Assessment of Tandem Mass Spectrometry and High Resolution Mass Spectrometry for the Analysis of Bupivacaine in Plasma

Triple quadrupole mass spectrometers coupled with high performance liquid chromatography are workhorses in quantitative bioanalyses. It provides substantial benefits including reproducibility, sensitivity and selectivity for trace analysis. Selected Reaction Monitoring allows targeted assay development but data sets generated contain very limited information. Data mining and analysis of non-targeted high-resolution mass spectrometry profiles of biological samples offer the opportunity to perform more exhaustive assessments, including quantitative and qualitative analysis. The objectives of this study was to test method precision and accuracy, statistically compare bupivacaine drug concentration in real study samples and verify if high resolution and accurate mass data collected in scan mode can actually permit retrospective data analysis, more specifically, extract metabolite related information. The precision and accuracy data presented using both instruments provided equivalent results. Overall, the accuracy was ranging from 106.2 to 113.2% and the precision observed was from 1.0 to 3.7%. Statistical comparisons using a linear regression between both methods reveal a coefficient of determination (R2) of 0.9996 and a slope of 1.02 demonstrating a very strong correlation between both methods. Individual sample comparison showed differences from -4.5% to 1.6% well within the accepted analytical error. Moreover, post acquisition extracted ion chromatograms at m/z 233.1648 ± 5 ppm (M-56) and m/z 305.2224 ± 5 ppm (M+16) revealed the presence of desbutyl-bupivacaine and three distinct hydroxylated bupivacaine metabolites. Post acquisition analysis allowed us to produce semiquantitative evaluations of the concentration-time profiles for bupicavaine metabolites.

In Vitro Ketamine CYP3A Mediated Metabolism Study using Mammalian Liver S9 Fractions, cDNA Expressed Enzymes and Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

Ketamine is widely used in medicine in combination with several benzodiazepines including midazolam. The objectives of this study were to develop a novel HPLC-MS/SRM method capable of quantifying ketamine and norketamine using an isotopic dilution strategy in biological matrices and study the formation of norketamine, the principal metabolite of ketamine with and without the presence of midazolam, a well-known CYP3A substrate. The chromatographic separation was achieved using a Thermo Betasil Phenyl 100 x 2 mm column combined with an isocratic mobile phase composed of acetonitrile, methanol, water and formic acid (60:20:20:0.4) at a flow rate of 300 μL/min. The mass spectrometer was operating in selected reaction monitoring mode and the analytical range was set at 0.05–50 μM. The precision (%CV) and accuracy (%NOM) observed were ranging from 3.9–7.8 and 95.9.2–111.1% respectively. The initial rate of formation of norketamine was determined using various ketamine concentration and Km values of 18.4 μM, 13.8 μM and 30.8 μM for rat, dog and human liver S9 fractions were observed respectively. The metabolic stability of ketamine on liver S9 fractions was significantly higher in human (T1/2 = 159.4 min) compared with rat (T1/2 = 12.6 min) and dog (T1/2 = 7.3 min) liver S9 fractions. Moreover significantly lower IC50 and Ki values observed in human compared with rat and dog liver S9 fractions. Experiments with cDNA expressed CYP3A enzymes showed the formation of norketamine is mediated by CYP3A but results suggest an important contribution from others isoenzymes, most likely CYP2C particularly in rat.

Analyse des agents de chimiothérapie par extraction sur phase solide automatisée couplée à la chromatographie liquide et la spectrométrie de masse en tandem (SPE-LC-ESI-MS/MS)

Les dernières décennies ont été marquées par une augmentation du nombre des cas de cancers, ce qui a subséquemment conduit à une augmentation dans la consommation des agents de chimiothérapie. La toxicité et le caractère cancérogène de ces molécules justifient l’intérêt crucial porté à leur égard. Quelques études ont fait l’objet de détection et de quantification des agents de chimiothérapie dans des matrices environnementales. Dans ce projet, une méthode utilisant la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) précédée d’une extraction sur phase solide (SPE) automatisée ou en ligne a été développée pour la détection et la quantification d’un groupe de six agents de chimiothérapie. Parmi ceux-ci figurent les plus utilisés au Québec (gemcitabine, méthotrexate, cyclophosphamide, ifosfamide, irinotécan, épirubicine) et présentant des propriétés physico-chimiques et des structures chimiques différentes. La méthode développée a été validée dans une matrice réelle représentant l’affluent d’une station d’épuration dans la région de Montréal. Deux des six composés cytotoxiques étudiés en l’occurrence (cyclophosphamide et méthotrexate) ont été détectés dans huit échantillons sur les neuf qui ont été recensés, essentiellement au niveau de l’affluent et l’effluent de quelques stations d’épuration de la région de Montréal. Les résultats des analyses effectuées sur les échantillons réels ont montré qu’il n’y avait pas de différence significative dans la concentration entre l’affluent et l’effluent, et donc que les systèmes d’épuration semblent inefficaces pour la dégradation de ces molécules.

Développement de méthodes analytiques pour la détection et la quantification de traces de produits pharmaceutiques dans les eaux du fleuve Saint Laurent

Le présent projet vise à documenter la nécessité d’augmenter notre connaissance de la présence des contaminants organiques tels que les médicaments dans l’environnement et d’évaluer leur devenir environnemental. On a étudié la présence de composés pharmaceutiques dans différents échantillons d'eau. On a focalisé nos efforts spécialement sur les échantillons d'eau de l'usine d'épuration de la Ville de Montréal et ses effluents, les eaux de surface avoisinantes et l’eau du robinet dans la région de Montréal. Pour ce faire, on a tout d’abord développé deux méthodes analytiques automatisées basées sur la chromatographie liquide avec extraction en phase solide (SPE) couplée à la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS). On a également étudié les performances des trois techniques d'ionisation à pression atmosphérique (API), pour ensuite les utiliser dans la méthode analytique développée. On a démontré que l'ionisation par électronébulisation (ESI) est une méthode d'ionisation plus efficace pour l'analyse des contaminants pharmaceutiques dans des échantillons de matrices très complexes comme les eaux usées. Une première méthode analytique SPE couplée à la LC-MS/MS a été développée et validée pour l'étude des échantillons complexes provenant de l'usine d'épuration de la Ville de Montréal et des eaux de surface près de l'usine. Cinq médicaments de prescription ont été étudiés: le bézafibrate (un régulateur de lipides), le cyclophosphamide et le méthotrexate (deux agents anticancéreux), l'orlistat (un agent anti-obésité) et l’énalapril (utilisé dans le traitement de l'hypertension). La plupart de ces drogues sont excrétées par le corps humain et rejetées dans les eaux usées domestiques en faisant par la suite leur chemin vers les usines municipales de traitement des eaux usées. On a pu démontrer qu'il y a un faible taux d’élimination à l'usine d'épuration pour le bézafibrate et l'énalapril. Ces deux composés ont aussi été détectés dans les eaux de surface sur un site à proximité immédiate de la décharge de l’effluent de la station d'épuration. i En observant la nécessité de l'amélioration des limites de détection de la première méthode analytique, une deuxième méthode a été développée. Pour la deuxième méthode, un total de 14 contaminants organiques, incluant trois agents anti-infectieux (clarithromycin, sulfaméthoxazole et triméthoprime), un anticonvulsant (carbamazépine) et son produit de dégradation (10,11-dihydrocarbamazépine), l'agent antihypertensif (enalapril), deux antinéoplastiques utilisés en chimiothérapie (cyclophosphamide et méthotrexate), des herbicides (atrazine, cyanazine, et simazine) et deux produits de transformation de l’atrazine (deséthylatrazine et déisopropylatrazine) ainsi qu’un agent antiseptique (triclocarban). Ces produits ont été quantifiés dans les eaux de surface ainsi que dans l’eau du robinet. L'amélioration des limites de détection pour cette méthode a été possible grâce à la charge d'un volume d'échantillon supérieur à celui utilisé dans la première méthode (10 mL vs 1 mL). D'autres techniques de confirmation, telles que les spectres des ions produits utilisant une pente d’énergie de collision inverse dans un spectromètre de masse à triple quadripôle et la mesure des masses exactes par spectrométrie de masse à temps d’envol, ont été explorées. L'utilisation d'un analyseur de masse à temps d’envol a permis la confirmation de 6 des 14 analytes. Finalement, étant donné leur haute toxicité et pour évaluer leur persistance et leur transformation au niveau du traitement des eaux potables, la cinétique d'oxydation du cyclophosphamide et de méthotrexate avec l'ozone moléculaire et des radicaux OH a été étudiée. Les constantes de dégradation avec l'ozone moléculaire ont été calculées et la qualité de l'eau après traitement a pu être évaluée. Le rendement du processus d'ozonation a été amélioré pour la cyclophosphamide dans les eaux naturelles, en raison de la combinaison de réactions directes et indirectes. Cette étude a montré que l'ozone est très efficace pour oxyder le méthotrexate mais que le cyclophosphamide serait trop lent à s’oxyder pour un traitement efficace aux conditions usuelles de traitement de l’eau potable.

Development of Imaging Mass Spectrometry Analysis of Lipids in Biological and Clinically Relevant Applications

La spectrométrie de masse mesure la masse des ions selon leur rapport masse sur charge. Cette technique est employée dans plusieurs domaines et peut analyser des mélanges complexes. L’imagerie par spectrométrie de masse (Imaging Mass Spectrometry en anglais, IMS), une branche de la spectrométrie de masse, permet l’analyse des ions sur une surface, tout en conservant l’organisation spatiale des ions détectés. Jusqu’à présent, les échantillons les plus étudiés en IMS sont des sections tissulaires végétales ou animales. Parmi les molécules couramment analysées par l’IMS, les lipides ont suscité beaucoup d'intérêt. Les lipides sont impliqués dans les maladies et le fonctionnement normal des cellules; ils forment la membrane cellulaire et ont plusieurs rôles, comme celui de réguler des événements cellulaires. Considérant l’implication des lipides dans la biologie et la capacité du MALDI IMS à les analyser, nous avons développé des stratégies analytiques pour la manipulation des échantillons et l’analyse de larges ensembles de données lipidiques. La dégradation des lipides est très importante dans l’industrie alimentaire. De la même façon, les lipides des sections tissulaires risquent de se dégrader. Leurs produits de dégradation peuvent donc introduire des artefacts dans l’analyse IMS ainsi que la perte d’espèces lipidiques pouvant nuire à la précision des mesures d’abondance. Puisque les lipides oxydés sont aussi des médiateurs importants dans le développement de plusieurs maladies, leur réelle préservation devient donc critique. Dans les études multi-institutionnelles où les échantillons sont souvent transportés d’un emplacement à l’autre, des protocoles adaptés et validés, et des mesures de dégradation sont nécessaires. Nos principaux résultats sont les suivants : un accroissement en fonction du temps des phospholipides oxydés et des lysophospholipides dans des conditions ambiantes, une diminution de la présence des lipides ayant des acides gras insaturés et un effet inhibitoire sur ses phénomènes de la conservation des sections au froid sous N2. A température et atmosphère ambiantes, les phospholipides sont oxydés sur une échelle de temps typique d’une préparation IMS normale (~30 minutes). Les phospholipides sont aussi décomposés en lysophospholipides sur une échelle de temps de plusieurs jours. La validation d’une méthode de manipulation d’échantillon est d’autant plus importante lorsqu’il s’agit d’analyser un plus grand nombre d’échantillons. L’athérosclérose est une maladie cardiovasculaire induite par l’accumulation de matériel cellulaire sur la paroi artérielle. Puisque l’athérosclérose est un phénomène en trois dimension (3D), l'IMS 3D en série devient donc utile, d'une part, car elle a la capacité à localiser les molécules sur la longueur totale d’une plaque athéromateuse et, d'autre part, car elle peut identifier des mécanismes moléculaires du développement ou de la rupture des plaques. l'IMS 3D en série fait face à certains défis spécifiques, dont beaucoup se rapportent simplement à la reconstruction en 3D et à l’interprétation de la reconstruction moléculaire en temps réel. En tenant compte de ces objectifs et en utilisant l’IMS des lipides pour l’étude des plaques d’athérosclérose d’une carotide humaine et d’un modèle murin d’athérosclérose, nous avons élaboré des méthodes «open-source» pour la reconstruction des données de l’IMS en 3D. Notre méthodologie fournit un moyen d’obtenir des visualisations de haute qualité et démontre une stratégie pour l’interprétation rapide des données de l’IMS 3D par la segmentation multivariée. L’analyse d’aortes d’un modèle murin a été le point de départ pour le développement des méthodes car ce sont des échantillons mieux contrôlés. En corrélant les données acquises en mode d’ionisation positive et négative, l’IMS en 3D a permis de démontrer une accumulation des phospholipides dans les sinus aortiques. De plus, l’IMS par AgLDI a mis en évidence une localisation différentielle des acides gras libres, du cholestérol, des esters du cholestérol et des triglycérides. La segmentation multivariée des signaux lipidiques suite à l’analyse par IMS d’une carotide humaine démontre une histologie moléculaire corrélée avec le degré de sténose de l’artère. Ces recherches aident à mieux comprendre la complexité biologique de l’athérosclérose et peuvent possiblement prédire le développement de certains cas cliniques. La métastase au foie du cancer colorectal (Colorectal cancer liver metastasis en anglais, CRCLM) est la maladie métastatique du cancer colorectal primaire, un des cancers le plus fréquent au monde. L’évaluation et le pronostic des tumeurs CRCLM sont effectués avec l’histopathologie avec une marge d’erreur. Nous avons utilisé l’IMS des lipides pour identifier les compartiments histologiques du CRCLM et extraire leurs signatures lipidiques. En exploitant ces signatures moléculaires, nous avons pu déterminer un score histopathologique quantitatif et objectif et qui corrèle avec le pronostic. De plus, par la dissection des signatures lipidiques, nous avons identifié des espèces lipidiques individuelles qui sont discriminants des différentes histologies du CRCLM et qui peuvent potentiellement être utilisées comme des biomarqueurs pour la détermination de la réponse à la thérapie. Plus spécifiquement, nous avons trouvé une série de plasmalogènes et sphingolipides qui permettent de distinguer deux différents types de nécrose (infarct-like necrosis et usual necrosis en anglais, ILN et UN, respectivement). L’ILN est associé avec la réponse aux traitements chimiothérapiques, alors que l’UN est associé au fonctionnement normal de la tumeur.

Développement de méthodes d’analyse directe de polluants organiques volatils à l’état de traces dans l’air et les biogaz

Il est reconnu que le benzène, le toluène, l’éthylbenzène et les isomères du xylène, composés organiques volatils (COVs) communément désignés BTEX, produisent des effets nocifs sur la santé humaine et sur les végétaux dépendamment de la durée et des niveaux d’exposition. Le benzène en particulier est classé cancérogène et une exposition à des concentrations supérieures à 64 g/m3 de benzène peut être fatale en 5–10 minutes. Par conséquent, la mesure en temps réel des BTEX dans l’air ambiant est essentielle pour détecter rapidement un danger associé à leur émission dans l’air et pour estimer les risques potentiels pour les êtres vivants et pour l’environnement. Dans cette thèse, une méthode d’analyse en temps réel des BTEX dans l’air ambiant a été développée et validée. La méthode est basée sur la technique d’échantillonnage direct de l’air couplée avec la spectrométrie de masse en tandem utilisant une source d’ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI-MS/MS directe). La validation analytique a démontré la sensibilité (limite de détection LDM 1–2 μg/m3), la précision (coefficient de variation CV < 10%), l’exactitude (exactitude > 95%) et la sélectivité de la méthode. Des échantillons d’air ambiant provenant d’un site d’enfouissement de déchets industriels et de divers garages d’entretien automobile ont été analysés par la méthode développée. La comparaison des résultats avec ceux obtenus par la technique de chromatographie gazeuse on-line couplée avec un détecteur à ionisation de flamme (GC-FID) a donné des résultats similaires. La capacité de la méthode pour l’évaluation rapide des risques potentiels associés à une exposition aux BTEX a été prouvée à travers une étude de terrain avec analyse de risque pour la santé des travailleurs dans trois garages d’entretien automobile et par des expériences sous atmosphères simulées. Les concentrations mesurées dans l’air ambiant des garages étaient de 8,9–25 µg/m3 pour le benzène, 119–1156 µg/m3 pour le toluène, 9–70 µg/m3 pour l’éthylbenzène et 45–347 µg/m3 pour les xylènes. Une dose quotidienne environnementale totale entre 1,46 10-3 et 2,52 10-3 mg/kg/jour a été déterminée pour le benzène. Le risque de cancer lié à l’exposition environnementale totale au benzène estimé pour les travailleurs étudiés se situait entre 1,1 10-5 et 1,8 10-5. Une nouvelle méthode APCI-MS/MS a été également développée et validée pour l’analyse directe de l’octaméthylcyclotétrasiloxane (D4) et le décaméthylcyclopentasiloxane (D5) dans l’air et les biogaz. Le D4 et le D5 sont des siloxanes cycliques volatils largement utilisés comme solvants dans les processus industriels et les produits de consommation à la place des COVs précurseurs d’ozone troposphérique tels que les BTEX. Leur présence ubiquitaire dans les échantillons d’air ambiant, due à l’utilisation massive, suscite un besoin d’études de toxicité. De telles études requièrent des analyses qualitatives et quantitatives de traces de ces composés. Par ailleurs, la présence de traces de ces substances dans un biogaz entrave son utilisation comme source d’énergie renouvelable en causant des dommages coûteux à l’équipement. L’analyse des siloxanes dans un biogaz s’avère donc essentielle pour déterminer si le biogaz nécessite une purification avant son utilisation pour la production d’énergie. La méthode développée dans cette étude possède une bonne sensibilité (LDM 4–6 μg/m3), une bonne précision (CV < 10%), une bonne exactitude (> 93%) et une grande sélectivité. Il a été également démontré qu’en utilisant cette méthode avec l’hexaméthyl-d18-disiloxane comme étalon interne, la détection et la quantification du D4 et du D5 dans des échantillons réels de biogaz peuvent être accomplies avec une meilleure sensibilité (LDM ~ 2 μg/m3), une grande précision (CV < 5%) et une grande exactitude (> 97%). Une variété d’échantillons de biogaz prélevés au site d’enfouissement sanitaire du Complexe Environnemental de Saint-Michel à Montréal a été analysée avec succès par cette nouvelle méthode. Les concentrations mesurées étaient de 131–1275 µg/m3 pour le D4 et 250–6226 µg/m3 pour le D5. Ces résultats représentent les premières données rapportées dans la littérature sur la concentration des siloxanes D4 et D5 dans les biogaz d’enfouissement en fonction de l’âge des déchets.

Développement d’outils analytiques pour évaluer la biodisponibilité du Cd dans les eaux douces

Les phytochélatines (PC) sont des polypeptides ayant la structure générale, (alpha-Glu-Cys)n-Gly, où n = 2 à 11. Leur synthèse est induite par un grand nombre de végétaux en réponse à une élévation de la concentration du milieu en métaux, en particulier le cadmium (ci-après, Cd). Le but de cette étude a été de développer un outil pour évaluer la biodisponibilité du Cd dans les eaux douces. Pour ce faire, une méthode analytique a été réalisée afin de déterminer les phytochélatines induites dans les algues C. reinhardtii. Celle-ci consiste à utiliser la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LCHP-SM/SM) "on-line". L’ionisation des molécules est celle faite par électronébulisation (IEN) (traduction de electrospray ionisation). L’objectif principal de ce mémoire est la validation de cette méthode : la détermination des courbes de calibration et des limites de détection et l'identification d'interférences potentielles. L’utilisation de dithiothreitol (DTT) à une concentration de 25 mM a été nécessaire à la conservation de la forme réduite des phytochélatines. En effet, suite à la validation de la méthode d’analyse des phytochélatines il a été démontré qu’elle représente un potentiel d’application. Ceci dans la mesure où l’induction des phytochélatines (PC2, PC3 et PC4) dans les algues C. reinhardtii a été possible à deux concentrations de Cd (1 x 10-7 M et 1 x 10 6 M) et ce, après plusieurs temps d'induction (1, 2, 4, et 6 h). Ainsi, l’étude de la stabilité des phytochélatines a été réalisée et toutes les températures examinées ont démontré une diminution des phytochélatines analysées par HPLC-ESI-MS/MS. Il se pourrait que la cause de la dégradation des phytochélatines soit physique ou chimique plutôt que bactérienne. Toutefois, un approfondissement au niveau de la purification de la solution d’extraction serait nécessaire à la mise au point de la dite méthode analytique afin de quantifier les phytochélatines dans l’algue C. reinhardtii.

Analyse quantitative des cyanotoxines d'eau douce par LDTD-APCI-MS/MS

Avec la hausse mondiale de la fréquence des floraisons de cyanobactéries (CB), dont certaines produisent des cyanotoxines (CT), le développement d’une méthode de détection/quantification rapide d’un maximum de CT s’impose. Cette méthode permettrait de faire un suivi quotidien de la toxicité de plans d’eau contaminés par des CB et ainsi d’émettre rapidement des avis d’alerte appropriés afin de protéger la santé publique. Une nouvelle technologie utilisant la désorption thermique induite par diode laser (LDTD) couplée à l’ionisation chimique sous pression atmosphérique (APCI) et reliée à la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) a déjà fait ses preuves avec des temps d'analyse de l’ordre de quelques secondes. Les analytes sont désorbés par la LDTD, ionisés en phase gazeuse par APCI et détectés par la MS/MS. Il n’y a donc pas de séparation chromatographique, et la préparation de l’échantillon avant l’analyse est minimale selon la complexité de la matrice contenant les analytes. Parmi les quatre CT testées (microcystine-LR, cylindrospermopsine, saxitoxine et anatoxine-a (ANA-a)), seule l’ANA-a a généré une désorption significative nécessaire au développement d’une méthode analytique avec l’interface LDTD-APCI. La forte polarité ou le poids moléculaire élevé des autres CT empêche probablement leur désorption. L’optimisation des paramètres instrumentaux, tout en tenant compte de l’interférence isobarique de l’acide aminé phénylalanine (PHE) lors de la détection de l’ANA-a par MS/MS, a généré une limite de détection d’ANA-a de l’ordre de 1 ug/L. Celle-ci a été évaluée à partir d’une matrice apparentée à une matrice réelle, démontrant qu’il serait possible d’utiliser la LDTD pour effectuer le suivi de l’ANA-a dans les eaux naturelles selon les normes environnementales applicables (1 à 12 ug/L). Il a été possible d’éviter l’interférence isobarique de la PHE en raison de sa très faible désorption avec l’interface LDTD-APCI. En effet, il a été démontré qu’une concentration aussi élevée que 500 ug/L de PHE ne causait aucune interférence sur le signal de l’ANA-a.

Analytical strategies for the comprehensive profiling of histone post translational modifications by mass spectrometry and implications for functional analyses

Le long bio-polymère d'ADN est condensé à l’intérieur du noyau des cellules eukaryotes à l'aide de petites protéines appelées histones. En plus de leurs fonctions condensatrices,ces histones sont également la cible de nombreuses modifications post-traductionnelles(MPT), particulièrement au niveau de leur section N-terminale. Ces modifications réversibles font partie d’un code d’histones épi-génétique transmissible qui orchestre et module dynamiquement certains événements impliquant la chromatine, tels l’activation et la désactivation de gènes ainsi que la duplication et la réparation d’ADN. Ces modifications sont impliquées subséquemment dans la signalisation et la progression de cancers, tels que la leucémie. En conséquence, l'élucidation des modifications d’histones est importante pour comprendre leurs fonctions biologiques. Une méthodologie analytique a été mise au point en laboratoire pour isoler, détecter, et quantifier les MPT d’histones en utilisant une approche rapide à deux volets à l’aide d’outils bioinformatiques spécialisés. La méthodologie développée en laboratoire a été validée en utilisant des histones de souche sauvage ainsi que deux types d’histones mutants déficients en enzymes acétyltransferase. Des trois sources d’histones utilisées, la seule MPT qui a démontré un changement significatif est l’acétylation de l’histone H3 à lysine 56 (H3K56ac). L’expression et la stoechiométrie de cette MPT, issue de cellules de souche sauvage et de cellules mutantes, ont été déterminées avec précision et comparées. Les fonctions de balayage polyvalentes d'un instrument à trappe ionique quadrupôle linéaire hybride ont été utilisées pour améliorer la détection de protéines intactes. Le mode de balayage « enhanced multiply charged » (EMC) a été modifié pour contenir et détecter les ions de protéines intactes situées dans la trappe ionique linéaire. Ce mode de balayage nommé « targeted EMC » (tEMC) a permis de quadrupler le niveau de sensibilité (signal/interférence), et quintupler la résolution du mode de balayage conventionnel. De plus, la capacité de séparation des charges du tEMC a réduit de façon significative les effets de « space charge » dans la trappe ionique linéaire. La résolution supérieure du mode tEMC a permis de différencier plusieurs isoformes modifiées, particulièrement pour l’histone H3. L’analyse des peptides d’histones trypsiques à l’aide du mode de balayage « MRM » a permis le séquençage et la quantification de MPT avec un haut degré de précision. La seule MPT qui était sous-exprimée entre l’histone de souche sauvage et le mutant DOT1L fut la méthylation de l’histone H3 lysine 79(H3K79me1). Les effets de deux inhibiteurs d’enzymes HDAC (HDACi) sur l’expression de MPT d’histone ont été évalués en utilisant la méthodologie analytique mentionnée. Les histones extraites de cellules normales et cancéreuses ont été exposées à du Vorinostat(SAHA) ou du Entinostat (MS-275) pour une période de 24 à 72 heures. Deux histones furent principalement affectées, soit H3 et H4. Étonnamment, les mêmes effets n'ont pas été détectés lorsque les cellules normales ont été traitées avec le HDACi pour une période de 48 à 72 heures. Une méthode absolue de quantification avec une courbe d’étalonnage a été développée pour le peptide H3K56ac. Contrairement à certaines publications, nos résultats démontrent que cette MPT est présente dans les cellules mammifères avec une stoechiométrie très basse (< 0,1%) et n'est pas surexprimée de façon significative après le traitement au HDACi.

Large scale identification of protein SUMOylation by mass spectrometry in HEK293 cells

Les fichiers qui accompagnent mon document sont des tableaux supplémentaires réalisés avec Excel (Microsoft Office), dans la version papier du mémoire ces fichiers sont sur un CD-ROM.

Mass spectrometry as a tool to dissect the role of chromatin assembly factors in regulating nucleosome assembly

L'assemblage des nucléosomes est étroitement couplée à la synthèse des histones ainsi qu’à la réplication et la réparation de l’ADN durant la phase S. Ce processus implique un mécanisme de contrôle qui contribue soigneusement et de manière régulée à l’assemblage de l’ADN en chromatine. L'assemblage des nucléosomes durant la synthèse de l’ADN est crucial et contribue ainsi au maintien de la stabilité génomique. Cette thèse décrit la caractérisation par spectrométrie de masse(SM) des protéines jouant un rôle critique dans l’assemblage et le maintien de la structure chromatinienne. Plus précisément, la phosphorylation de deux facteurs d’assemblage des nucléosome, le facteur CAF-1, une chaperone d’histone qui participe à l'assemblage de la chromatine spécifiquement couplée à la réplication de l'ADN, ainsi que le complexe protéique Hir, jouant de plus un rôle important dans la régulation transcriptionelle des gènes d’histones lors de la progression normale du cycle cellulaire et en réponse aux dommages de l'ADN, a été examiné. La caractérisation des sites de phosphorylation par SM nécéssite la séparation des protéines par éléctrophorèse suivi d’une coloration a l’argent. Dans le chapitre 2, nous demontrons que la coloration à l’argent induit un artéfact de sulfatation. Plus précisément, cet artéfact est causé par un réactif spécifiquement utilisé lors de la coloration. La sulfatation présente de fortes similitudes avec la phosphorylation. Ainsi, l’incrément de masse observé sur les peptides sulfatés et phosphorylés (+80 Da) nécéssite des instruments offrant une haute résolution et haute précision de masse pour différencier ces deux modifications. Dans les chapitres 3 et 4, nous avons d’abord démontré par SM que Cac1, la plus grande sous-unité du facteur CAF-1, est cible de plusieurs sites de phosphorylation. Fait intéréssant, certains de ces sites contiennent des séquences consensus pour les kinases Cdc7-Dbf4 et CDKs. Ainsi, ces résultats fournissent les premières évidences que CAF-1 est potentiellement régulé par ces deux kinases in vivo. La fonction de tous les sites de phosphorylation identifiés a ensuite été évaluée. Nous avons démontré que la phosphorylation de la Ser-503, un site consensus de la DDK, est essentielle à la répréssion transcriptionelle des gènes au niveau des télomères. Cependant, cette phosphorylation ne semble pas être nécéssaire pour d’autres fonctions connues de CAF-1, indiquant que le blocage de la phsophorylation de Cac1 Ser-503 affecte spécifiquement la fonction de CAF-1 aux structures hétérochromatiques des télomères. Ensuite, nous avons identifiés une intéraction physique entre CAF-1 et Cdc7-Dbf4. Des études in vitro ont également demontré que cette kinase phosphoryle spécifiquement Cac1 Ser-503, suggérant un rôle potential pour la kinase Cdc7-Dbf4 dans l’assemblage et la stabilité de la structure hétérochromatique aux télomères. Finalement, les analyses par SM nous ont également permi de montrer que la sous-unité Hpc2 du complexe Hir est phosphorylée sur plusieurs sites consensus des CDKs et de Cdc7-Dbf4. De plus, la quantification par SM d’un site spécifique de phosphorylation de Hpc2, la Ser-330, s’est révélée être fortement induite suite à l’activation du point de contrôle de réplication (le “checkpoint”) suite au dommage a l’ADN. Nous montrons que la Ser-330 de Hpc2 est phopshorylée par les kinases de point de contrôle de manière Mec1/Tel1- et Rad53-dépendante. Nos données préliminaires suggèrent ainsi que la capacité du complex Hir de réguler la répréssion transcriptionelle des gènes d'histones lors de la progression du cycle cellulaire normal et en réponse au dommage de l'ADN est médiée par la phosphorylation de Hpc2 par ces deux kinases. Enfin, ces deux études mettent en évidence l'importance de la spectrométrie de masse dans la caractérisation des sites de phosphorylation des protéines, nous permettant ainsi de comprendre plus précisement les mécanismes de régulation de l'assemblage de la chromatine et de la synthèse des histones.

Développement d’une nouvelle méthode d’analyse multi-résidus par LDTD/APCI-MS/MS pour la quantification de pesticides et de produits pharmaceutiques dans les eaux usées

Une nouvelle méthode d'extraction en phase solide (SPE) couplée à une technique d'analyse ultrarapide a été développée pour la détermination simultanée de neuf contaminants émergents (l'atrazine, le déséthylatrazine, le 17(béta)-estradiol, l'éthynylestradiol, la noréthindrone, la caféine, la carbamazépine, le diclofénac et le sulfaméthoxazole) provenant de différentes classes thérapeutiques et présents dans les eaux usées. La pré-concentration et la purification des échantillons a été réalisée avec une cartouche SPE en mode mixte (Strata ABW) ayant à la fois des propriétés échangeuses de cations et d'anions suivie d'une analyse par une désorption thermique par diode laser/ionisation chimique à pression atmosphérique couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LDTD-APCI-MS/MS). La LDTD est une nouvelle méthode d'introduction d'échantillon qui réduit le temps total d'analyse à moins de 15 secondes par rapport à plusieurs minutes avec la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem traditionnelle (LC-MS/MS). Plusieurs paramètres SPE ont été évalués dans le but d'optimiser l'efficacité de récupération lors de l'extraction des analytes provenant des eaux usées, tels que la nature de la phase stationnaire, le débit de chargement, le pH d'extraction, le volume et la composition de la solution de lavage et le volume de l'échantillon initial. Cette nouvelle méthode a été appliquée avec succès à de vrais échantillons d'eaux usées provenant d'un réservoir de décantation primaire. Le recouvrement des composés ciblés provenant des eaux usées a été de 78 à 106%, la limite de détection a été de 30 à 122 ng L-1, alors que la limite de quantification a été de 88 à 370 ng L-1. Les courbes d'étalonnage dans les matrices d'eaux usées ont montré une bonne linéarité (R2 > 0,991) pour les analytes cibles ainsi qu’une précision avec un coefficient de variance inférieure à 15%.

Devenir environnemental des antidépresseurs dans les rejets urbains par chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem

Les troubles reliés à la dépression, l’épuisement professionnel et l’anxiété sont de plus en plus répandus dans notre société moderne. La consommation croissante d’antidépresseurs dans les différents pays du monde est responsable de la récente détection de résidus à l’état de traces dans les rejets urbains municipaux. Ainsi, ces substances dites « émergentes » qui possèdent une activité pharmacologique destinée à la régulation de certains neurotransmetteurs dans le cerveau suscitent maintenant de nombreuses inquiétudes de la part de la communauté scientifique. L’objectif principal de ce projet de doctorat a été de mieux comprendre le devenir de plusieurs classes d’antidépresseurs présents dans diverses matrices environnementales (i.e. eaux de surfaces, eaux usées, boues de traitement, tissus biologiques) en développant de nouvelles méthodes analytiques fiables capables de les détecter, quantifier et confirmer par chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-QqQMS, LC-QqToFMS). Une première étude complétée à la station d’épuration de la ville de Montréal a permis de confirmer la présence de six antidépresseurs et quatre métabolites N-desmethyl dans les affluents (2 - 330 ng L-1). Pour ce traitement primaire (physico-chimique), de faibles taux d’enlèvement (≤ 15%) ont été obtenus. Des concentrations d’antidépresseurs atteignant près de 100 ng L-1 ont également été détectées dans le fleuve St-Laurent à 0.5 km du point de rejet de la station d’épuration. Une seconde étude menée à la même station a permis l’extraction sélective d’antidépresseurs dans trois tissus (i.e. foie, cerveau et filet) de truites mouchetées juvéniles exposées à différentes concentrations d’effluent dilué traité et non-traité à l’ozone. Un certain potentiel de bioaccumulation dans les tissus (0.08-10 ng g-1) a été observé pour les spécimens exposés à l’effluent non-traité (20% v/v) avec distribution majoritaire dans le foie et le cerveau. Une intéressante corrélation a été établie entre les concentrations de trois antidépresseurs dans le cerveau et l’activité d’un biomarqueur d’exposition (i.e. pompe N/K ATPase impliquée dans la régulation de la sérotonine) mesurée à partir de synaptosomes de truites exposées aux effluents. Une investigation de l’efficacité de plusieurs stations d’épuration canadiennes opérant différents types de traitements a permis de constater que les traitements secondaires (biologiques) étaient plus performants que ceux primaires (physico-chimiques) pour enlever les antidépresseurs (taux moyen d’enlèvement : 30%). Les teneurs les plus élevées dans les boues traitées (biosolides) ont été obtenues avec le citalopram (1033 ng g-1), la venlafaxine (833 ng g-1) et l’amitriptyline (78 ng g-1). Des coefficients de sorption expérimentaux (Kd) calculés pour chacun des antidépresseurs ont permis d’estimer une grande sorption des composés sertraline, desméthylsertraline, paroxetine et fluoxetine sur les solides (log Kd > 4). Finalement, un excellent taux d’enlèvement moyen de 88% a été obtenu après ozonation (5 mg L-1) d’un effluent primaire. Toutefois, la caractérisation de nouveaux sous-produits N-oxyde (venlafaxine, desmethylvenlafaxine) par spectrométrie de masse à haute résolution (LC-QqToFMS) dans l’effluent traité à l’ozone a mis en lumière la possibilité de formation de multiples composés polaires de toxicité inconnue.

Detection and quantification of staphylococcus aureus enterotoxin B in food product using isotopic dilution techniques and mass spectrometry

L’entérotoxine B staphylococcique (SEB) est une toxine entérique hautement résistante à la chaleur et est responsable de plus de 50 % des cas d’intoxication d’origine alimentaire par une entérotoxine. L’objectif principal de ce projet de maîtrise est de développer et valider une méthode basée sur des nouvelles stratégies analytiques permettant la détection et la quantification de SEB dans les matrices alimentaires. Une carte de peptides tryptiques a été produite et 3 peptides tryptiques spécifiques ont été sélectionnés pour servir de peptides témoins à partir des 9 fragments protéolytiques identifiés (couverture de 35 % de la séquence). L’anhydride acétique et la forme deutérée furent utilisés afin de synthétiser des peptides standards marqués avec un isotope léger et lourd. La combinaison de mélanges des deux isotopes à des concentrations molaires différentes fut utilisée afin d’établir la linéarité et les résultats ont démontré que les mesures faites par dilution isotopique combinée au CL-SM/SM respectaient les critères généralement reconnus d’épreuves biologiques avec des valeurs de pente près de 1, des valeurs de R2 supérieure à 0,98 et des coefficients de variation (CV%) inférieurs à 8 %. La précision et l’exactitude de la méthode ont été évaluées à l’aide d’échantillons d’homogénat de viande de poulet dans lesquels SEB a été introduite. SEB a été enrichie à 0,2, 1 et 2 pmol/g. Les résultats analytiques révèlent que la méthode procure une plage d’exactitude de 84,9 à 91,1 %. Dans l’ensemble, les résultats présentés dans ce mémoire démontrent que les méthodes protéomiques peuvent être utilisées efficacement pour détecter et quantifier SEB dans les matrices alimentaires. Mots clés : spectrométrie de masse; marquage isotopique; protéomique quantitative; entérotoxines

Analyse par spectrométrie de masse d’hormones stéroïdiennes dans les eaux usées et abattement par oxydation chimique

Thèse réalisée en cotutelle avec Michèle Prévost (Ph.D), Professeure titulaire au département des génies civil, géologique et des mines de l'École Polytechnique de Montréal.