Three rounds (1R/2R/3R) of genome duplications and the evolution of the glycolytic pathway in vertebrates

Affiliation: Henner Brinkmann : Département de biochimie, Faculté de médecine, Université de Montreal

Analyse des enjeux éthiques attribuables au don d’organes après décès cardiocirculatoire selon l’approche bioéthique par principes

Travail dirigé présenté à la Faculté des sciences infirmières en vue de l'obtention du grade de M. Sc. en Sciences Infirmières option infirmière clinicienne

Portée et limites de l'encadrement juridique de la xénotransplantation : étude de droit comparé

"Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures en vue de l'obtention du grade de Maître en droit (LL.M.)"

La sécurité des xénogreffons : une normativité à bâtir

La xénotransplantation, soit la transplantation de cellules, de tissus ou d'organes d'origine animale chez l'homme, est envisagée comme solution à la pénurie d'organes. Toutefois, cette technologie pourrait être à l'origine de nouvelles maladies. D'où la nécessité d'avoir des mesures visant tant la santé des animaux fournisseurs que la qualité et la sécurité des xénogreffons pour minimiser les risques de transmission de maladies de l'animal à l'homme, appelées xénozoonoses. L'objet de ce mémoire est de vérifier si les normes existantes au Canada et au Québec sont appropriées pour assurer la sécurité des receveurs et de la population. Nous avons d'abord examiné les normes susceptibles de s'appliquer à la surveillance et au contrôle de la santé des animaux fournisseurs. Ne visant que les maladies connues, elles ne répondent pas aux spécificités de la xénotransplantation. Quant aux xénogreffons, leur qualification pose problème: drogues ou instruments. Cette incertitude pourrait affecter l'uniformité des décisions relatives à leur qualité et à leur sécurité. Nous avons aussi étudié la Proposition d'une Norme canadienne pour la xénotransplantation. Cette dernière pourrait certes pallier la situation d'inadéquation de l'encadrement normatif existant au Canada. Une comparaison de cette norme canadienne avec les recommandations de l'OMS et les mesures en place aux ÉtatsUnis nous permet de suggérer comment la bonifier. Il ressort de notre étude que l'encadrement normatif canadien visant la sécurité des xénogreffons demeure à bâtir. Un élément essentiel à considérer dans son élaboration est la nécessité d'instaurer des systèmes de contrôle adéquats et compatibles à l'échelle planétaire.

Regulation of the memory T cell development and islet beta-cell survival by DAPK-related apoptosis-inducing protein kinase 2 (Drak2)

Drak2 est un membre de la famille des protéines associées à la mort et c’est une sérine/thréonine kinase. Chez les souris mutantes nulles Drak2, les cellules T ne présentent aucune défectuosité apparente en apoptose induite par activation, après stimulation avec anti-CD3 et anti-CD28, mais ont un seuil de stimulation réduit, comparées aux cellules T de type sauvage (TS). Dans notre étude, l’analyse d’hybridation in situ a révélé que l’expression de Drak2 est ubiquiste au stade de la mi-gestation chez les embryons, suivie d’une expression plus focale dans les divers organes pendant la période périnatale et l’âge adulte, notamment dans le thymus, la rate, les ganglions lymphatiques, le cervelet, les noyaux suprachiasmatiques, la glande pituitaire, les lobes olfactifs, la médullaire surrénale, l’estomac, la peau et les testicules. Nous avons créé des souris transgéniques (Tg) Drak2 en utilisant le promoteur humain beta-actine. Ces souris Tg montraient des ratios normaux entre cellules T versus B et entre cellules CD4 versus CD8, mais leur cellularité et leur poids spléniques étaient inférieurs comparé aux souris de type sauvage. Après activation TCR, la réponse proliférative des cellules T Tg Drak2 était normale, même si leur production d’interleukine (IL)-2 et IL-4 mais non d’interféron-r était augmentée. Les cellules T Tg Drak2 activées ont démontré une apoptose significativement accrue en présence d’IL-2 exogène. Au niveau moléculaire, les cellules T Tg Drak2 ont manifesté une augmentation moins élevée des facteurs anti-apoptotiques durant l’activation; un tel changement a probablement rendu les cellules vulnérables aux attaques subséquentes d’IL-2. L’apoptose compromise dans les cellulesT Tg Drak2 a été associée à un nombre réduit de cellules T ayant le phénotype des cellules mémoires (CD62Llo) et avec des réactions secondaires réprimées des cellules T dans l’hypersensibilité de type différé. Ces résultats démontrent que Drak2 s’exprime dans le compartiment des cellules T mais n’est pas spécifique aux cellules T; et aussi qu’il joue des rôles déterminants dans l’apoptose des cellules T et dans le développement des cellules mémoires T. En outre, nous avons recherché le rôle de Drak2 dans la survie des cellules beta et le diabète. L’ARNm et la protéine Drak2 ont été rapidement induits dans les cellules beta de l’îlot après stimulation exogène par les cytokines inflammatoires ou les acides gras libres et qui est présente de façon endogène dans le diabète, qu’il soit de type 1 ou de type 2. La régulation positive de Drak2 a été accompagnée d’une apoptose accrue des cellules beta. L’apoptose des cellules beta provoquée par les stimuli en question a été inhibée par la chute de Drak2 en utilisant petit ARNi. Inversement, la surexpression de Drak2 Tg a mené à l’apoptose aggravée des cellules beta déclenchée par les stimuli. La surexpression de Drak2 dans les îlots a compromis l’augmentation des facteurs anti-apoptotiques, tels que Bcl-2, Bcl-xL et Flip, sur stimulation par la cytokine et les acides gras libres. De plus, les expériences in vivo ont démontré que les souris Tg Drak2 étaient sujettes au diabète de type 1 dans un modèle de diabète provoqué par de petites doses multiples de streptozotocine et qu’elles étaient aussi sujettes au diabète de type 2 dans un modèle d’obésité induite par la diète. Nos données montrent que Drak2 est défavorable à la survie des cellules beta. Nous avons aussi étudié la voie de transmission de Drak2. Nous avons trouvé que Drak2 purifiée pouvait phosphoryler p70S6 kinase dans une analyse kinase in vitro. Lasurexpression de Drak2 dans les cellules NIT-1 a entraîné l’augmentation de la phosphorylasation p70S6 kinase tandis que l’abaissement de Drak2 dans ces cellules a réduit la phosphorylation. Ces recherches mécanistes ont prouvé que p70S6 kinase était véritablement un substrat de Drak2 in vitro et in vivo. Cette étude a découvert les fonctions importantes de Drak2 dans l’homéostasie des cellules T et le diabète. Nous avons prouvé que p70S6 kinase était un substrat de Drak2. Nos résultats ont approfondi nos connaissances de Drak2 à l’intérieur des systèmes immunitaire et endocrinien. Certaines de nos conclusions, comme les rôles de Drak2 dans le développement des cellules mémoires T et la survie des cellules beta pourraient être explorées pour des applications cliniques dans les domaines de la transplantation et du diabète.

Rôle des macrophages contre Candida albicans chez la souris transgénique exprimant le génome du VIH-1

La candidose oropharyngée (COP) constitue l’infection fongique opportuniste la plus fréquente chez les patients infectés au VIH-1. Malgré la profonde immunosuppression causée par le VIH-1, l’infection à Candida albicans demeure confinée au niveau de la muqueuse buccale sans dissémination aux organes profonds. La souris transgénique (Tg) CD4C/HIVMut exprimant le génome tronqué du VIH-1 présente, suite à l’inoculation orale de C. albicans, une COP chronique reproduisant fidèlement l’infection chez les patients séropositifs. Cette souris Tg a donc été utilisée afin de déterminer si les macrophages contribuent au confinement de C. albicans à la muqueuse buccale. Cette étude a permis de démontrer que i) les macrophages sont recrutés aux muqueuses buccale et gastrique en réponse au champignon malgré l’expression du transgène, ii) les macrophages de ces souris Tg présentent une polarisation vers un phénotype d’activation alternative et iii) la production de monoxyde d’azote par les macrophages des souris Tg n’est pas requise pour limiter la prolifération de Candida à la muqueuse buccale et pour restreindre sa dissémination aux organes profonds. Les macrophages ne semblent donc pas directement responsables de l’établissement de l’infection chronique à Candida chez la souris Tg CD4C/HIVMut.

Caractérisation du risque associé au virus de l'hépatite E chez le porc

Dans cette étude, la bile d’un porc canadien naturellement infecté par une souche du virus de l’hépatite E (VHE) a été utilisée afin d’inoculer deux groupes de porcelets. Dans l’étude précoce (E), 4 porcelets âgés de 4 semaines et exempts de pathogènes spécifiques (SPF), ont été suivis jusqu’à 14 jours post-inoculation (pi). Dans l’étude tardive (L), 9 porcelets ont été suivis à chaque semaine jusqu’à l’abattage, soit 120 jours pi. À la nécropsie, la présence du VHE a été évaluée dans différents organes à 7, 14 et 120 jours pi. Des porcelets témoins (E=2 et L=3) ont été inoculés par de la bile exempte de VHE. Le virus a persisté chez certains animaux jusqu’à 84 à 105 jours pi dans le sérum malgré la présence d’anticorps IgG anti-VHE dans le sang, suggérant une virémie prolongée. L’excrétion virale dans les fèces s’est étalée également sur une période de 105 jours pi chez certains animaux. De plus, la détection de l’ARN viral dans les organes évalués s’est révélée presque nulle à l’âge d’abattage à l’exception de quelques vésicules biliaires, alors qu’on retrouvait l’ARN viral dans plusieurs organes à 7 et 14 jours pi. Pour évaluer la distribution du VHE chez les porcs commerciaux du Québec, un échantillonnage de porcs de trois abattoirs a été réalisé. Environ 100 échantillons de sang, fèces, foies et bile provenant des mêmes animaux en processus d’abattage ont été prélevés dans chacun des abattoirs, sur des porcs destinés à la consommation humaine. La détection de l’ARN viral et des anticorps du VHE a été réalisée à l’aide d’une RT-PCR nichée et d’un test ELISA adapté pour déceler les anticorps porcins anti-VHE. Chez les porcs d’abattoir, 12,9 % des échantillons de bile contenaient de l’ARN viral du VHE, alors que la détection virale était moindre dans les autres organes. Une séroprévalence en IgG de 26,0 % a été obtenue pour les sérums porcins analysés. Une analyse phylogénétique des différentes souches isolées pendant l’étude a démontré qu’elles sont du génotype 3. Ces données indiquent une exposition potentielle des travailleurs de l’industrie porcine au VHE porcin, notamment par les fèces, le sang et les organes et également pour les consommateurs par le biais des foies.

Mise au point de nanoparticules polymères pour l'administration parentérale d'agents anticancéreux hydrophobes

Plusieurs agents anticancéreux très puissants sont caractérisés par une solubilité aqueuse limitée et une toxicité systémique importante. Cette dernière serait liée d’une part à la solubilisation des agents anticancéreux à l’aide de surfactifs de bas poids moléculaire, connus pour leur toxicité intrinsèque, et d’autre part, par le manque de spécificité tissulaire des anticancéreux. Les vecteurs colloïdaux à base de polymères permettraient de résoudre certains défis liés à la formulation d’agents anticancéreux hydrophobes. D’abord, les polymères peuvent être sélectionnés afin de répondre à des critères précis de compatibilité, de dégradation et d’affinité pour le médicament à formuler. Ensuite, le fait d’encapsuler l’agent anticancéreux dans un vecteur peut améliorer son efficacité thérapeutique en favorisant son accumulation au niveau du tissu cible, i.e. la tumeur, et ainsi limiter sa distribution au niveau des tissus sains. Des travaux antérieurs menés au sein de notre laboratoire ont mené à la mise au point de micelles à base de poly(N-vinyl-pyrrolidone)-bloc-poly(D,L-lactide) (PVP-b-PDLLA) capables de solubiliser des agents anticancéreux faiblement hydrosolubles dont le PTX. Ce dernier est commercialisé sous le nom de Taxol® et formulé à l’aide du Crémophor EL (CrEL), un surfactif de bas poids moléculaire pouvant provoquer, entre autres, des réactions d’hypersensibilité sévères. Bien que les micelles de PVP-b-PDLLA chargées de PTX aient démontré une meilleure tolérance comparée au Taxol®, leur potentiel de ciblage tumoral et leur efficacité thérapeutique étaient similaires à la forme commerciale à doses égales. Ceci était possiblement dû au fait que les micelles étaient rapidement déstabilisées et ne pouvaient retenir leur cargo suite à leur administration intraveineuse. Nous avons donc décidé de poursuivre les travaux avec un autre type de vecteur, soit des nanoparticules, qui possèdent une stabilité intrinsèque supérieure aux micelles. L’objectif principal de cette thèse de doctorat était donc de mettre au point des nanoparticules polymères pour l’administration parentérale d’agents anticancéreux faiblement solubles dans l’eau. Les nanoparticules devaient permettre d’encapsuler des agents anticancéreux hydrophobes et de les libérer de manière contrôlée sur plusieurs jours. De plus, elles devaient démontrer un temps de circulation plasmatique prolongée afin de favoriser l’accumulation passive du médicament encapsulé au niveau de la tumeur. La première partie du travail visait à employer pour la première fois le copolymère amphiphile PVP-b-PDLLA comme émulsifiant dans la préparation de nanoparticules polymères. Ainsi, une méthode de fabrication des nanoparticules par émulsion huile-dans-eau a été appliquée afin de produire des nanoparticules à base de PDLLA de taille inférieure à 250 nm. Grâce aux propriétés lyoprotectrices de la couronne de PVP présente à la surface des nanoparticules, celles-ci pouvaient retrouver leur distribution de taille initiale après lyophilisation et redispersion en milieu aqueux. Deux anticancéreux hydrophobes, soit le PTX et l’étoposide (ETO), ont été encapsulés dans les nanoparticules et libérés de ces dernières de façon contrôlée sur plusieurs jours in vitro. Une procédure de « salting-out » a été appliquée afin d’améliorer le taux d’incorporation de l’ETO initialement faible étant donnée sa solubilité aqueuse légèrement supérieure à celle du PTX. Le second volet des travaux visait à comparer le PVP comme polymère de surface des nanoparticules au PEG, le polymère le plus fréquemment employé à cette fin en vectorisation. Par le biais d’études d’adsorption de protéines, de capture par les macrophages et de biodistribution chez le rat, nous avons établi une corrélation in vitro/in vivo démontrant que le PVP n’était pas un agent de surface aussi efficace que le PEG. Ainsi, malgré la présence du PVP à la surface des nanoparticules de PDLLA, ces dernières étaient rapidement éliminées de la circulation sanguine suite à leur capture par le système des phagocytes mononucléés. Par conséquent, dans le troisième volet de cette thèse, le PEG a été retenu comme agent de surface, tandis que différents polymères biodégradables de la famille des polyesters, certains synthétiques (PDLLA et copolymères d’acide lactique/acide glycolique), d’autres de source naturelle (poly(hydroxyalkanoates)(PHAs)), ont été investiguées comme matériaux formant le cœur des nanoparticules. Il en est ressorti que les propriétés physicochimiques des polyesters avaient un impact majeur sur l’efficacité d’encapsulation du PTX et son profil de libération des nanoparticules in vitro. Contrairement aux PHAs, les polymères synthétiques ont démontré des taux d’incorporation élevés ainsi qu’une libération contrôlée de leur cargo. Des études de pharmacocinétique et de biodistribution ont démontré que les nanoparticules de PDLLA dotées d’une couronne de PEG conféraient un temps de circulation plasmatique prolongé au PTX et favorisaient son accumulation tumorale. Les nanoparticules polymères représentent donc une alternative intéressante au Taxol®.

Variation de l’expression et de l’activité des 11β-hydroxystéroïde déshydrogénases rénales, cardiaques et placentaires au cours de la gestation de la rate

L’activation du système rénine-angiotensine-aldostérone peut entraîner le développement d’une hypertension artérielle et de la fibrose cardiaque. Toutefois, au cours de la grossesse, malgré une hausse substantielle des niveaux d’aldostérone, ces effets délétères ne sont pas observés. L’aldostérone exerce ses effets via les récepteurs des minéralocorticoïdes, les MR, qui peuvent également lier le cortisol avec une affinité similaire. La régulation des niveaux locaux de ce glucocorticoïde par les 11β-hydroxystéroïde déshydrogénases (11β-HSD) est donc essentielle pour éviter une stimulation inappropriée des MR. Nous suggérons que, durant la grossesse, ces enzymes sont impliquées dans la protection de la mère et du foetus contre les niveaux élevés d’aldostérone et de cortisol. Notre hypothèse de travail est que les mécanismes d’adaptation qui prennent place au cours de la grossesse nécessitent des changements d’expression (ARNm et protéine) et d’activité des 11β-HSD spécifiques selon le tissu. Des rates Sprague-Dawley ont été sacrifiées aux jours 14, 17, 19 et 22 de gestation (terme = jour 23) et leurs organes ont été collectés. Dans le rein, les niveaux protéiques des 11β-HSD sont diminués en fin de gestation. Dans le placenta, on observe une importante chute de l’expression génique et protéique de la 11β-HSD1 au jour 17 tandis que la 11β-HSD2 y est augmentée. L’expression et l’activité de la 11β-HSD2 sont par la suite diminuées jusqu’à terme. Aucune différence significative n’est retrouvée dans le ventricule gauche cardiaque. En conclusion, nos résultats démontrent que la gestation est accompagnée d’importants changements dans le placenta, possiblement pour assurer un développement foetal adéquat, tandis que le rein et le coeur sont peu ou pas affectés. Des études plus approfondies sur l’expression des MR dans ces tissus nous aideront à mieux comprendre l’implication des 11β-HSD au fil de la gestation.

Étude de l’efficacité de la vaccination à Salmonella Enteritidis chez la poule pondeuse et de la protection contre l’infection

Les infections à Salmonella Enteritidis chez les humains sont associées à la consommation d’œufs ou d’ovoproduits contaminés. La vaccination est un outil utilisé pour diminuer les risques d’infection à SE chez la volaille, mais avec des résultats variables. Au Canada deux bactérines, MBL SE4C et Layermune, sont couramment utilisées pour lutter contre SE. Cependant, leur efficacité n’a pas été complètement déterminée chez les poules pondeuses plus âgées. Par ailleurs, la capacité de ces vaccins à prévenir la transmission verticale et horizontale n’a pas encore été étudiée. L’objectif principal de cette étude était d’évaluer l’effet des deux bactérines sur la réponse immunitaire chez les poules pondeuses, de vérifier la protection conférée par ces vaccins contre l’infection expérimentale à SE, et d’identifier des protéines immunogènes afin de développer un vaccin sous-unitaire. Les oiseaux ont été vaccinés avec deux protocoles d’immunisation en cours d’élevage (soit à 12 et 18, ou à 16 semaines d’âge). Le groupe contrôle a été injecté avec la solution saline. Les oiseaux ont été inoculés per os avec 2 x 109 CFU de la souche SE lysotype 4 à 55 ou à 65 semaines d’âge. Les anticorps (IgG et IgA) ont été mesurés à différents temps avec un ELISA maison en utilisant l’antigène entier de SE. La phagocytose, flambée oxydative, les populations des splénocytes B et T ont été analysées en utilisant la cytométrie en flux. Les signes cliniques, l’excrétion fécale, la contamination des jaunes d’œufs et l’invasion des salmonelles dans les organes ont été étudiés pour évaluer l’efficacité de protection. La transmission horizontale a aussi été étudiée en évaluant l’infection à SE chez les oiseaux mis en contact avec les oiseaux inoculés. Les protéines immunogènes ont été identifiées par SDS-PAGE et Western blot à l’aide d’antisérums prélevés suite à la vaccination et/ou à l’infection expérimentale/naturelle, puis caractérisées par la spectrométrie de masse. Le protocole de vaccination avec deux immunisations a généré un niveau élevé de séroconversion à partir de 3 jusqu’à 32-34 semaines post-vaccination par rapport à celui avec une seule immunisation (p < 0.02), mais il n’y avait plus de différence entre les groupes à 54 et 64 semaines d’âge. Il n’y a pas eu de corrélation entre les niveaux d’IgG et les taux d’isolement des salmonelles dans les organes et des jaunes d’œuf. La production des IgA n’a été observée que chez les oiseaux vaccinés avec 2 injections de MBL SE4C (p ≤ 0.04). Après l’infection expérimentale, la production des IgA a été significativement plus élevée aux jours 1 et 7 p.i dans l’oviducte des oiseaux vaccinés (sauf pour le groupe vacciné avec 2 injections de Layermune) par comparaison avec le groupe contrôle (p ≤ 0.03). Seule la bactérine MBL SE4C a eu un effet protecteur contre la contamination des jaunes d’œuf chez les oiseaux infectés. Ce vaccin réduit partiellement en utilisant deux immunisations, le taux d’excrétion fécale des salmonelles chez les oiseaux inoculés et les oiseaux horizontalement infectés (p ≤ 0.02). Cinq des protéines identifiées par la spectrométrie de masse sont considérées comme des protéines potentiellement candidates pour une étude plus approfondie de leur immonogénicité: Lipoamide dehydrogenase, Enolase (2-phosphoglycerate dehydratase) (2-phospho-D-glycerate hydro-lyase), Elongation factor Tu (EF-Tu), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) et DNA protection during starvation protein. En général, les bactérines ont induit une immunité humorale (IgG et IgA) chez les poules pondeuses. Cette réponse immunitaire a protégé partiellement les oiseaux quant à l’élimination des salmonelles, la contamination des jaunes d’œuf, ainsi que la transmission horizontale. Dans cette étude, la bactérine MBL SE4C (avec deux immunisations) s’est montrée plus efficace pour protéger les oiseaux que la bactérine Layermune. Nos résultats apportent des informations objectives et complémentaires sur le potentiel de deux bactérines pour lutter contre SE chez les poules pondeuses. Étant donné la protection partielle obtenue en utilisant ces vaccins, l’identification des antigènes immunogènes a permis de sélectionner des protéines spécifiques pour l’élaboration éventuelle d’un vaccin plus efficace contre SE chez les volailles.

Le diabète maternel influence la morphogenèse rénale et la programmation périnatale

Le diabète maternel est un facteur de risque majeur pour le développement de malformations congénitales. Dans le syndrome de l’embryopathie diabétique, l’exposition prolongée du fœtus à de hautes concentrations ambientes de glucose induit des dommages qui peuvent affecter plusieurs organes, dont les reins. Les malformations rénales sont la cause de près de 40 pourcent des cas d’insuffisance rénale infantile. L’hyperglycémie constitue un environnement utérin adverse qui nuit à la néphrogenèse et peut causer l’agenèse, la dysplasie (aplasie) ou l’hypoplasie rénale. Les mécanismes moléculaires par lesquels les hautes concentrations ambientes de glucose mènent à la dysmorphogenèse et aux malformations demeurent toutefois mal définis. Le diabète maternel prédispose aussi la progéniture au développement d’autres problèmes à l’âge adulte, tels l’hypertension, l’obésité et le diabète de type 2. Ce phénomène appelé ‘programmation périnatale’ a suscité l’intérêt au cours des dernières décennies, mais les mécanismes responsables demeurent mal compris. Mes études doctorales visaient à élucider les mécanismes moléculaires par lesquels le diabète maternel ou un environnement in utero hyperglycémique affecte la néphrogenèse et programme par la suite la progéniture a développer de l’hypertension par des observations in vitro, ex vivo et in vivo. Nous avons utilisé les cellules MK4, des cellules embryonnaires du mésenchyme métanéphrique de souris, pour nos études in vitro et deux lignées de souris transgéniques (Tg) pour nos études ex vivo et in vivo, soient les souris HoxB7-GFP-Tg et Nephrin-CFP-Tg. Les souris HoxB7-GFP-Tg expriment la protéine fluorescente verte (GFP) dans le bourgeon urétérique (UB), sous le contrôle du promoteur HoxB7. Les souris Nephrin-CFP expriment la protéine fluorescente cyan (CFP) dans les glomérules, sous le contrôle du promoteur nephrin spécifique aux podocytes. Nos études in vitro visaient à déterminer si les hautes concentrations de glucose modulent l’expression du gène Pax2 dans les cellules MK4. Les cellules MK4 ont été traitées pendant 24h avec du milieu contenant soit 5mM D-glucose et 20mM D-mannitol ou 25mM D-glucose et avec ou sans antioxydants ou inhibiteurs de p38 MAPK, p44/42 MAPK, PKC et NF-kB. Nos résultats ont démontré que le D-glucose élevé (25mM) augmente la génération des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les cellules MK4 et induit spécifiquement l’expression du gène Pax2. Des analogues du glucose tels le D-mannitol, L-glucose ou le 2-Deoxy-D-glucose n’induisent pas cette augmentation dans les cellules MK4. La stimulation de l’expression du gène Pax2 par le D-glucose dans les cellules MK4 peut être bloquée par des inhibiteurs des ROS et de NF-kB, mais pas par des inhibiteurs de p38 MAPK, p44/42 MAPK ou PKC. Ces résultats indiquent que la stimulation de l’expression du gène Pax2 par les concentrations élevées de glucose est due, au moins en partie, à la génération des ROS et l’activation de la voie de signalisation NF-kB, et non pas via les voies PKC, p38 MAPK et p44/42 MAPK. Nos études ex vivo s’intéressaient aux effets d’un milieu hyperglycémique sur la morphogenèse de la ramification du bourgeon urétérique (UB). Des explants de reins embryonnaires (E12 à E18) ont été prélevés par micro-dissection de femelles HoxB7-GFP gestantes. Les explants ont ensuite été cultivés dans un milieu contenant soit 5mM D-glucose et 20mM D-mannitol ou 25mM D-glucose et avec ou sans antioxydants, catalase ou inhibiteur de PI3K/AKT pour diverses durées. Nos résultats ont démontré que le D-glucose stimule la ramification du UB de manière spécifique, et ce via l’expression du gène Pax2. Cette augmentation de la ramification et de l’expression du gène Pax2 peut être bloquée par des inhibiteurs des ROS et de PI3K/AKT. Ces études ont démontré que les hautes concentrations de glucose altèrent la morphogenèse de la ramification du UB via l’expression de Pax2. L’effet stimulant du glucose semble s’effectuer via la génération des ROS et l’activation de la voie de signalisation Akt. Nos études in vivo visaient à déterminer le rôle fondamental du diabète maternel sur les défauts de morphogenèse rénale chez la progéniture. Dans notre modèle animal, le diabète maternel est induit par le streptozotocin (STZ) chez des femelles HoxB7-GFP gestantes (E13). Les souriceaux ont été étudiés à différents âges (naissants et âgés de une, deux ou trois semaines). Nous avons examiné leurs morphologie rénale, nombre de néphrons, expression génique et les événements apoptotiques lors de cette étude à court terme. La progéniture des mères diabétiques avait un plus faible poids, taille et poids des reins, et possédait des glomérules plus petits et moins de néphrons par rapport à la progéniture des mères contrôles. La dysmorphogenèse rénale observée est peut-être causée par l’augmentation de l’apoptose des cellules dans la région du glomérule. Nos résultats ont montré que les souriceaux nés de mères diabétiques possèdent plus de podocytes apoptotiques et plus de marquage contre la caspase-3 active dans leurs tubules rénaux que la progéniture des mères contrôles. Les souriceaux des mères diabétiques montrent une augmentation de l’expression des composants du système rénine angiotensine (RAS) intrarénal comme l’angiotensinogène et la rénine, ainsi qu’une augmentation des isoformes p50 et p65 de NF-kB. Ces résultats indiquent que le diabète maternel active le RAS intrarénal et induit l’apoptose des glomérules, menant à une altération de la morphogenèse rénale de la progéniture. En conclusion, nos études ont permis de démontrer que le glucose élevé ou l’environnement in utero diabétique altère la morphogenèse du UB, qui résulte en un retard dans la néphrogenèse et produit des reins plus petits. Cet effet est dû, au moins en partie, à la génération des ROS, à l’activation du RAS intrarénal et à la voie NF-kB. Nos études futures se concentreront sur les mécanismes par lesquels le diabète maternel induit la programmation périnatale de l’hypertension chez la progéniture adulte. Cette étude à long terme porte sur trois types de progénitures : adultes nés de mères contrôles, diabétiques ou diabétiques traitées avec insuline pendant la gestation. Nous observerons la pression systolique, la morphologie rénale et l’expression de divers gènes et protéines. Nous voulons de plus déterminer si la présence d’un système antioxydant (catalase) peut protéger la progéniture des effets néfastes des ROS causés par l’environnement in utero hyperglycémique. Les souris Catalase-Tg expriment la catalase spécifiquement dans les tubules proximaux et nous permettrons d’explorer notre hypothèse sur le rôle des ROS dans notre modèle expérimental de diabète maternel.

La mise en marché des produits issus du génie tissulaire: Une question de catégorisation?

Le génie tissulaire est un domaine interdisciplinaire qui applique les principes du génie et des sciences de la vie (notamment la science des cellules souches) dans le but de régénérer et réparer les tissus et organes lésés. En d'autres mots, plutôt que de remplacer les tissus et les organes, on les répare. La recherche en génie tissulaire est considérable et les ambitions sont grandes, notamment celle de mettre fm aux listes d'attente de dons d'organes. Le génie tissulaire a déjà commencé à livrer des produits thérapeutiques pour des applications simples, notamment la peau et le cartilage. Les questions sur la façon de réglementer les produits thérapeutiques qui sont issus du génie tissulaire sont soulevées à chaque nouveau produit. À ce jour, ces questions ont reçu peu d'attention comparativement aux questions éthiques associées aux recherches avec les cellules souches et les risques qu'engendrent les produits biologiques. Il est donc important d'examiner si le cadre normatif qui entoure la mise en marché des produits issus du génie tissulaire est approprié puisque de tels produits sont déjà disponibles sur le marché et plusieurs autres sont en voie de l'être. Notre analyse révèle que le cadre canadien actuel n'est pas approprié et le moment d'une reforme est arrivé. Les États-Unis et l'Union européenne ont chacun des approches particulières qui sont instructives. Nous avons entrepris une revue des textes réglementaires qui encadrent la mise en marché des produits issus du génie tissulaire au Canada, aux États-Unis et dans l'Union européenne et formulons quelques suggestions de réforme.

Perceptions de néphrologues transplanteurs et référents face à la quantification du risque immunologique global en transplantation rénale

Problématique : La pénurie d’organes qui sévit actuellement en transplantation rénale incite les chercheurs et les équipes de transplantation à trouver de nouveaux moyens afin d’en améliorer l’efficacité. Le Groupe de recherche transdisciplinaire sur les prédicteurs du risque immunologique du FRSQ travaille actuellement à mettre en place de nouveaux outils facilitant la quantification du risque immunologique global (RIG) de rejet de chaque receveur en attente d’une transplantation rénale. Le calcul du RIG s’effectuerait en fonction de facteurs scientifiques et quantifiables, soit le biologique, l’immunologique, le clinique et le psychosocial. La détermination précise du RIG pourrait faciliter la personnalisation du traitement immunosuppresseur, mais risquerait aussi d’entraîner des changements à l’actuelle méthode de sélection des patients en vue d’une transplantation. Cette sélection se baserait alors sur des critères quantifiables et scientifiques. L’utilisation de cette méthode de sélection possède plusieurs avantages, dont celui d’améliorer l’efficacité de la transplantation et de personnaliser la thérapie immunosuppressive. Malgré tout, cette approche soulève plusieurs questionnements éthiques à explorer chez les différents intervenants œuvrant en transplantation rénale quant à sa bonne utilisation. Buts de l’étude : Cette recherche vise à étudier les perceptions de néphrologues transplanteurs et référents de la province de Québec face à l’utilisation d’une méthode de sélection des patients basée sur des critères scientifiques et quantifiables issus de la médecine personnalisée. Les résultats pourront contribuer à déterminer la bonne utilisation de cette méthode et à étudier le lien de plus en plus fort entre science et médecine. Méthodes : Des entretiens semi-dirigés combinant l’emploi de courtes vignettes cliniques ont été effectués auprès de 22 néphrologues québécois (transplanteurs et référents) entre juin 2007 à juillet 2008. Le contenu des entretiens fut analysé qualitativement selon la méthode d’analyse de Miles et Huberman. Résultats : Les résultats démontrent une acceptation généralisée de cette approche. La connaissance du RIG pour chaque patient peut améliorer le traitement et la prise en charge post-greffe. Son efficacité serait supérieure à la méthode actuelle. Par contre, la possible exclusion de patients pose un important problème éthique. Cette nouvelle approche doit toutefois être validée scientifiquement et accorder une place au jugement clinique. Conclusions : La médecine personnalisée en transplantation devrait viser le meilleur intérêt du patient. Malgré l’utilisation de données scientifiques et quantifiables dans le calcul du RIG, le jugement clinique doit demeurer en place afin d’aider le médecin à prendre une décision fondée sur les données médicales, son expertise et sa connaissance du patient. Une réflexion éthique approfondie s’avère nécessaire quant à l’exclusion possible de patients et à la résolution de la tension entre l’équité et l’efficacité en transplantation rénale.

Studies on the exaggerated inflammatory response caused by streptococcus suis at systemic and central nervous system levels

Streptococcus suis de type 2 est un microorganisme pathogène d’importance chez le porc. Il est la cause de différentes pathologies ayant comme caractéristique commune la méningite. C’est également un agent émergeant de zoonose : des cas cliniques humains ont récemment été rapportés en Asie. Cependant, la pathogénèse de S. suis n’est pas encore complètement élucidée. Jusqu’à présent, la réponse pro-inflammatoire initiée par S. suis n’a été étudiée qu’in vitro. L’étude du choc septique et de la méningite requiert toujours des modèles expérimentaux appropriés. Au cours de cette étude, nous avons développé un modèle in vivo d’infection chez la souris qui utilise la voie d’inoculation intra-péritonéale. Ce modèle a servi à l’étude de la réponse pro-inflammatoire associée à ce pathogène, tant au niveau systémique qu’au niveau du système nerveux central (SNC). Il nous a également permis de déterminer si la sensibilité aux infections à S. suis pouvait être influencée par des prédispositions génétiques de l’hôte. Le modèle d’infection par S. suis a été mis au point sur des souris de lignée CD1. Les résultats ont démontré une bactériémie élevée pendant les trois jours suivant l’infection. Celle-ci était accompagnée d’une libération rapide et importante de différentes cytokines pro-inflammatoires (TNF-α, IL-6, IL-12p40/p70, IFN-ɣ) et de chémokines (KC, MCP-1 and RANTES), qui ont entraîné un choc septique et la mort de 20 % des animaux. Ensuite, pour confirmer le rôle de l’inflammation sur la mortalité et pour déterminer si les caractéristiques génétiques de l’hôte pouvaient influencer la réponse inflammatoire et l’issue de la maladie, le modèle d’infection a été étendu à deux lignées murines consanguines différentes considérées comme résistante : la lignée C57BL/6 (B6), et sensible : la lignée A/J. Les résultats ont démontré une importante différence de sensibilité entre les souris A/J et les souris B6, avec un taux de mortalité atteignant 100 % à 20 h post-infection (p.i.) pour la première lignée et de seulement 16 % à 36 h p.i. pour la seconde. La quantité de bactéries dans le sang et dans les organes internes était similaire pour les deux lignées. Donc, tout comme dans la lignée CD1, la bactériémie ne semblait pas être liée à la mort des souris. La différence entre les taux de mortalité a été attribuée à un choc septique non contrôlé chez les souris A/J infectées par S. suis. Les souris A/J présentaient des taux exceptionnellement élevés de TNF-α, IL-12p40/p70, IL-1β and IFN- γ, significativement supérieurs à ceux retrouvés dans la lignée B6. Par contre, les niveaux de chémokines étaient similaires entre les lignées, ce qui suggère que leur influence est limitée dans le développement du choc septique dû à S. suis. Les souris B6 avaient une production plus élevée d’IL-10, une cytokine anti-inflammatoire, ce qui suppose que la cascade cytokinaire pro-inflammatoire était mieux contrôlée, entraînant un meilleur taux de survie. Le rôle bénéfique potentiel de l’IL-10 chez les souris infectées par S. suis a été confirmé par deux approches : d’une part en bloquant chez les souris B6 le récepteur cellulaire à l’IL-10 (IL-10R) par un anticorps monoclonal anti-IL-10R de souris et d’autre part en complémentant les souris A/J avec de l’IL-10 de souris recombinante. Les souris B6 ayant reçu le anticorps monoclonal anti-IL-10R avant d’être infectées par S. suis ont développé des signes cliniques aigus similaires à ceux observés chez les souris A/J, avec une mortalité rapide et élevée et des taux de TNF-α plus élevés que les souris infectées non traitées. Chez les souris A/J infectées par S. suis, le traitement avec l’IL-10 de souris recombinante a significativement retardé l’apparition du choc septique. Ces résultats montrent que la survie au choc septique dû à S. suis implique un contrôle très précis des mécanismes pro- et anti-inflammatoires et que la réponse anti-inflammatoire doit être activée simultanément ou très rapidement après le début de la réponse pro-inflammatoire. Grâce à ces expériences, nous avons donc fait un premier pas dans l’identification de gènes associés à la résistance envers S. suis chez l’hôte. Une des réussites les plus importantes du modèle d’infection de la souris décrit dans ce projet est le fait que les souris CD1 ayant survécu à la septicémie présentaient dès 4 jours p.i. des signes cliniques neurologiques clairs et un syndrome vestibulaire relativement similaires à ceux observés lors de méningite à S. suis chez le porc et chez l’homme. L’analyse par hybridation in situ combinée à de l’immunohistochimie des cerveaux des souris CD1 infectées a montré que la réponse inflammatoire du SNC débutait avec une augmentation significative de la transcription du Toll-like receptor (TLR)2 et du CD14 dans les microvaisseaux cérébraux et dans les plexus choroïdes, ce qui suggère que S. suis pourrait se servir de ces structures comme portes d’entrée vers le cerveau. Aussi, le NF-κB (suivi par le système rapporteur de l’activation transcriptionnelle de IκBα), le TNF-α, l’IL-1β et le MCP-1 ont été activés, principalement dans des cellules identifiées comme de la microglie et dans une moindre mesure comme des astrocytes. Cette activation a également été observée dans différentes structures du cerveau, principalement le cortex cérébral, le corps calleux, l’hippocampe, les plexus choroïdes, le thalamus, l’hypothalamus et les méninges. Partout, cette réaction pro-inflammatoire était accompagnée de zones extensives d’inflammation et de nécrose, de démyélinisation sévère et de la présence d’antigènes de S. suis dans la microglie. Nous avons mené ensuite des études in vitro pour mieux comprendre l’interaction entre S. suis et la microglie. Pour cela, nous avons infecté des cellules microgliales de souris avec la souche sauvage virulente (WT) de S. suis, ainsi qu’avec deux mutants isogéniques, un pour la capsule (CPS) et un autre pour la production d’hémolysine (suilysine). Nos résultats ont montré que la capsule était un important mécanisme de résistance à la phagocytose pour S. suis et qu’elle modulait la réponse inflammatoire, en dissimulant les composants pro-inflammatoires de la paroi bactérienne. Par contre, l’absence d’hémolysine, qui est un facteur cytotoxique potentiel, n’a pas eu d’impact majeur sur l’interaction de S. suis avec la microglie. Ces études sur les cellules microgliales ont permis de confirmer les résultats obtenus précédemment in vivo. La souche WT a induit une régulation à la hausse du TLR2 ainsi que la production de plusieurs médiateurs pro-inflammatoires, dont le TNF-α et le MCP-1. S. suis a induit la translocation du NF-kB. Cet effet était plus rapide dans les cellules stimulées par le mutant déficient en CPS, ce qui suggère que les composants de la paroi cellulaire représentent de puissants inducteurs du NF-kB. De plus, la souche S. suis WT a stimulé l’expression de la phosphotyrosine, de la PKC et de différentes cascades liées à l’enzyme mitogen-activated protein kinase (MAPK). Cependant, les cellules microgliales infectées par le mutant déficient en CPS ont montré des profils de phosphorylation plus forts et plus soutenus que celles infectées par le WT. Finalement, la capsule a aussi modulé l’expression de l’oxyde nitrique synthétase inductible (iNOS) induite par S. suis et par la production subséquente d’oxyde nitrique par la microglie. Ceci pourrait être lié in vivo à la neurotoxicité et à la vasodilatation. Nous pensons que ces résultats contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes sous-tendant l’induction de l’inflammation par S. suis, ce qui devrait permettre, d’établir éventuellement des stratégies plus efficaces de lutte contre la septicémie et la méningite. Enfin, nous pensons que ce modèle expérimental d’infection chez la souris pourra être utilisé dans l’étude de la pathogénèse d’autres bactéries ayant le SNC pour cible.

Étude du rôle de Pax6 dans la gliogenèse

Les astrocytes sont des cellules gliales présentes dans le système nerveux central, qui exercent de nombreuses fonctions physiologiques essentielles et sont impliquées dans la réponse aux lésions et dans plusieurs pathologies du cerveau. Les astrocytes sont générés par les cellules de la glie radiale, les précurseurs communs de la plupart des cellules neuronales et gliales du cerveau, après le début de la production des neurones. Le passage de la neurogenèse à la gliogenèse est le résultat de mécanismes moléculaires complexes induits par des signaux intrinsèques et extrinsèques responsables du changement de propriété des précurseurs et de leur spécification. Le gène Pax6 code pour un facteur de transcription hautement conservé, impliqué dans plusieurs aspects du développement du système nerveux central, tels que la régionalisation et la neurogenèse. Il est exprimé à partir des stades les plus précoces dans les cellules neuroépithéliales (les cellules souches neurales) et dans la glie radiale, dérivant de la différenciation de ces cellules. L’objectif de cette étude est d’analyser le rôle de Pax6 dans la différenciation et dans le développement des astrocytes. À travers l’utilisation d’un modèle murin mutant nul pour Pax6, nous avons obtenu des résultats suggérant que la suppression de ce gène cause l'augmentation de la prolifération et de la capacité d'auto-renouvellement des cellules souches neurales embryonnaires. In vitro, les cellules mutantes prolifèrent de façon aberrante et sous-expriment les gènes p57Kip2, p16Ink4a, p19Arf et p21Cip1, qui inhibent la progression du le cycle cellulaire. De plus, Pax6 promeut la différenciation astrocytaire des cellules souches neurales embryonnaires et est requis pour la différenciation des astrocytes dans la moëlle épinière. Les mutants nuls pour Pax6 meurent après la naissance à cause de graves défauts développementaux dus aux fonctions essentielles de ce gène dans le développement embryonnaire de plusieurs organes. En utilisant un modèle murin conditionnel basé sur le système CRE/ loxP (hGFAP-CRE/ Pax6flox/flox) qui présente l’inactivation de Pax6 dans les cellules de la glie radiale, viable après la naissance, nous avons montré que Pax6 est impliqué dans la maturation et dans le développement post-natal des astrocytes. Le cortex cérébral des souris mutantes conditionnelles ne présente pas d’astrocytes matures à l’âge de 16 jours et une très faible quantité d’astrocytes immatures à l’âge de trois mois, suggérant que Pax6 promeut la différenciation et la maturation des astrocytes. De plus, Pax6 semble jouer un rôle même dans le processus de différenciation et de maturation de cellules gliales rétiniennes. L’étude des gènes et des mécanismes moléculaires impliqués dans la génération des astrocytes est crucial pour mieux comprendre le rôle physiologique et les altérations pathologiques des ces cellules.