23 resultados para ELECTROSPRAY IONIZATION TANDEM MASS SPECTROMETRY (ESI-MSn)
em Université de Montréal, Canada
Resumo:
Triple quadrupole mass spectrometers coupled with high performance liquid chromatography are workhorses in quantitative bioanalyses. It provides substantial benefits including reproducibility, sensitivity and selectivity for trace analysis. Selected Reaction Monitoring allows targeted assay development but data sets generated contain very limited information. Data mining and analysis of non-targeted high-resolution mass spectrometry profiles of biological samples offer the opportunity to perform more exhaustive assessments, including quantitative and qualitative analysis. The objectives of this study was to test method precision and accuracy, statistically compare bupivacaine drug concentration in real study samples and verify if high resolution and accurate mass data collected in scan mode can actually permit retrospective data analysis, more specifically, extract metabolite related information. The precision and accuracy data presented using both instruments provided equivalent results. Overall, the accuracy was ranging from 106.2 to 113.2% and the precision observed was from 1.0 to 3.7%. Statistical comparisons using a linear regression between both methods reveal a coefficient of determination (R2) of 0.9996 and a slope of 1.02 demonstrating a very strong correlation between both methods. Individual sample comparison showed differences from -4.5% to 1.6% well within the accepted analytical error. Moreover, post acquisition extracted ion chromatograms at m/z 233.1648 5 ppm (M-56) and m/z 305.2224 5 ppm (M+16) revealed the presence of desbutyl-bupivacaine and three distinct hydroxylated bupivacaine metabolites. Post acquisition analysis allowed us to produce semiquantitative evaluations of the concentration-time profiles for bupicavaine metabolites.
Resumo:
Ketamine is widely used in medicine in combination with several benzodiazepines including midazolam. The objectives of this study were to develop a novel HPLC-MS/SRM method capable of quantifying ketamine and norketamine using an isotopic dilution strategy in biological matrices and study the formation of norketamine, the principal metabolite of ketamine with and without the presence of midazolam, a well-known CYP3A substrate. The chromatographic separation was achieved using a Thermo Betasil Phenyl 100 x 2 mm column combined with an isocratic mobile phase composed of acetonitrile, methanol, water and formic acid (60:20:20:0.4) at a flow rate of 300 L/min. The mass spectrometer was operating in selected reaction monitoring mode and the analytical range was set at 0.0550 M. The precision (%CV) and accuracy (%NOM) observed were ranging from 3.97.8 and 95.9.2111.1% respectively. The initial rate of formation of norketamine was determined using various ketamine concentration and Km values of 18.4 M, 13.8 M and 30.8 M for rat, dog and human liver S9 fractions were observed respectively. The metabolic stability of ketamine on liver S9 fractions was significantly higher in human (T1/2 = 159.4 min) compared with rat (T1/2 = 12.6 min) and dog (T1/2 = 7.3 min) liver S9 fractions. Moreover significantly lower IC50 and Ki values observed in human compared with rat and dog liver S9 fractions. Experiments with cDNA expressed CYP3A enzymes showed the formation of norketamine is mediated by CYP3A but results suggest an important contribution from others isoenzymes, most likely CYP2C particularly in rat.
Resumo:
Les dernires dcennies ont t marques par une augmentation du nombre des cas de cancers, ce qui a subsquemment conduit une augmentation dans la consommation des agents de chimiothrapie. La toxicit et le caractre cancrogne de ces molcules justifient lintrt crucial port leur gard. Quelques tudes ont fait lobjet de dtection et de quantification des agents de chimiothrapie dans des matrices environnementales. Dans ce projet, une mthode utilisant la chromatographie liquide couple la spectromtrie de masse en tandem (LC-MS/MS) prcde dune extraction sur phase solide (SPE) automatise ou en ligne a t dveloppe pour la dtection et la quantification dun groupe de six agents de chimiothrapie. Parmi ceux-ci figurent les plus utiliss au Qubec (gemcitabine, mthotrexate, cyclophosphamide, ifosfamide, irinotcan, pirubicine) et prsentant des proprits physico-chimiques et des structures chimiques diffrentes. La mthode dveloppe a t valide dans une matrice relle reprsentant laffluent dune station dpuration dans la rgion de Montral. Deux des six composs cytotoxiques tudis en loccurrence (cyclophosphamide et mthotrexate) ont t dtects dans huit chantillons sur les neuf qui ont t recenss, essentiellement au niveau de laffluent et leffluent de quelques stations dpuration de la rgion de Montral. Les rsultats des analyses effectues sur les chantillons rels ont montr quil ny avait pas de diffrence significative dans la concentration entre laffluent et leffluent, et donc que les systmes dpuration semblent inefficaces pour la dgradation de ces molcules.
Resumo:
Le prsent projet vise documenter la ncessit daugmenter notre connaissance de la prsence des contaminants organiques tels que les mdicaments dans lenvironnement et dvaluer leur devenir environnemental. On a tudi la prsence de composs pharmaceutiques dans diffrents chantillons d'eau. On a focalis nos efforts spcialement sur les chantillons d'eau de l'usine d'puration de la Ville de Montral et ses effluents, les eaux de surface avoisinantes et leau du robinet dans la rgion de Montral. Pour ce faire, on a tout dabord dvelopp deux mthodes analytiques automatises bases sur la chromatographie liquide avec extraction en phase solide (SPE) couple la chromatographie liquide couple la spectromtrie de masse en tandem (LC-MS/MS). On a galement tudi les performances des trois techniques d'ionisation pression atmosphrique (API), pour ensuite les utiliser dans la mthode analytique dveloppe. On a dmontr que l'ionisation par lectronbulisation (ESI) est une mthode d'ionisation plus efficace pour l'analyse des contaminants pharmaceutiques dans des chantillons de matrices trs complexes comme les eaux uses. Une premire mthode analytique SPE couple la LC-MS/MS a t dveloppe et valide pour l'tude des chantillons complexes provenant de l'usine d'puration de la Ville de Montral et des eaux de surface prs de l'usine. Cinq mdicaments de prescription ont t tudis: le bzafibrate (un rgulateur de lipides), le cyclophosphamide et le mthotrexate (deux agents anticancreux), l'orlistat (un agent anti-obsit) et lnalapril (utilis dans le traitement de l'hypertension). La plupart de ces drogues sont excrtes par le corps humain et rejetes dans les eaux uses domestiques en faisant par la suite leur chemin vers les usines municipales de traitement des eaux uses. On a pu dmontrer qu'il y a un faible taux dlimination l'usine d'puration pour le bzafibrate et l'nalapril. Ces deux composs ont aussi t dtects dans les eaux de surface sur un site proximit immdiate de la dcharge de leffluent de la station d'puration. i En observant la ncessit de l'amlioration des limites de dtection de la premire mthode analytique, une deuxime mthode a t dveloppe. Pour la deuxime mthode, un total de 14 contaminants organiques, incluant trois agents anti-infectieux (clarithromycin, sulfamthoxazole et trimthoprime), un anticonvulsant (carbamazpine) et son produit de dgradation (10,11-dihydrocarbamazpine), l'agent antihypertensif (enalapril), deux antinoplastiques utiliss en chimiothrapie (cyclophosphamide et mthotrexate), des herbicides (atrazine, cyanazine, et simazine) et deux produits de transformation de latrazine (desthylatrazine et disopropylatrazine) ainsi quun agent antiseptique (triclocarban). Ces produits ont t quantifis dans les eaux de surface ainsi que dans leau du robinet. L'amlioration des limites de dtection pour cette mthode a t possible grce la charge d'un volume d'chantillon suprieur celui utilis dans la premire mthode (10 mL vs 1 mL). D'autres techniques de confirmation, telles que les spectres des ions produits utilisant une pente dnergie de collision inverse dans un spectromtre de masse triple quadriple et la mesure des masses exactes par spectromtrie de masse temps denvol, ont t explores. L'utilisation d'un analyseur de masse temps denvol a permis la confirmation de 6 des 14 analytes. Finalement, tant donn leur haute toxicit et pour valuer leur persistance et leur transformation au niveau du traitement des eaux potables, la cintique d'oxydation du cyclophosphamide et de mthotrexate avec l'ozone molculaire et des radicaux OH a t tudie. Les constantes de dgradation avec l'ozone molculaire ont t calcules et la qualit de l'eau aprs traitement a pu tre value. Le rendement du processus d'ozonation a t amlior pour la cyclophosphamide dans les eaux naturelles, en raison de la combinaison de ractions directes et indirectes. Cette tude a montr que l'ozone est trs efficace pour oxyder le mthotrexate mais que le cyclophosphamide serait trop lent soxyder pour un traitement efficace aux conditions usuelles de traitement de leau potable.
Resumo:
Tachykinin and opioid peptides play a central role in pain transmission, modulation and inhibition. The treatment of pain is very important in medicine and many studies using NK1 receptor antagonists failed to show significant analgesic effects in humans. Recent investigations suggest that both pronociceptive tachykinins and the analgesic opioid systems are important for normal pain sensation. The analysis of opioid peptides in Tac1-/- spinal cord tissues offers a great opportunity to verify the influence of the tachykinin system on specific opioid peptides. The objectives of this study were to develop a HPLCMS/MRM assay to quantify targeted peptides in spinal cord tissues. Secondly, we wanted to verify if the Tac1-/- mouse endogenous opioid system is hampered and therefore affect significantly the pain modulatory pathways. Targeted neuropeptides were analyzed by high performance liquid chromatography linear ion trap mass spectrometry. Our results reveal that EM-2, Leu-Enk and Dyn A were down-regulated in Tac1-/- spinal cord tissues. Interestingly, Dyn A was almost 3 fold down-regulated (p < 0.0001). No significant concentration differences were observed in mouse Tac1-/- spinal cords for Met-Enk and CGRP. The analysis of Tac1-/- mouse spinal cords revealed noteworthy decreases of EM-2, Leu-Enk and Dyn A concentrations which strongly suggest a significant impact on the endogenous pain-relieving mechanisms. These observations may have insightful impact on future analgesic drug developments and therapeutic strategies.
Resumo:
Les phytochlatines (PC) sont des polypeptides ayant la structure gnrale, (alpha-Glu-Cys)n-Gly, o n = 2 11. Leur synthse est induite par un grand nombre de vgtaux en rponse une lvation de la concentration du milieu en mtaux, en particulier le cadmium (ci-aprs, Cd). Le but de cette tude a t de dvelopper un outil pour valuer la biodisponibilit du Cd dans les eaux douces. Pour ce faire, une mthode analytique a t ralise afin de dterminer les phytochlatines induites dans les algues C. reinhardtii. Celle-ci consiste utiliser la chromatographie liquide couple la spectromtrie de masse en tandem (LCHP-SM/SM) "on-line". Lionisation des molcules est celle faite par lectronbulisation (IEN) (traduction de electrospray ionisation). Lobjectif principal de ce mmoire est la validation de cette mthode : la dtermination des courbes de calibration et des limites de dtection et l'identification d'interfrences potentielles. Lutilisation de dithiothreitol (DTT) une concentration de 25 mM a t ncessaire la conservation de la forme rduite des phytochlatines. En effet, suite la validation de la mthode danalyse des phytochlatines il a t dmontr quelle reprsente un potentiel dapplication. Ceci dans la mesure o linduction des phytochlatines (PC2, PC3 et PC4) dans les algues C. reinhardtii a t possible deux concentrations de Cd (1 x 10-7 M et 1 x 10 6 M) et ce, aprs plusieurs temps d'induction (1, 2, 4, et 6 h). Ainsi, ltude de la stabilit des phytochlatines a t ralise et toutes les tempratures examines ont dmontr une diminution des phytochlatines analyses par HPLC-ESI-MS/MS. Il se pourrait que la cause de la dgradation des phytochlatines soit physique ou chimique plutt que bactrienne. Toutefois, un approfondissement au niveau de la purification de la solution dextraction serait ncessaire la mise au point de la dite mthode analytique afin de quantifier les phytochlatines dans lalgue C. reinhardtii.
Resumo:
La spectromtrie de masse mesure la masse des ions selon leur rapport masse sur charge. Cette technique est employe dans plusieurs domaines et peut analyser des mlanges complexes. Limagerie par spectromtrie de masse (Imaging Mass Spectrometry en anglais, IMS), une branche de la spectromtrie de masse, permet lanalyse des ions sur une surface, tout en conservant lorganisation spatiale des ions dtects. Jusqu prsent, les chantillons les plus tudis en IMS sont des sections tissulaires vgtales ou animales. Parmi les molcules couramment analyses par lIMS, les lipides ont suscit beaucoup d'intrt. Les lipides sont impliqus dans les maladies et le fonctionnement normal des cellules; ils forment la membrane cellulaire et ont plusieurs rles, comme celui de rguler des vnements cellulaires. Considrant limplication des lipides dans la biologie et la capacit du MALDI IMS les analyser, nous avons dvelopp des stratgies analytiques pour la manipulation des chantillons et lanalyse de larges ensembles de donnes lipidiques. La dgradation des lipides est trs importante dans lindustrie alimentaire. De la mme faon, les lipides des sections tissulaires risquent de se dgrader. Leurs produits de dgradation peuvent donc introduire des artefacts dans lanalyse IMS ainsi que la perte despces lipidiques pouvant nuire la prcision des mesures dabondance. Puisque les lipides oxyds sont aussi des mdiateurs importants dans le dveloppement de plusieurs maladies, leur relle prservation devient donc critique. Dans les tudes multi-institutionnelles o les chantillons sont souvent transports dun emplacement lautre, des protocoles adapts et valids, et des mesures de dgradation sont ncessaires. Nos principaux rsultats sont les suivants : un accroissement en fonction du temps des phospholipides oxyds et des lysophospholipides dans des conditions ambiantes, une diminution de la prsence des lipides ayant des acides gras insaturs et un effet inhibitoire sur ses phnomnes de la conservation des sections au froid sous N2. A temprature et atmosphre ambiantes, les phospholipides sont oxyds sur une chelle de temps typique dune prparation IMS normale (~30 minutes). Les phospholipides sont aussi dcomposs en lysophospholipides sur une chelle de temps de plusieurs jours. La validation dune mthode de manipulation dchantillon est dautant plus importante lorsquil sagit danalyser un plus grand nombre dchantillons. Lathrosclrose est une maladie cardiovasculaire induite par laccumulation de matriel cellulaire sur la paroi artrielle. Puisque lathrosclrose est un phnomne en trois dimension (3D), l'IMS 3D en srie devient donc utile, d'une part, car elle a la capacit localiser les molcules sur la longueur totale dune plaque athromateuse et, d'autre part, car elle peut identifier des mcanismes molculaires du dveloppement ou de la rupture des plaques. l'IMS 3D en srie fait face certains dfis spcifiques, dont beaucoup se rapportent simplement la reconstruction en 3D et linterprtation de la reconstruction molculaire en temps rel. En tenant compte de ces objectifs et en utilisant lIMS des lipides pour ltude des plaques dathrosclrose dune carotide humaine et dun modle murin dathrosclrose, nous avons labor des mthodes open-source pour la reconstruction des donnes de lIMS en 3D. Notre mthodologie fournit un moyen dobtenir des visualisations de haute qualit et dmontre une stratgie pour linterprtation rapide des donnes de lIMS 3D par la segmentation multivarie. Lanalyse daortes dun modle murin a t le point de dpart pour le dveloppement des mthodes car ce sont des chantillons mieux contrls. En corrlant les donnes acquises en mode dionisation positive et ngative, lIMS en 3D a permis de dmontrer une accumulation des phospholipides dans les sinus aortiques. De plus, lIMS par AgLDI a mis en vidence une localisation diffrentielle des acides gras libres, du cholestrol, des esters du cholestrol et des triglycrides. La segmentation multivarie des signaux lipidiques suite lanalyse par IMS dune carotide humaine dmontre une histologie molculaire corrle avec le degr de stnose de lartre. Ces recherches aident mieux comprendre la complexit biologique de lathrosclrose et peuvent possiblement prdire le dveloppement de certains cas cliniques. La mtastase au foie du cancer colorectal (Colorectal cancer liver metastasis en anglais, CRCLM) est la maladie mtastatique du cancer colorectal primaire, un des cancers le plus frquent au monde. Lvaluation et le pronostic des tumeurs CRCLM sont effectus avec lhistopathologie avec une marge derreur. Nous avons utilis lIMS des lipides pour identifier les compartiments histologiques du CRCLM et extraire leurs signatures lipidiques. En exploitant ces signatures molculaires, nous avons pu dterminer un score histopathologique quantitatif et objectif et qui corrle avec le pronostic. De plus, par la dissection des signatures lipidiques, nous avons identifi des espces lipidiques individuelles qui sont discriminants des diffrentes histologies du CRCLM et qui peuvent potentiellement tre utilises comme des biomarqueurs pour la dtermination de la rponse la thrapie. Plus spcifiquement, nous avons trouv une srie de plasmalognes et sphingolipides qui permettent de distinguer deux diffrents types de ncrose (infarct-like necrosis et usual necrosis en anglais, ILN et UN, respectivement). LILN est associ avec la rponse aux traitements chimiothrapiques, alors que lUN est associ au fonctionnement normal de la tumeur.
Resumo:
Il est reconnu que le benzne, le tolune, lthylbenzne et les isomres du xylne, composs organiques volatils (COVs) communment dsigns BTEX, produisent des effets nocifs sur la sant humaine et sur les vgtaux dpendamment de la dure et des niveaux dexposition. Le benzne en particulier est class cancrogne et une exposition des concentrations suprieures 64 g/m3 de benzne peut tre fatale en 510 minutes. Par consquent, la mesure en temps rel des BTEX dans lair ambiant est essentielle pour dtecter rapidement un danger associ leur mission dans lair et pour estimer les risques potentiels pour les tres vivants et pour lenvironnement. Dans cette thse, une mthode danalyse en temps rel des BTEX dans lair ambiant a t dveloppe et valide. La mthode est base sur la technique dchantillonnage direct de lair couple avec la spectromtrie de masse en tandem utilisant une source dionisation chimique pression atmosphrique (APCI-MS/MS directe). La validation analytique a dmontr la sensibilit (limite de dtection LDM 12 g/m3), la prcision (coefficient de variation CV < 10%), lexactitude (exactitude > 95%) et la slectivit de la mthode. Des chantillons dair ambiant provenant dun site denfouissement de dchets industriels et de divers garages dentretien automobile ont t analyss par la mthode dveloppe. La comparaison des rsultats avec ceux obtenus par la technique de chromatographie gazeuse on-line couple avec un dtecteur ionisation de flamme (GC-FID) a donn des rsultats similaires. La capacit de la mthode pour lvaluation rapide des risques potentiels associs une exposition aux BTEX a t prouve travers une tude de terrain avec analyse de risque pour la sant des travailleurs dans trois garages dentretien automobile et par des expriences sous atmosphres simules. Les concentrations mesures dans lair ambiant des garages taient de 8,925 g/m3 pour le benzne, 1191156 g/m3 pour le tolune, 970 g/m3 pour lthylbenzne et 45347 g/m3 pour les xylnes. Une dose quotidienne environnementale totale entre 1,46 10-3 et 2,52 10-3 mg/kg/jour a t dtermine pour le benzne. Le risque de cancer li lexposition environnementale totale au benzne estim pour les travailleurs tudis se situait entre 1,1 10-5 et 1,8 10-5. Une nouvelle mthode APCI-MS/MS a t galement dveloppe et valide pour lanalyse directe de loctamthylcyclottrasiloxane (D4) et le dcamthylcyclopentasiloxane (D5) dans lair et les biogaz. Le D4 et le D5 sont des siloxanes cycliques volatils largement utiliss comme solvants dans les processus industriels et les produits de consommation la place des COVs prcurseurs dozone troposphrique tels que les BTEX. Leur prsence ubiquitaire dans les chantillons dair ambiant, due lutilisation massive, suscite un besoin dtudes de toxicit. De telles tudes requirent des analyses qualitatives et quantitatives de traces de ces composs. Par ailleurs, la prsence de traces de ces substances dans un biogaz entrave son utilisation comme source dnergie renouvelable en causant des dommages coteux lquipement. Lanalyse des siloxanes dans un biogaz savre donc essentielle pour dterminer si le biogaz ncessite une purification avant son utilisation pour la production dnergie. La mthode dveloppe dans cette tude possde une bonne sensibilit (LDM 46 g/m3), une bonne prcision (CV < 10%), une bonne exactitude (> 93%) et une grande slectivit. Il a t galement dmontr quen utilisant cette mthode avec lhexamthyl-d18-disiloxane comme talon interne, la dtection et la quantification du D4 et du D5 dans des chantillons rels de biogaz peuvent tre accomplies avec une meilleure sensibilit (LDM ~ 2 g/m3), une grande prcision (CV < 5%) et une grande exactitude (> 97%). Une varit dchantillons de biogaz prlevs au site denfouissement sanitaire du Complexe Environnemental de Saint-Michel Montral a t analyse avec succs par cette nouvelle mthode. Les concentrations mesures taient de 1311275 g/m3 pour le D4 et 2506226 g/m3 pour le D5. Ces rsultats reprsentent les premires donnes rapportes dans la littrature sur la concentration des siloxanes D4 et D5 dans les biogaz denfouissement en fonction de lge des dchets.
Resumo:
Avec la hausse mondiale de la frquence des floraisons de cyanobactries (CB), dont certaines produisent des cyanotoxines (CT), le dveloppement dune mthode de dtection/quantification rapide dun maximum de CT simpose. Cette mthode permettrait de faire un suivi quotidien de la toxicit de plans deau contamins par des CB et ainsi dmettre rapidement des avis dalerte appropris afin de protger la sant publique. Une nouvelle technologie utilisant la dsorption thermique induite par diode laser (LDTD) couple lionisation chimique sous pression atmosphrique (APCI) et relie la spectromtrie de masse en tandem (MS/MS) a dj fait ses preuves avec des temps d'analyse de lordre de quelques secondes. Les analytes sont dsorbs par la LDTD, ioniss en phase gazeuse par APCI et dtects par la MS/MS. Il ny a donc pas de sparation chromatographique, et la prparation de lchantillon avant lanalyse est minimale selon la complexit de la matrice contenant les analytes. Parmi les quatre CT testes (microcystine-LR, cylindrospermopsine, saxitoxine et anatoxine-a (ANA-a)), seule lANA-a a gnr une dsorption significative ncessaire au dveloppement dune mthode analytique avec linterface LDTD-APCI. La forte polarit ou le poids molculaire lev des autres CT empche probablement leur dsorption. Loptimisation des paramtres instrumentaux, tout en tenant compte de linterfrence isobarique de lacide amin phnylalanine (PHE) lors de la dtection de lANA-a par MS/MS, a gnr une limite de dtection dANA-a de lordre de 1 ug/L. Celle-ci a t value partir dune matrice apparente une matrice relle, dmontrant quil serait possible dutiliser la LDTD pour effectuer le suivi de lANA-a dans les eaux naturelles selon les normes environnementales applicables (1 12 ug/L). Il a t possible dviter linterfrence isobarique de la PHE en raison de sa trs faible dsorption avec linterface LDTD-APCI. En effet, il a t dmontr quune concentration aussi leve que 500 ug/L de PHE ne causait aucune interfrence sur le signal de lANA-a.
Resumo:
Le long bio-polymre d'ADN est condens lintrieur du noyau des cellules eukaryotes l'aide de petites protines appeles histones. En plus de leurs fonctions condensatrices,ces histones sont galement la cible de nombreuses modifications post-traductionnelles(MPT), particulirement au niveau de leur section N-terminale. Ces modifications rversibles font partie dun code dhistones pi-gntique transmissible qui orchestre et module dynamiquement certains vnements impliquant la chromatine, tels lactivation et la dsactivation de gnes ainsi que la duplication et la rparation dADN. Ces modifications sont impliques subsquemment dans la signalisation et la progression de cancers, tels que la leucmie. En consquence, l'lucidation des modifications dhistones est importante pour comprendre leurs fonctions biologiques. Une mthodologie analytique a t mise au point en laboratoire pour isoler, dtecter, et quantifier les MPT dhistones en utilisant une approche rapide deux volets laide doutils bioinformatiques spcialiss. La mthodologie dveloppe en laboratoire a t valide en utilisant des histones de souche sauvage ainsi que deux types dhistones mutants dficients en enzymes actyltransferase. Des trois sources dhistones utilises, la seule MPT qui a dmontr un changement significatif est lactylation de lhistone H3 lysine 56 (H3K56ac). Lexpression et la stoechiomtrie de cette MPT, issue de cellules de souche sauvage et de cellules mutantes, ont t dtermines avec prcision et compares. Les fonctions de balayage polyvalentes d'un instrument trappe ionique quadruple linaire hybride ont t utilises pour amliorer la dtection de protines intactes. Le mode de balayage enhanced multiply charged (EMC) a t modifi pour contenir et dtecter les ions de protines intactes situes dans la trappe ionique linaire. Ce mode de balayage nomm targeted EMC (tEMC) a permis de quadrupler le niveau de sensibilit (signal/interfrence), et quintupler la rsolution du mode de balayage conventionnel. De plus, la capacit de sparation des charges du tEMC a rduit de faon significative les effets de space charge dans la trappe ionique linaire. La rsolution suprieure du mode tEMC a permis de diffrencier plusieurs isoformes modifies, particulirement pour lhistone H3. Lanalyse des peptides dhistones trypsiques laide du mode de balayage MRM a permis le squenage et la quantification de MPT avec un haut degr de prcision. La seule MPT qui tait sous-exprime entre lhistone de souche sauvage et le mutant DOT1L fut la mthylation de lhistone H3 lysine 79(H3K79me1). Les effets de deux inhibiteurs denzymes HDAC (HDACi) sur lexpression de MPT dhistone ont t valus en utilisant la mthodologie analytique mentionne. Les histones extraites de cellules normales et cancreuses ont t exposes du Vorinostat(SAHA) ou du Entinostat (MS-275) pour une priode de 24 72 heures. Deux histones furent principalement affectes, soit H3 et H4. tonnamment, les mmes effets n'ont pas t dtects lorsque les cellules normales ont t traites avec le HDACi pour une priode de 48 72 heures. Une mthode absolue de quantification avec une courbe dtalonnage a t dveloppe pour le peptide H3K56ac. Contrairement certaines publications, nos rsultats dmontrent que cette MPT est prsente dans les cellules mammifres avec une stoechiomtrie trs basse (< 0,1%) et n'est pas surexprime de faon significative aprs le traitement au HDACi.
Resumo:
Les fichiers qui accompagnent mon document sont des tableaux supplmentaires raliss avec Excel (Microsoft Office), dans la version papier du mmoire ces fichiers sont sur un CD-ROM.
Resumo:
L'assemblage des nuclosomes est troitement couple la synthse des histones ainsi qu la rplication et la rparation de lADN durant la phase S. Ce processus implique un mcanisme de contrle qui contribue soigneusement et de manire rgule lassemblage de lADN en chromatine. L'assemblage des nuclosomes durant la synthse de lADN est crucial et contribue ainsi au maintien de la stabilit gnomique. Cette thse dcrit la caractrisation par spectromtrie de masse(SM) des protines jouant un rle critique dans lassemblage et le maintien de la structure chromatinienne. Plus prcisment, la phosphorylation de deux facteurs dassemblage des nuclosome, le facteur CAF-1, une chaperone dhistone qui participe l'assemblage de la chromatine spcifiquement couple la rplication de l'ADN, ainsi que le complexe protique Hir, jouant de plus un rle important dans la rgulation transcriptionelle des gnes dhistones lors de la progression normale du cycle cellulaire et en rponse aux dommages de l'ADN, a t examin. La caractrisation des sites de phosphorylation par SM ncssite la sparation des protines par lctrophorse suivi dune coloration a largent. Dans le chapitre 2, nous demontrons que la coloration largent induit un artfact de sulfatation. Plus prcisment, cet artfact est caus par un ractif spcifiquement utilis lors de la coloration. La sulfatation prsente de fortes similitudes avec la phosphorylation. Ainsi, lincrment de masse observ sur les peptides sulfats et phosphoryls (+80 Da) ncssite des instruments offrant une haute rsolution et haute prcision de masse pour diffrencier ces deux modifications. Dans les chapitres 3 et 4, nous avons dabord dmontr par SM que Cac1, la plus grande sous-unit du facteur CAF-1, est cible de plusieurs sites de phosphorylation. Fait intrssant, certains de ces sites contiennent des squences consensus pour les kinases Cdc7-Dbf4 et CDKs. Ainsi, ces rsultats fournissent les premires vidences que CAF-1 est potentiellement rgul par ces deux kinases in vivo. La fonction de tous les sites de phosphorylation identifis a ensuite t value. Nous avons dmontr que la phosphorylation de la Ser-503, un site consensus de la DDK, est essentielle la rprssion transcriptionelle des gnes au niveau des tlomres. Cependant, cette phosphorylation ne semble pas tre ncssaire pour dautres fonctions connues de CAF-1, indiquant que le blocage de la phsophorylation de Cac1 Ser-503 affecte spcifiquement la fonction de CAF-1 aux structures htrochromatiques des tlomres. Ensuite, nous avons identifis une intraction physique entre CAF-1 et Cdc7-Dbf4. Des tudes in vitro ont galement demontr que cette kinase phosphoryle spcifiquement Cac1 Ser-503, suggrant un rle potential pour la kinase Cdc7-Dbf4 dans lassemblage et la stabilit de la structure htrochromatique aux tlomres. Finalement, les analyses par SM nous ont galement permi de montrer que la sous-unit Hpc2 du complexe Hir est phosphoryle sur plusieurs sites consensus des CDKs et de Cdc7-Dbf4. De plus, la quantification par SM dun site spcifique de phosphorylation de Hpc2, la Ser-330, sest rvle tre fortement induite suite lactivation du point de contrle de rplication (le checkpoint) suite au dommage a lADN. Nous montrons que la Ser-330 de Hpc2 est phopshoryle par les kinases de point de contrle de manire Mec1/Tel1- et Rad53-dpendante. Nos donnes prliminaires suggrent ainsi que la capacit du complex Hir de rguler la rprssion transcriptionelle des gnes d'histones lors de la progression du cycle cellulaire normal et en rponse au dommage de l'ADN est mdie par la phosphorylation de Hpc2 par ces deux kinases. Enfin, ces deux tudes mettent en vidence l'importance de la spectromtrie de masse dans la caractrisation des sites de phosphorylation des protines, nous permettant ainsi de comprendre plus prcisement les mcanismes de rgulation de l'assemblage de la chromatine et de la synthse des histones.
Resumo:
Une nouvelle mthode d'extraction en phase solide (SPE) couple une technique d'analyse ultrarapide a t dveloppe pour la dtermination simultane de neuf contaminants mergents (l'atrazine, le dsthylatrazine, le 17(bta)-estradiol, l'thynylestradiol, la northindrone, la cafine, la carbamazpine, le diclofnac et le sulfamthoxazole) provenant de diffrentes classes thrapeutiques et prsents dans les eaux uses. La pr-concentration et la purification des chantillons a t ralise avec une cartouche SPE en mode mixte (Strata ABW) ayant la fois des proprits changeuses de cations et d'anions suivie d'une analyse par une dsorption thermique par diode laser/ionisation chimique pression atmosphrique couple la spectromtrie de masse en tandem (LDTD-APCI-MS/MS). La LDTD est une nouvelle mthode d'introduction d'chantillon qui rduit le temps total d'analyse moins de 15 secondes par rapport plusieurs minutes avec la chromatographie liquide couple la spectromtrie de masse en tandem traditionnelle (LC-MS/MS). Plusieurs paramtres SPE ont t valus dans le but d'optimiser l'efficacit de rcupration lors de l'extraction des analytes provenant des eaux uses, tels que la nature de la phase stationnaire, le dbit de chargement, le pH d'extraction, le volume et la composition de la solution de lavage et le volume de l'chantillon initial. Cette nouvelle mthode a t applique avec succs de vrais chantillons d'eaux uses provenant d'un rservoir de dcantation primaire. Le recouvrement des composs cibls provenant des eaux uses a t de 78 106%, la limite de dtection a t de 30 122 ng L-1, alors que la limite de quantification a t de 88 370 ng L-1. Les courbes d'talonnage dans les matrices d'eaux uses ont montr une bonne linarit (R2 > 0,991) pour les analytes cibles ainsi quune prcision avec un coefficient de variance infrieure 15%.
Resumo:
Les troubles relis la dpression, lpuisement professionnel et lanxit sont de plus en plus rpandus dans notre socit moderne. La consommation croissante dantidpresseurs dans les diffrents pays du monde est responsable de la rcente dtection de rsidus ltat de traces dans les rejets urbains municipaux. Ainsi, ces substances dites mergentes qui possdent une activit pharmacologique destine la rgulation de certains neurotransmetteurs dans le cerveau suscitent maintenant de nombreuses inquitudes de la part de la communaut scientifique. Lobjectif principal de ce projet de doctorat a t de mieux comprendre le devenir de plusieurs classes dantidpresseurs prsents dans diverses matrices environnementales (i.e. eaux de surfaces, eaux uses, boues de traitement, tissus biologiques) en dveloppant de nouvelles mthodes analytiques fiables capables de les dtecter, quantifier et confirmer par chromatographie liquide haute performance couple la spectromtrie de masse en tandem (LC-QqQMS, LC-QqToFMS). Une premire tude complte la station dpuration de la ville de Montral a permis de confirmer la prsence de six antidpresseurs et quatre mtabolites N-desmethyl dans les affluents (2 - 330 ng L-1). Pour ce traitement primaire (physico-chimique), de faibles taux denlvement ( 15%) ont t obtenus. Des concentrations dantidpresseurs atteignant prs de 100 ng L-1 ont galement t dtectes dans le fleuve St-Laurent 0.5 km du point de rejet de la station dpuration. Une seconde tude mene la mme station a permis lextraction slective dantidpresseurs dans trois tissus (i.e. foie, cerveau et filet) de truites mouchetes juvniles exposes diffrentes concentrations deffluent dilu trait et non-trait lozone. Un certain potentiel de bioaccumulation dans les tissus (0.08-10 ng g-1) a t observ pour les spcimens exposs leffluent non-trait (20% v/v) avec distribution majoritaire dans le foie et le cerveau. Une intressante corrlation a t tablie entre les concentrations de trois antidpresseurs dans le cerveau et lactivit dun biomarqueur dexposition (i.e. pompe N/K ATPase implique dans la rgulation de la srotonine) mesure partir de synaptosomes de truites exposes aux effluents. Une investigation de lefficacit de plusieurs stations dpuration canadiennes oprant diffrents types de traitements a permis de constater que les traitements secondaires (biologiques) taient plus performants que ceux primaires (physico-chimiques) pour enlever les antidpresseurs (taux moyen denlvement : 30%). Les teneurs les plus leves dans les boues traites (biosolides) ont t obtenues avec le citalopram (1033 ng g-1), la venlafaxine (833 ng g-1) et lamitriptyline (78 ng g-1). Des coefficients de sorption exprimentaux (Kd) calculs pour chacun des antidpresseurs ont permis destimer une grande sorption des composs sertraline, desmthylsertraline, paroxetine et fluoxetine sur les solides (log Kd > 4). Finalement, un excellent taux denlvement moyen de 88% a t obtenu aprs ozonation (5 mg L-1) dun effluent primaire. Toutefois, la caractrisation de nouveaux sous-produits N-oxyde (venlafaxine, desmethylvenlafaxine) par spectromtrie de masse haute rsolution (LC-QqToFMS) dans leffluent trait lozone a mis en lumire la possibilit de formation de multiples composs polaires de toxicit inconnue.
Resumo:
Lentrotoxine B staphylococcique (SEB) est une toxine entrique hautement rsistante la chaleur et est responsable de plus de 50 % des cas dintoxication dorigine alimentaire par une entrotoxine. Lobjectif principal de ce projet de matrise est de dvelopper et valider une mthode base sur des nouvelles stratgies analytiques permettant la dtection et la quantification de SEB dans les matrices alimentaires. Une carte de peptides tryptiques a t produite et 3 peptides tryptiques spcifiques ont t slectionns pour servir de peptides tmoins partir des 9 fragments protolytiques identifis (couverture de 35 % de la squence). Lanhydride actique et la forme deutre furent utiliss afin de synthtiser des peptides standards marques avec un isotope lger et lourd. La combinaison de mlanges des deux isotopes des concentrations molaires diffrentes fut utilise afin dtablir la linarit et les rsultats ont dmontr que les mesures faites par dilution isotopique combine au CL-SM/SM respectaient les critres gnralement reconnus dpreuves biologiques avec des valeurs de pente prs de 1, des valeurs de R2 suprieure 0,98 et des coefficients de variation (CV%) infrieurs 8 %. La prcision et lexactitude de la mthode ont t values laide dchantillons dhomognat de viande de poulet dans lesquels SEB a t introduite. SEB a t enrichie 0,2, 1 et 2 pmol/g. Les rsultats analytiques rvlent que la mthode procure une plage dexactitude de 84,9 91,1 %. Dans lensemble, les rsultats prsents dans ce mmoire dmontrent que les mthodes protomiques peuvent tre utilises efficacement pour dtecter et quantifier SEB dans les matrices alimentaires. Mots cls : spectromtrie de masse; marquage isotopique; protomique quantitative; entrotoxines
