Production d'IgG sialylées en CHO et impact sur leurs fonctions effectrices

La sialylation des N-glycanes du fragment Fc des immunogobulines G (IgG) est une modification peu fréquente des IgG humaines. Pourtant, elle est l’objet de beaucoup d’attention depuis que deux articles fondateurs ont été publiés, qui montrent l’un que la sialylation des IgG diminue leur capacité à déclencher la cytotoxicité cellulaire dépendant de l’anticorps (ADCC), et l’autre que les IgG sialylées en α2,6 seraient la fraction efficace des IgG intraveineuses (IgIV) anti-inflammatoires. Les anticorps monoclonaux thérapeutiques, qui sont le plus souvent des IgG recombinantes produites en culture de cellules de mammifère, connaissent depuis la fin des années 90 un succès et une croissance phénoménaux sur le marché pharmaceutique. La maîtrise de la N-glycosylation du Fc des IgG est une clé de l’efficacité des anticorps monoclonaux. Si les IgG sialylées sont des molécules peu fréquentes in vivo, elles sont très rares en culture cellulaire. Dans cette étude, nous avons développé une méthode de production d’IgG avec une sialylation de type humain en cellules CHO. Nous avons travaillé principalement sur la mise au point d’une stratégie de production d’IgG sialylées par co-expression transitoire d’une IgG1 avec la β1,4-galactosyltransférase I (β4GTI) et la β-galactoside-α2,6-sialyltransférase I (ST6GalI). Nous avons montré que cette méthode permettait d’enrichir l’IgG1 en glycane fucosylé di-galactosylé mono-α2,6-sialylé G2FS(6)1, qui est le glycane sialylé présent sur les IgG humaines. Nous avons ensuite adapté cette méthode à la production d’IgG présentant des profils de glycosylation riches en acides sialiques, riches en galactose terminal, et/ou appauvris en fucosylation. L’analyse des profils de glycosylation obtenus par la co-expression de diverses combinaisons enzymatiques avec l’IgG1 native ou une version mutante de l’IgG1 (F243A), a permis de discuter des influences respectives de la sous-galactosylation des IgG1 en CHO et des contraintes structurales du Fc dans la limitation de la sialylation des IgG en CHO. Nous avons ensuite utilisé les IgG1 produites avec différents profils de glycosylation afin d’évaluer l’impact de la sialylation α2,6 sur l’interaction de l’IgG avec le récepteur FcγRIIIa, principal récepteur impliqué dans la réponse ADCC. Nous avons montré que la sialylation α2,6 augmentait la stabilité du complexe formé par l’IgG avec le FcγRIIIa, mais que ce bénéfice n’était pas directement traduit par une augmentation de l’efficacité ADCC de l’anticorps. Enfin, nous avons débuté le développement d’une plateforme d’expression stable d’IgG sialylées compatible avec une production à l’échelle industrielle. Nous avons obtenu une lignée capable de produire des IgG enrichies en G2FS(6)1 à hauteur de 400 mg/L. Cette étude a contribué à une meilleure compréhension de l’impact de la sialylation sur les fonctions effectrices des IgG, et a permis d’augmenter la maîtrise des techniques de modulation du profil de glycosylation des IgG en culture cellulaire.

Only a fraction of the N-glycans present on the Fc fragment of the human IgGs is sialylated. However, a new interest for sialylation has risen since two major articles were published, one showing that sialylation reduces the capacity of the antibody to trigger antibody-dependent cell cytotoxicity (ADCC), whereas the other showed that the IgGs carrying α2,6-sialic acids on their Fc N-glycans were responsible for the anti-inflammatory activity of intravenous immunoglobulins (IVIGs) injected at high doses. Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are in majority recombinant IgGs produced in mammalian cell culture. Since the end of the nineties, mAbs have become a major class of pharmaceutical products, and their success is still growing. The control of Fc N-glycosylation is a key parameter for the improvement of the therapeutic efficacy of mAbs. Sialylated IgGs are found only as traces in the classic CHO cell culture processes. In this study, we developed a method for the production of IgGs with a human-like sialylation in CHO cells. We focused on a production strategy relying on the transient co-expression of an IgG1 with the β1,4-galactosyltransferase I (β4GTI) and the β-galactoside-α2,6-sialyltransferase I (ST6GalI). We showed that this method allowed the enrichment of the IgG1 glycoprofile in the fucosylated di-galactosylated mono-α2,6-sialylated glycane G2FS(6)1, which is the main sialylated glycan found in human IgGs. We then adapted this method to the production of highly galactosylated or highly sialylated IgGs with and without core-fucosylation. The analysis of the glycosylation profiles obtained using the various enzyme combinations co-expressed with the native IgG1 or the mutant IgG1 F243A allowed us to discuss the influence of the under-galactosylation found in IgGs produced in CHO cells versus the Fc structural constraints on the limitation of IgG sialylation in CHO cells. We used the IgG1 glycovariants produced with our method to assess the impact of Fc α2,6-sialylation on the interaction of the IgG with the receptor FcγRIIIa, which is the main receptor mediating the ADCC response. We showed that the presence of α2,6-sialylation in the Fc increased the stability of the IgG-FcγRIIIa complex. This benefit however did not translate into an improved ADCC capacity. Finally, we initiated the development of a stable expression platform for the production of sialylated IgGs at yields relevant for the industry. We obtained a cell line capable of producing IgGs enriched in G2FS(6)1 at 400 mg/L. This may eventually represent a novel approach to manufacture a recombinant IVIG surrogate. With this work, we contributed to a better understanding of the impact of sialylation on the effector functions of IgGs. We also improved our understanding of the techniques allowing for the modification and control of the glycosylation profile of IgGs in cell culture.