l’enfant déficient auditif québécois porteur d’implant cochléaire. Le premier objectif de notre projet pilote vise à comparer les habiletés morphosyntaxiques et morphophonologiques au niveau expressif de l’enfant porteur d’IC à celles des enfants entendants de même âge auditif et chronologique. L’étude évalue spécifiquement l’accord intra-nominal en genre, et les processus de fusion, d’élision et de liaison. Nous prédisons qu’une entrée auditive inférieure à la norme aura un impact sur l’acquisition des règles morpho(phonolo)giques en français. Le deuxième objectif consiste à observer si la maîtrise de ces structures est liée à la maîtrise de la production phonémique chez l’enfant franco-québécois porteur d’IC. L’élaboration de deux tâches expérimentales et la passation de tâches évaluatives et expérimentales ont permis d’étudier les difficultés morphologiques et phonologiques de l’enfant porteur d'IC. Le groupe témoin a inclus 14 enfants à développement typique. Ils ont été comparés au cas de Vincent, âgé de 59 mois, porteur d’implant cochléaire. Ce dernier présente des étapes de développement linguistique décalées qui correspondent à celles d’enfants appariés sur l’âge auditif (date d’IC) plutôt qu’à l’âge chronologique (AC). Nous avons observé des similitudes et des différences, sur le plan phonologique et morphosyntaxique, entre Vincent et les enfants entendants : il présente des performances significativement moins bonnes que la norme pour certaines de structures morphosyntaxiques et processus morphophonologiques (accord du genre, élision, fusion) mais meilleures que les témoins dans la tâche de liaison. Nous pensons que le gain prothétique n’est pas le seul facteur qui a un impact sur le développement linguistique précoce et que d’autres facteurs l’influenceraient, tels l’âge d’implantation, le mode de communication, l’implantation bilatérale, l’investissement des parents et les effets d’apprentissage. Enfin, notre étude de cas n’a pu étayer si la maîtrise de la production phonémique est en relation avec la maîtrise de certaines structures et processus morphologiques.

Production d'IgG sialylées en CHO et impact sur leurs fonctions effectrices

La sialylation des N-glycanes du fragment Fc des immunogobulines G (IgG) est une modification peu fréquente des IgG humaines. Pourtant, elle est l’objet de beaucoup d’attention depuis que deux articles fondateurs ont été publiés, qui montrent l’un que la sialylation des IgG diminue leur capacité à déclencher la cytotoxicité cellulaire dépendant de l’anticorps (ADCC), et l’autre que les IgG sialylées en α2,6 seraient la fraction efficace des IgG intraveineuses (IgIV) anti-inflammatoires. Les anticorps monoclonaux thérapeutiques, qui sont le plus souvent des IgG recombinantes produites en culture de cellules de mammifère, connaissent depuis la fin des années 90 un succès et une croissance phénoménaux sur le marché pharmaceutique. La maîtrise de la N-glycosylation du Fc des IgG est une clé de l’efficacité des anticorps monoclonaux. Si les IgG sialylées sont des molécules peu fréquentes in vivo, elles sont très rares en culture cellulaire. Dans cette étude, nous avons développé une méthode de production d’IgG avec une sialylation de type humain en cellules CHO. Nous avons travaillé principalement sur la mise au point d’une stratégie de production d’IgG sialylées par co-expression transitoire d’une IgG1 avec la β1,4-galactosyltransférase I (β4GTI) et la β-galactoside-α2,6-sialyltransférase I (ST6GalI). Nous avons montré que cette méthode permettait d’enrichir l’IgG1 en glycane fucosylé di-galactosylé mono-α2,6-sialylé G2FS(6)1, qui est le glycane sialylé présent sur les IgG humaines. Nous avons ensuite adapté cette méthode à la production d’IgG présentant des profils de glycosylation riches en acides sialiques, riches en galactose terminal, et/ou appauvris en fucosylation. L’analyse des profils de glycosylation obtenus par la co-expression de diverses combinaisons enzymatiques avec l’IgG1 native ou une version mutante de l’IgG1 (F243A), a permis de discuter des influences respectives de la sous-galactosylation des IgG1 en CHO et des contraintes structurales du Fc dans la limitation de la sialylation des IgG en CHO. Nous avons ensuite utilisé les IgG1 produites avec différents profils de glycosylation afin d’évaluer l’impact de la sialylation α2,6 sur l’interaction de l’IgG avec le récepteur FcγRIIIa, principal récepteur impliqué dans la réponse ADCC. Nous avons montré que la sialylation α2,6 augmentait la stabilité du complexe formé par l’IgG avec le FcγRIIIa, mais que ce bénéfice n’était pas directement traduit par une augmentation de l’efficacité ADCC de l’anticorps. Enfin, nous avons débuté le développement d’une plateforme d’expression stable d’IgG sialylées compatible avec une production à l’échelle industrielle. Nous avons obtenu une lignée capable de produire des IgG enrichies en G2FS(6)1 à hauteur de 400 mg/L. Cette étude a contribué à une meilleure compréhension de l’impact de la sialylation sur les fonctions effectrices des IgG, et a permis d’augmenter la maîtrise des techniques de modulation du profil de glycosylation des IgG en culture cellulaire.