Structure-fonction de MARCH1, une E3 ubiquitine ligase régulant la présentation antigénique par le CMH II

Les molécules classiques du CMH de classe II sont responsables de la présentation de peptides exogènes par les cellules présentatrices d’antigène aux lymphocytes T CD4+. Cette présentation antigénique est essentielle à l’établissement d’une réponse immunitaire adaptative. Cependant, la reconnaissance d’auto-antigènes ainsi que l’élimination des cellules du Soi sont des problèmes à l’origine de nombreuses maladies auto-immunes. Notamment, le diabète et la sclérose en plaque. D’éventuels traitements de ces maladies pourraient impliquer la manipulation de la présentation antigénique chez les cellules dont la reconnaissance et l’élimination engendrent ces maladies. Il est donc primordial d’approfondir nos connaissances en ce qui concerne les mécanismes de régulation de la présentation antigénique. La présentation antigénique est régulée tant au niveau transcriptionnel que post-traductionnel. Au niveau post-traductionnel, diverses cytokines affectent le processus. Parmi celles-ci, l’IL-10, une cytokine anti-inflammatoire, cause une rétention intracellulaire des molécules du CMH II. Son mécanisme d’action consiste en l’ubiquitination de la queue cytoplasmique de la chaîne bêta des molécules de CMH II. Cette modification protéique est effectuée par MARCH1, une E3 ubiquitine ligase dont l’expression est restreinte aux organes lymphoïdes secondaires. Jusqu’à tout récemment, il y avait très peu de connaissance concernant la structure et les cibles de MARCH1. Considérant son impact majeur sur la présentation antigénique, nous nous sommes intéressé à la structure-fonction de cette molécule afin de mieux caractériser sa régulation ainsi que les diverses conditions nécessaires à son fonctionnement. Dans un premier article, nous avons étudié la régulation de l’expression de MARCH1 au niveau protéique. Nos résultats ont révélé l’autorégulation de la molécule par formation de dimères et son autoubiquitination. Nous avons également démontré l’importance des domaines transmembranaires de MARCH1 dans la formation de dimères et l’interaction avec le CMH II. Dans un second article, nous avons investigué l’importance de la localisation de MARCH1 pour sa fonction. Les résultats obtenus montrent la fonctionnalité des motifs de localisation de la portion C-terminale de MARCH1 ainsi que la présence d’autres éléments de localisation dans la portion N-terminale de la protéine. Les nombreux mutants utilisés pour ce projet nous ont permis d’identifier un motif ‘‘VQNC’’, situé dans la portion cytoplasmique C-terminale de MARCH1, dont la valine est requise au fonctionnement optimal de la molécule. En effet, la mutation de la valine engendre une diminution de la fonction de la molécule et des expériences de BRET ont démontré une modification de l’orientation spatiale des queues cytoplasmiques. De plus, une recherche d’homologie de séquence a révélé la présence de ce même motif dans d’autres ubiquitines ligases, dont Parkin. Parkin est fortement exprimée dans le cerveau et agirait, entre autre, sur la dégradation des agrégats protéiques. La dysfonction de Parkin cause l’accumulation de ces agrégats, nommés corps de Lewy, qui entraînent des déficiences au niveau du fonctionnement neural observé chez les patients atteints de la maladie de Parkinson. La valine comprise dans le motif ‘’VQNC’’ a d’ailleurs été identifiée comme étant mutée au sein d’une famille où cette maladie est génétiquement transmise. Nous croyons que l’importance de ce motif ne se restreint pas à MARCH1, mais serait généralisée à d’autres E3 ligases. Ce projet de recherche a permis de caractériser des mécanismes de régulation de MARCH1 ainsi que de découvrir divers éléments structuraux requis à sa fonction. Nos travaux ont permis de mieux comprendre les mécanismes de contrôle de la présentation antigénique par les molécules de CMH II.

La modulation du métabolisme cellulaire par l'E3 Ubiquitine Ligase MARCH-1

La relocalisation et la dégradation médiée par ubiquitination sont utilisées par la cellule pour contrôler la localisation et l’expression de ses protéines. L’E3 ubiquitine ligase MARCH1 est impliqué dans la régulation post-traductionnelle de CMH-II et de CD86. Dans ce mémoire, on propose un rôle additionnel à MARCH1. Nos résultats expérimentaux nous portent à croire que MARCH1 pourrait moduler le métabolisme cellulaire en favorisant la relocalisation et la dégradation d’enzymes impliquées dans la glycolyse. La grande majorité des cellules utilise la phosphorylation oxydative pour générer de l’ATP en présence d’oxygène. Dans un environnement hypoxique, cette dernière est non fonctionnelle et la cellule doit utiliser la glycolyse anaérobique pour produire son ATP. Une cellule cancéreuse à des besoins énergétiques supérieurs en raison de l’augmentation de sa biomasse et de sa prolifération incontrôlée. Pour subvenir à ces besoins, elle maximise sa production d’énergie en modifiant son métabolisme; c’est l’effet Warburg. On retrouve dans les cellules immunitaires des modifications similaires au métabolisme cellulaire suite à un signal d’activation. Ici, nous montrons que la respiration mitochondriale maximale, la réserve respiratoire et la glycolyse maximale sont diminuées dans les cellules présentatrice d’antigènes qui expriment MARCH1. Nous avons montré que MARCH1 était localisable au niveau de la mitochondrie, ce qui lui permet d’interagir avec les enzymes de la glycolyse. Finalement, nous avons quantifié l’expression de Eno1 et de LDHB par Western Blot, pour montrer une augmentation de l’expression de ces enzymes en absence de MARCH1. À la lumière de ces résultats, nous discutons des avantages que procure la diminution de l’expression de MARCH1 dans un contexte inflammatoire, suite à l’activation des cellules présentatrices d’antigènes. Ce phénomène permettrait une présentation antigénique plus efficace, une augmentation de la production d’énergie et une meilleure résistance aux ROS produits lors de la réponse inflammatoire.

Phosphorylation et régulation de l’E3 ubiquitine ligase MDM2 par la protéine kinase RSK dans les mélanomes

La voie de signalisation Ras/MAPK (Ras/mitogen-activated protein kinase) régule une variété de protéines intracellulaires qui jouent un rôle important dans la croissance et la prolifération cellulaire. La régulation inappropriée de cette voie de signalisation conduit au développement de nombreux cancers comme le mélanome, qui est caractérisé par des mutations activatrices au niveau des gènes NRAS et BRAF. La protéine kinase RSK (p90 ribosomal S6 kinase) est un composant central de la voie Ras/MAPK, mais son rôle dans la croissance et la prolifération cellulaire n’est pas bien compris. RSK a été montrée pour participer à la résistance des mélanomes aux chimiothérapies, mais le mécanisme moléculaire reste encore à élucider. Nous montrons à l’aide d’un anticorps phospho-spécifique que MDM2 est phosphorylée en réponse à des agonistes et des mutations oncogéniques activant spécifiquement la voie Ras/MAPK. En utilisant des méthodes in vitro et in vivo, nous avons constaté que RSK phosphoryle directement MDM2 sur les Sérines 166 et 186, ce qui suggère que MDM2 est un substrat de RSK. La mutagénèse dirigée envers ces sites nous indique que ces résidus régulent l’ubiquitination de MDM2, suggérant que RSK régule la stabilité de MDM2 et de p53. De plus, nous avons observé que l’inhibition de RSK conduit à une augmentation du niveau protéique de p53 après un dommage à l’ADN dans les cellules de mélanomes. En conclusion, nos travaux suggèrent un rôle important de la protéine kinase RSK dans la régulation de MDM2 et de sa cible, p53. L’étude de ces mécanismes moléculaires aidera à mieux définir le rôle de RSK dans la croissance tumorale, mais également dans la résistance aux agents chimiothérapeutiques.

Interactions protéiques et relation dynamique entre phosphorylation / sumoylation / ubiquitination des protéines TIF1α, β et PML: détection in vivo par BRET

Trois protéines de la famille TRIM (Motif TRIpartite), TIF1α, β (Transcriptional Intermediary Factor 1) et PML (ProMyelocytic Leukaemia¬), font l’objet de cette étude. TIF1α est connu comme un coactivateur des récepteurs nucléaires et TIF1β comme le corépresseur universel des protéines KRAB-multidoigt de zinc dont le prototype étudié ici est ZNF74. PML possède divers rôles dont le plus caractérisé est celui d’être l’organisateur principal et essentiel des PML-NBs (PML-Nuclear Bodies), des macrostructures nucléaires très dynamiques regroupant et coordonnant plus de 40 protéines. Il est à noter que la fonction de TIF1α, β et PML est régulée par une modification post-traductionnelle, la sumoylation, qui implique le couplage covalent de la petite protéine SUMO (Small Ubiquitin like MOdifier) à des lysines de ces trois protéines cibles. Cette thèse propose de développer des méthodes utilisant le BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfert) afin de détecter dans des cellules vivantes et en temps réel des interactions non-covalentes de protéines nucléaires mais aussi leur couplage covalent à SUMO. En effet, le BRET n’a jamais été exploré jusqu’alors pour étudier les interactions non-covalentes et covalentes de protéines nucléaires. L’étude de l’interaction de protéines transcriptionnellement actives est parfois difficile par des méthodes classiques du fait de leur grande propension à agréger (famille TRIM) ou de leur association à la matrice nucléaire (ZNF74). L’homo et l’hétérodimérisation de TIF1α, β ainsi que leur interaction avec ZNF74 sont ici testées sur des protéines entières dans des cellules vivantes de mammifères répondant aux résultats conflictuels de la littérature et démontrant que le BRET peut être avantageusement utilisé comme alternative aux essais plus classiques basés sur la transcription. Du fait de l’hétérodimérisation confirmée de TIF1α et β, le premier article présenté ouvre la possibilité d’une relation étroite entre les récepteurs nucléaires et les protéines KRAB- multidoigt de zinc. Des études précédentes ont démontré que la sumoylation de PML est impliquée dans sa dégradation induite par l’As2O3 et dépendante de RNF4, une E3 ubiquitine ligase ayant pour substrat des chaînes de SUMO (polySUMO). Dans le second article, grâce au développement d’une nouvelle application du BRET pour la détection d’interactions covalentes et non-covalentes avec SUMO (BRETSUMO), nous établissons un nouveau lien entre la sumoylation de PML et sa dégradation. Nous confirmons que le recrutement de RNF4 dépend de SUMO mais démontrons également l’implication du SBD (Sumo Binding Domain) de PML dans sa dégradation induite par l’As2O3 et/ou RNF4. De plus, nous démontrons que des sérines, au sein du SBD de PML, qui sont connues comme des cibles de phosphorylation par la voie de la kinase CK2, régulent les interactions non-covalentes de ce SBD mettant en évidence, pour la première fois, que les interactions avec un SBD peuvent dépendre d’un évènement de phosphorylation (“SBD phospho-switch”). Nos résultats nous amènent à proposer l’hypothèse que le recrutement de PML sumoylé au niveau des PML-NBs via son SBD, favorise le recrutement d’une autre activité E3 ubiquitine ligase, outre celle de RNF4, PML étant lui-même un potentiel candidat. Ceci suggère l’existence d’une nouvelle relation dynamique entre phosphorylation, sumoylation et ubiquitination de PML. Finalement, il est suggéré que PML est dégradé par deux voies différentes dépendantes de l’ubiquitine et du protéasome; la voie de CK2 et la voie de RNF4. Enfin une étude sur la sumoylation de TIF1β est également présentée en annexe. Cette étude caractérise les 6 lysines cibles de SUMO sur TIF1β et démontre que la sumoylation est nécessaire à l’activité répressive de TIF1β mais n’est pas impliquée dans son homodimérisation ou son interaction avec la boîte KRAB. La sumoylation est cependant nécessaire au recrutement d’histones déacétylases, dépendante de son homodimérisation et de l’intégrité du domaine PHD. Alors que l’on ne connaît pas de régulateur physiologique de la sumoylation outre les enzymes directement impliquées dans la machinerie de sumoylation, nous mettons en évidence que la sumoylation de TIF1β est positivement régulée par son interaction avec le domaine KRAB et suggérons que ces facteurs transcriptionnels recrutent TIF1β à l’ADN au niveau de promoteur et augmentent son activité répressive en favorisant sa sumoylation.

Régulation des chaperons de la présentation antigénique par ubiquitination

La chaîne invariante forme un complexe nonamérique avec les molécules classiques du CMH de classe II. HLA-DM et HLA-DO, des molécules non-classiques de classe II, sont aussi impliquées dans la présentation des peptides antigéniques aux lymphocytes T. Ces molécules chaperones de la présentation antigénique modulent la capacité d’une cellule à présenter des antigènes par les moloécules classiques du CMH de classe II. La régulation transcriptionnelle des molécules chaperones, tout comme celle des autres molécules du CMH de classe II, est assurée par le transactivateur CIITA. La molécule HLA-DR peut être régulée négativement de manière post-traductionnelle par ubiquitination grâce à l’enzyme E3 ubiquitine ligase MARCH1. Celle-ci est induite par l’interleukine-10 dans les monocytes. L’objectif de ce projet était de déterminer si l’ubiquitination par MARCH1 peut aussi réguler l’expression des molécules chaperones de la présentation antigénique. Les expériences furent réalisées dans le contexte de co-transfections en cellules HEK293T. L’expression des molécules fut évaluée par immunomarquages et cytométrie de flux. Il a été montré que l’isoforme p33 de la chaîne invariante est régulé négativement en présence de MARCH1 à partir de la surface cellulaire, causant ainsi sa dégradation. Tel que démontré par l’utilisation d’un mutant dépourvu de queue cytoplasmique, cette dernière région n’est pas indispensable à ce phénomène. Une hypothèse est qu’une molécule non-identifiée, associée à Ii, serait ubiquitinée par MARCH1, l’entraînant dans sa régulation négative. Il fut déterminer que cette molécule n’était pas CXCR2, un récepteur pouvant être impliqué, avec la chaîne invariante et CD44, en tant que récepteur de MIF (Macrophage Inhibitory Factor). Il fut aussi montré que HLA-DO peut être ciblé par MARCH1 mais ceci ne semble pas être un phénomène dominant; l’expression des complexes DO/DM n’étant pas affectée bien qu’ils entrent en interaction avec MARCH1. L’expression de HLA-DM n’est pas affectée par MARCH1. Il n’a toutefois pas été déterminé hors de tout doute si MARCH1 peut modifier DM; des résultats obtenus avec une queue cytoplasmique de DM possédant une lysine laissant suggérer qu’il est possible que MARCH1 interagisse avec DM. Dans l’ensemble, les travaux démontrent que l’ubiquitination par MARCH1 joue un rôle dans la régulation post-transcriptionnelle de la chaîne invariante p33 mais pas HLA-DO et HLA-DM.

Analyse de la localisation génomique et identification de nouvelles fonctions des sous-unités Rpb4/Rpb7 de l’ARN polymérase II et des facteurs TFIIF, TFIIS et UBR5

Grâce à un grand nombre d’études biochimiques, génétiques et structurales effectuées dans les dernières années, des avancements considérables ont été réalisés et une nouvelle vision du processus par lequel la machinerie transcriptionnelle de l’ARN polymérase II (Pol II) décode l’information génétique a émergé. De nouveaux indices ont été apportés sur la diversité des mécanismes de régulation de la transcription, ainsi que sur le rôle des facteurs généraux de transcription (GTFs) dans cette diversification. Les travaux présentés dans cette thèse amènent de nouvelles connaissances sur le rôle des GTFs humains dans la régulation des différentes étapes de la transcription. Dans la première partie de la thèse, nous avons analysé la fonction de la Pol II et des GTFs humains, en examinant de façon systématique leur localisation génomique. Les patrons obtenus par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) des versions de GTFs portant une étiquette TAP (Tandem-Affinity Purification) indiquent de nouvelles fonctions in vivo pour certains composants de cette machinerie et pour des éléments structuraux de la Pol II. Nos résultats suggèrent que TFIIF et l’hétérodimère Rpb4–Rpb7 ont une fonction spécifique pendant l’étape d’élongation transcriptionnelle in vivo. De plus, notre étude amène une première image globale de la fonction des GTFs pendant la réaction transcriptionnelle dans des cellules mammifères vivantes. Deuxièmement, nous avons identifié une nouvelle fonction de TFIIS dans la régulation de CDK9, la sous-unité kinase du facteur P-TEFb (Positive Transcription Elongation Factor b). Nous avons identifié deux nouveaux partenaires d’interaction pour TFIIS, soit CDK9 et la E3 ubiquitine ligase UBR5. Nous montrons que UBR5 catalyse l’ubiquitination de CDK9 in vitro. De plus, la polyubiquitination de CDK9 dans des cellules humaines est dépendante de UBR5 et TFIIS. Nous montrons aussi que UBR5, CDK9 and TFIIS co-localisent le long du gène  fibrinogen (FBG) et que la surexpression de TFIIS augmente les niveaux d’occupation par CDK9 de régions spécifiques de ce gène, de façon dépendante de UBR5. Nous proposons que TFIIS a une nouvelle fonction dans la transition entre les étapes d’initiation et d’élongation transcriptionnelle, en régulant la stabilité des complexes CDK9-Pol II pendant les étapes précoces de la transcription.

MARCH1 : new insights in the activation of B cells

L’implication des cellules B dans le développement de l’auto-immunité ne cesse d’être illustrée par de récentes publications. Les cellules présentent des peptides du soi aux cellules T auto-réactives ce qui mène à la production de cytokines pro-inflammatoires et d’anticorps auto-réactifs. Dans le présent document, nous explorons la présentation antigénique et la modification post-traductionnelle du complexe majeur d’histocompatibilité II (CMH-II). MARCH1 est une E3 ubiquitine ligase qui cible le CMH-II et le relocalise le complexe vers les endosomes de recyclage. Ainsi, MARCH1 est un inhibiteur de la présentation d’antigènes exogènes. Ici, nous démontrons que MARCH1 est exprimé seulement dans la sous-population des cellules B folliculaires et que cette expression est perdue lors de l’entrée dans les centres germinatifs. Nous proposons que MARCH1 établie une barrière de formation de centres germinatifs. Nous démontrons le lien entre MARCH1 et la hausse de CMH-II à la surface des cellules B à la suite d’un traitement à l’IL-10. De plus, nous avons testé plusieurs stimuli activateurs des cellules B et démontrons que MARCH1 est régulé à la baisse dans tous les cas. De plus, nous mettons en valeurs le rôle de la voie canonique d’activation de NF-κB dans cette régulation de MARCH1. Finalement, nous avons développé un système de lentivirus exprimant MARCH1 qui nous permet de forcer l’expression de MARCH1 dans des cellules réfractaires à la transfection. Nous discutons de l’implication de cette régulation du CMH-II par MARCH1 dans le développement de maladies auto-immunes.

Mécanismes moléculaires de la réplication préférentielle du VIH-1 dans les cellules à polarisation Th1Th17 versus Th1 : rôle de PPARG dans la régulation négative de la réplication virale

Les cellules T CD4+ humaines sont hétérogènes du point de vue de la permissivité à l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). Notre laboratoire a préalablement démontré que les cellules Th1 à phénotype CXCR3+CCR6- sont relativement résistantes à l’infection par le VIH-1 alors que les cellules Th1Th17 à phénotype CXCR3+CCR6+ y sont hautement permissives. La réplication du VIH dépend de plusieurs facteurs cellulaires de restriction ou de permissivité agissant à différentes étapes du cycle viral. Toutefois, malgré plusieurs avancées, la compréhension des voies de signalisation cellulaire impliquées dans la régulation de la réplication du VIH est encore limitée. L’objectif majeur de ce projet de maîtrise est de caractériser les mécanismes moléculaires de la permissivité et de la résistance au VIH respectivement dans les cellules Th1Th17 et Th1. Ce mémoire est divisé en quatre parties qui visent: (i) l’identification des voies canoniques et des fonctions biologiques différemment régulées dans les cellules Th1Th17 versus Th1 par l’analyse de leur transcriptome au niveau du génome entier; (ii) la validation de l’expression différentielle des gènes d’intérêt identifiés par biopuces au niveau des transcrits et des protéines; (iii) la caractérisation du rôle fonctionnel de certains de ces facteurs (i.e., PPARG, AhR) sur la réplication du VIH dans les cellules Th1Th17 versus Th1; et (iv) l’identification du niveau auquel ces facteurs interfèrent avec le cycle de réplication du VIH. Nos résultats d’analyse du transcriptome du génome entier par Gene Set Enrichment Analysis et Ingenuity Pathway Analysis indiquent que les cellules à profil Th1Th17 sont plus susceptibles à l’activation cellulaire et à l’apoptose, favorisent plus l’inflammation et expriment moins fortement les gènes liés à la dégradation protéosomale comparé aux cellules à profil Th1. Ces différences dans la régulation de diverses voies et fonctions biologiques permettent en partie d’expliquer la susceptibilité à l’infection par le VIH dans ces cellules. Nous avons ensuite confirmé l’expression différentielle de certains gènes d’intérêt dans les cellules Th1Th17 (CXCR6, PPARG, ARNTL, CTSH, PTPN13, MAP3K4) versus Th1 (SERPINB6, PTK2) au niveau de l’ARNm et des protéines. Finalement, nous avons démontré le rôle des facteurs de transcription PPARG et AhR dans la régulation de la réplication du VIH. L’activation de la voie PPARG par la rosiglitazone induit la diminution importante de la réplication du VIH dans les cellules T CD4+, alors que l’activation de la voie AhR par les ligands exogènes TCDD et FICZ augmente de façon significative la réplication virale. Nous proposons que la voie PPARG agit comme un régulateur négatif de la réplication du VIH dans ces cellules, en interférant avec la polarisation Th17 et probablement en inhibant l’activité transcriptionnelle du facteur NF-kB. Les rôles des formes nucléaires versus cytoplasmiques du récepteur Ahr semblent être diamétralement opposés, dans la mesure où l’interférence ARN contre AhR s’associe également à l’augmentation de la réplication virale. Il est ainsi possible que la forme cytoplasmique d’AhR, connue par son activité E3 ligase, participe à la dégradation protéosomale des particules virales. Le mécanisme par lequel le AhR nucléaire versus cytoplasmique interfère avec la réplication virale est en cours d’étude au laboratoire. Cette étude représente la première caractérisation de l’expression différentielle de gènes au niveau du génome entier de sous-populations T CD4+ permissives versus résistantes à l’infection par le VIH. Nos résultats identifient de nouvelles cibles moléculaires pour de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à limiter la réplication du VIH dans les lymphocytes T CD4+ primaires.

Manipulation of the ubiquitin-proteasome system by HIV-1 : role of the accessory protein Vpr

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1), l’agent étiologique du SIDA, est un rétrovirus complexe arborant plusieurs protéines accessoires : Nef, Vif, Vpr, et Vpu. Celles-ci sont impliquées dans la modulation de la réplication virale, dans l’évasion immunitaire et dans la progression de la pathogenèse du SIDA. Dans ce contexte, il a été démontré que la protéine virale R (Vpr) induit un arrêt de cycle cellulaire en phase G2. Le mécanisme par lequel Vpr exerce cette fonction est l’activation, ATR (Ataxia telangiectasia and Rad3 related)-dépendante, du point de contrôle de dommage à l’ADN, mais les facteurs et mécanismes moléculaires directement impliqués dans cette activité demeurent inconnus. Afin d’identifier de nouveaux facteurs cellulaires interagissant avec Vpr, nous avons utilisé une purification d’affinité en tandem (TAP) pour isoler des complexes protéiques natifs contenant Vpr. Nous avons découvert que Vpr s’associait avec CRL4A(VprBP), un complexe cellulaire d’E3 ubiquitine ligase, comprenant les protéines Cullin 4A, DDB1 (DNA damage-binding protein 1) et VprBP (Vpr-binding protein). Nos études ont mis en évidence que le recrutement de la E3 ligase par Vpr était nécessaire mais non suffisant pour l’induction de l’arrêt de cycle cellulaire en G2, suggérant ainsi que des événements additionnels seraient impliqués dans ce processus. À cet égard, nous apportons des preuves directes que Vpr détourne les fonctions de CRL4A(VprBP) pour induire la polyubiquitination de type K48 et la dégradation protéosomale de protéines cellulaires encore inconnues. Ces événements d’ubiquitination induits par Vpr ont été démontrés comme étant nécessaire à l’activation d’ATR. Finalement, nous montrons que Vpr forme des foyers ancrés à la chromatine co-localisant avec VprBP ainsi qu’avec des facteurs impliqués dans la réparation de l’ADN. La formation de ces foyers représente un événement essentiel et précoce dans l’induction de l’arrêt de cycle cellulaire en G2. Enfin, nous démontrons que Vpr est capable de recruter CRL4A(VprBP) au niveau de la chromatine et nous apportons des preuves indiquant que le substrat inconnu ciblé par Vpr est une protéine associée à la chromatine. Globalement, nos résultats révèlent certains des ménanismes par lesquels Vpr induit des perturbations du cycle cellulaire. En outre, cette étude contribue à notre compréhension de la modulation du système ubiquitine-protéasome par le VIH-1 et son implication fonctionnelle dans la manipulation de l’environnement cellulaire de l’hôte.

Identification de modifications post-traductionnelles de Staufen1 et étude de leur fonction régulatrice

La régulation post-transcriptionnelle joue un rôle de premier plan dans le contrôle fin de l’expression génique en permettant une modulation de la synthèse de protéines dans le temps et l’espace, en fonction des besoins de la cellule. Ainsi, des protéines reconnaissant des éléments d’ARN présents sur des transcrits peuvent influencer toutes les étapes de leur existence, soit leur épissage, leur export nucléaire, leur localisation subcellulaire, leur traduction et leur dégradation. Staufen1 (Stau1) est un membre de la famille des protéines liant l’ARN double-brin qui contribue à la régulation post-transcriptionnelle par son implication dans des mécanismes qui vont promouvoir l’épissage alternatif, le transport, la dé-répression de la traduction et l’induction de la dégradation d’ARN messagers (ARNm) spécifiques. L’identité des cibles potentielles de Stau1 est maintenant connue puisqu’une étude à l’échelle du génome a montré que la protéine s’associe à près de 7% du transcriptome des cellules HEK293T. Ces ARNm se classent dans un large éventail de catégories fonctionnelles, mais il est tout de même intéressant de noter qu’une grande proportion d’entre eux code pour des protéines reliées au métabolisme cellulaire et à la régulation de processus cellulaires. En considérant toutes ces informations, nous avons émis l’hypothèse que les différentes activités de Stau1 puissent être modulées afin de contrôler adéquatement l’expression des transcrits liés par la protéine. Dans la mesure où certains ARNm faisant partie des complexes définis par la présence de Stau1 codent pour des régulateurs clés de la prolifération cellulaire, nous avons voulu examiner si l’expression de la protéine varie au cours du cycle de division cellulaire. Nous avons montré que l’abondance de Stau1 est maximale en début de mitose et qu’elle diminue ensuite lorsque les cellules complètent la division cellulaire. Nous avons ensuite découvert que cette baisse d’expression de Stau1 en sortie de mitose dépend du complexe promoteur d’anaphase/cyclosome (APC/C). En soutien à l’idée que Stau1 soit une cible de cette ubiquitine ligase de type E3, nous avons de plus démontré que Stau1 est ubiquitiné et dégradé par le protéasome. Ce contrôle des niveaux de Stau1 semble important puisque la surexpression de la protéine retarde la sortie de mitose et entraîne une diminution importante de la prolifération cellulaire. Par ailleurs, nous avons supposé que les différentes fonctions de Stau1 puissent également être sujettes à une régulation. Compte tenu que les activités de nombreuses protéines liant l’ARN peuvent être contrôlées par des modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation, nous avons voulu tester la possibilité que Stau1 soit phosphorylé. L’immunopurification de Stau1 et son analyse par spectrométrie de masse nous a permis d’identifier trois phosphosites dans la protéine. L’évaluation du rôle de ces événements de phosphorylation à l’aide de mutants phoshomimétiques ou non-phoshorylables a révélé que la modification de Stau1 pourrait compromettre son association à la protéine UPF1. Comme cette interaction est nécessaire pour déstabiliser les transcrits liés par Stau1, nos résultats suggèrent fortement que la fonction de Stau1 dans la dégradation d’ARNm est régulée négativement par sa phosphorylation. Toutes ces données mettent en lumière l’importance des modifications post-traductionnelles telles que l’ubiquitination et la phosphorylation dans la modulation de l’expression et des fonctions de Stau 1. Somme toute, il est vraisemblable que ces mécanismes de contrôle puissent avoir un impact significatif sur le destin des ARNm liés par Stau1, particulièrement dans un contexte de progression dans le cycle cellulaire.

Dissection du processus d’export des ARNm nucléaires par des approches de molécules uniques chez Saccharomyces cerevisae

Enfermer le porteur de l’information génétique dans le noyau a obligée la cellule a créé un système de transport complexe, qui permet l’export d’un ARNm du noyau au cytoplasme. Le mécanisme général de l’export des ARNm est encore mal connu, même si les facteurs principaux ont été découverts il y a longtemps. De récents progrès en microscopie nous ont permis d’étudier directement le comportement des ARNm durant le processus d’export. Durant ma maitrise, nous avons été capables de localiser et suivre des ARNm en temps réel pour la première fois chez Saccharomyces cerevisiae. Nous avons créé un gène rapporteur en mettant le gène GLT1 sous le contrôle du promoteur GAL1. Nous avons aussi marqué l’ARNm de GLT1 avec plusieurs boucles PP7. L’ARNm sera visible après l’attachement de plusieurs protéines PP7-GFP aux boucles. En utilisant la technique d’imagerie en cellules vivantes, nous sommes capable de visualiser et suivre chaque ARNm, depuis son relâchement du site de transcription jusqu’à l’export. Une fois relâché du site de transcription, l’ARNm diffuse librement dans le nucléoplasme, mais une fois à la périphérie nucléaire, il commence à « scanner » l’enveloppe nucléaire avant d’être exporté. Nous avons trouvé que le « scanning » dépend de la présence des Myosin Like Proteins (Mlp1p et Mlp2p), protéines qui forment le panier nucléaire, car suite à la délétion de MLP1 et MLP2, les ARNm n’étaient plus capable de « scanner ». Nous avons également trouvé que la partie C-terminale de Mlp1p était nécessaire au « scanning ». De plus, suite à la délétion du gène TOM1, gène codant pour une ubiquitine ligase, les ARNm ont un comportement similaire aux ARNm d’une souche ∆mlp1/mlp2, suggérant que le « scanning » permet à Tom1p d’ubiquitiner Yra1p, ce qui causera son relâchement de l’ARNm. Également, nous avons montré que les ARNm endogènes MDN1 et CBL2 scannent aussi la périphérie nucléaire. Ensemble, nos résultats suggèrent que le scanning est un processus par lequel passent tout les ARNm nucléaire lorsqu’ils se retrouvent à la périphérie du noyau, pour initier plusieurs étapes de réarrangements nécessaires à leurs export. De plus, nous avons examiné le rôle de Yhr127p, une protéine nouvellement identifiée qui se lie à l’ARN. Après avoir marqué cette protéine avec la GFP, nous avons montré qu’elle forme des foci dans le noyau et que ces derniers vont disparaitre suite à l’arrêt de la transcription. La délétion de YHR127 à conduit à une augmentation de la transcription de quelques gènes spécifiques, mais n’affecte pas la capacité de la cellule à exporter les ARNm. Nos résultats suggèrent que cette protéine joue un rôle dans la régulation de la transcription et/ou dans la stabilité de l’ARNm.

Requirements for the selective degradation of CD4 receptor molecules by the human immunodeficiency virus type 1 Vpu protein in the endoplasmic reticulum.

BACKGROUND: HIV-1 Vpu targets newly synthesized CD4 receptor for rapid degradation by a process reminiscent of endoplasmic reticulum (ER)-associated protein degradation (ERAD). Vpu is thought to act as an adaptor protein, connecting CD4 to the ubiquitin (Ub)-proteasome degradative system through an interaction with beta-TrCP, a component of the SCFbeta-TrCP E3 Ub ligase complex. RESULTS: Here, we provide direct evidence indicating that Vpu promotes trans-ubiquitination of CD4 through recruitment of SCFbeta-TrCP in human cells. To examine whether Ub conjugation occurs on the cytosolic tail of CD4, we substituted all four Ub acceptor lysine residues for arginines. Replacement of cytosolic lysine residues reduced but did not prevent Vpu-mediated CD4 degradation and ubiquitination, suggesting that Vpu-mediated CD4 degradation is not entirely dependent on the ubiquitination of cytosolic lysines and as such might also involve ubiquitination of other sites. Cell fractionation studies revealed that Vpu enhanced the levels of ubiquitinated forms of CD4 detected in association with not only the ER membrane but also the cytosol. Interestingly, significant amounts of membrane-associated ubiquitinated CD4 appeared to be fully dislocated since they could be recovered following sodium carbonate salt treatment. Finally, expression of a transdominant negative mutant of the AAA ATPase Cdc48/p97 involved in the extraction of ERAD substrates from the ER membrane inhibited Vpu-mediated CD4 degradation. CONCLUSION: Taken together, these results are consistent with a model whereby HIV-1 Vpu targets CD4 for degradation by an ERAD-like process involving most likely poly-ubiquitination of the CD4 cytosolic tail by SCFbeta-TrCP prior to dislocation of receptor molecules across the ER membrane by a process that depends on the AAA ATPase Cdc48/p97.

HIV-1 Vpr induces the K48-linked polyubiquitination and proteasomal degradation of target cellular proteins to activate ATR and promote G2 arrest

HIV-1 viral protein R (Vpr) induces a cell cycle arrest at the G2/M phase by a mechanism involving the activation of the DNA damage sensor ATR. We and others recently showed that Vpr performs this function by subverting the activity of the DDB1-CUL4A (VPRBP) E3 ubiquitin ligase. Vpr could thus act as a connector between the E3 ligase and an unknown cellular factor whose ubiquitination would induce G2 arrest. While attractive, this model is solely based on the indirect observation that some mutants of Vpr retain their interaction with the E3 ligase but fail to induce G2 arrest. Using a tandem affinity purification approach, we observed that Vpr interacts with ubiquitinated cellular proteins and that this association requires the recruitment of an active E3 ligase given that depletion of VPRBP by RNA interference or overexpression of a dominant-negative mutant of CUL4A decreased this association. Importantly, G2-arrest-defective mutants of Vpr in the C-terminal putative substrate-interacting domain displayed decreased association with ubiquitinated proteins. We also found that inhibition of proteasomal activity increased this association and that the ubiquitin chains were at least in part constituted of classical K48 linkages. Interestingly, inhibition of K48 polyubiquitination specifically impaired Vpr-induced phosphorylation of H2AX, an early target of ATR, but did not affect UV-induced H2AX phosphorylation. Overall, our results provide direct evidence that association of Vpr with the DDB1-CUL4A (VPRBP) E3 ubiquitin ligase induces the K48-linked polyubiquitination of yet-unknown cellular proteins resulting in their proteasomal degradation and ultimately leading to activation of ATR and G2 arrest.

Étude du rôle de la protéine Vpr du VIH-1 dans la modulation de la réponse immunitaire

L’infection par le VIH-1 est caractérisée par une activation chronique du système immunitaire et par une réduction graduelle du nombre de lymphocytes TCD4+, qui contribuent à une détérioration lente du système immunitaire menant à la phase SIDA. Paradoxalement, ce sont majoritairement des lymphocytes T CD4+ non infectés qui sont détruits et la cause de ce phénomène reste encore inconnue. Certaines protéines virales, dont la protéine accessoire Vpr, sont soupçonnées de jouer un rôle dans ce processus. Synthétisée tardivement, Vpr est incorporée à l’intérieur des virions, en plus d’être relâchée sous forme soluble dans le milieu extracellulaire. La principale fonction biologique de Vpr est l’induction d’un arrêt de cycle en phase G2/M, via le recrutement du complexe d’ubiquitine E3 ligase CUL4A-DDB1VprBP et l’activation de la voie de dommage à l’ADN contrôlée par la kinase ATR. Une étude démontre que l’activation des voies de dommages à l’ADN conduit à l’expression de ligands du récepteur activateur NKG2D, exprimés par les cellules NK, déclenchant leurs fonctions cytolytiques. Chose intéressante, plusieurs études suggèrent que le VIH-1 régule positivement l’expression des ligands de NKG2D à la surface des lymphocytes T CD4+ infectés. Cependant, le facteur viral impliqué dans ce processus reste encore indéfini. Le but de cette thèse était d’évaluer le rôle de Vpr dans la modulation des fonctions cytolytiques des cellules NK et son implication potentielle dans la destruction des lymphocytes T CD4+. Nos travaux ont permis de démontrer que l’expression de Vpr, seule ou dans le contexte de l’infection, est suffisante afin d’augmenter spécifiquement l’expression du ligand de NKG2D, ULBP2, au niveau de lymphocytes T CD4+ primaires. Conséquemment, Vpr augmente ainsi la susceptibilité de ces cellules à une lyse par des cellules NK autologues. Nous démontrons que cette régulation positive d’ULBP2 repose sur la capacité de Vpr de recruter le complexe d’ubiquitine E3 ligase DDB1-CUL4AVprBP et l’activation de la voie de dommage à l’ADN ATR. Plus important encore, nous apportons des preuves que Vpr augmente également l’expression d’ULBP2 au niveau des cellules non infectées lors d’une infection de lymphocytes TCD4+ par le VIH-1. À cet effet, nous montrons que l’acheminement de Vpr au niveau de lymphocytes T CD4+ non infectés via des particules virales défectives est suffisant afin de réguler positivement ULBP2 et d’augmenter leur lyse par des cellules NK autologues. De plus, nous décrivons pour la première fois que Vpr, sous forme soluble, a la capacité d’induire des dommages à l’ADN et de réguler positivement ULBP2 suite à la transduction de différents types cellulaires, incluant des cellules T. Globalement, nos résultats démontrent que Vpr est un facteur viral clé impliqué dans la régulation positive des ligands de NKG2D induite par le VIH-1. Cette régulation positive d’ULBP2 pourrait alors contribuer à la destruction des lymphocytes T CD4+ infectés et non infectés via l’activation des fonctions cytolytiques des cellules NK. Une meilleure compréhension de la contribution de cette activité de Vpr dans la pathogenèse du VIH-1 a le potentiel de permettre le développement de nouvelles cibles ou stratégies thérapeutiques contre le VIH-1.

Study of histone H3 lysine 56 deacetylation in saccharomyces cerevisiae

Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, l'acétylation de l'histone H3 sur la lysine 56 (H3K56ac) est présente sur les histones néo-synthétisées déposées derrière les fourches de réplication et est essentielle pour préserver la viabilité cellulaire en réponse au dommage à l'ADN. La désacétylation d'H3K56 sur l'ensemble du génome catalysée par Hst3 et Hst4 et a lieu en phase G2 ou M. H3K56ac est une lame à double tranchant. L'absence d'H3K56ac rend les cellules sensibles aux dommages à l'ADN. En revanche, un excès d'acétylation d'H3K56 dans un mutant hst3Δ hst4Δ a des conséquences encore plus sévères tels que la thermo-sensibilité, l'hypersensibilité aux agents génotoxiques, l'instabilité génomique ainsi qu'une courte durée de vie réplicative. Les désacétylases Hst3 et Hst4 sont étroitement régulées au cours du cycle cellulaire afin de permettre à l'H3K56ac d'exercer son rôle en réponse aux dommages à l'ADN tout en évitant les conséquences néfastes de l'hyperacétylation d'H3K56. Dans cette thèse, nous avons identifié la machinerie moléculaire responsable de la dégradation de Hst3. De plus, nous avons exploré les raisons pour lesquelles l'absence de désacétylation donne lieu aux phénotypes du mutant hst3Δ hst4Δ. Au chapitre 2, nous démontrons que la dégradation d'Hst3 peut être complétée avant l'anaphase. Ceci suggère que la désacétylation de H3K56 a lieu durant une courte fenêtre du cycle cellulaire se situant entre la complétion de la phase S et la métaphase. De plus, nous avons identifié deux sites de phosphorylation d'Hst3 par la kinase cycline-dépendante 1 (Cdk1) et démontré que ces évènements de phosphorylation conduisent à la dégradation d'Hst3 in vivo. Nous avons aussi démontré que l'ubiquityltransférase Cdc34 et l'ubiquitine ligase SCFCdc4 sont requises pour la dégradation d'Hst3. Finalement, nous avons montré que la phosphorylation d'Hst3 par la kinase mitotique Clb2-Cdk1 peut directement entraîner l'ubiquitylation d'Hst3 par SCFCdc4 in vitro. Au chapitre 3, nous avons étudié les mécanismes moléculaires sous-jacents à la sensibilité extrême du mutant hst3Δ hst4Δ aux agents qui endommagent l'ADN. Nous avons établi qu'en raison de la présence anormale d'H3K56ac devant les fourches de réplication, le mutant hst3Δ hst4Δ exhibe une forte perte de viabilité lorsqu'exposé au méthyl méthanesulfonate (MMS) durant un seul passage à travers la phase S. Nous avons aussi découvert que, malgré le fait que le point de contrôle de réponse aux dommages à l'ADN est activé normalement dans le mutant hst3Δ hst4Δ, ce mutant est incapable de compléter la réplication de l'ADN et d'inactiver le point de contrôle pour une longue période de temps après exposition transitoire au MMS. L'ensemble de nos résultats suggère que les lésions à l'ADN induites par le MMS dans le mutant hst3Δ hst4Δ causent une forte perte de viabilité parce que ce mutant est incapable de compléter la réplication de l'ADN après une exposition transitoire au MMS. Dans la deuxième section du chapitre 3, nous avons employé une approche génétique afin d'identifier de nouveaux mécanismes de suppression de deux phénotypes prononcés du mutant hst3Δ hst4Δ. Nous avons découvert que la délétion de plusieurs gènes impliqués dans la formation de frontières entre l'hétérochromatine et de l'euchromatine atténue les phénotypes du mutant hst3Δ hst4Δ sans réduire l'hyperacétylation d'H3K56. Nos résultats indiquent aussi que l'abondante acétylation de l'histone H4 sur la lysine 16 (H4K16ac) est néfaste au mutant hst3Δ hst4Δ. Ce résultat suggère un lien génétique intriguant entre l'acétylation d'H3K56 et celle d'H4K16. L'existence de ce lien était jusqu'à présent inconnu. Nous avons identifié un groupe de suppresseurs spontanés où H3K56ac est indétectable, mais la majorité de nos suppresseurs ne montrent aucune réduction flagrante d'H3K56ac ou d'H4 K16ac par rapport aux niveaux observés dans le mutant hst3Δ hst4Δ. Une étude plus approfondie de ce groupe de suppresseurs est susceptible de mener à la découverte de nouveaux mécanismes génétiques ou épigénétiques permettant d'éviter les conséquences catastrophiques de l'hyperacétylation d'H3K56 chez le mutant hst3Δ hst4Δ. En résumé, cette thèse identifie la machinerie moléculaire responsable de la dégradation d'Hst3 (une désacétylase d'H3K56) durant une fenêtre de temps situées entre la fin de la phase S et la métaphase. Nos résultats permettent aussi d'expliquer pourquoi la dégradation d'Hst3 précède le début de la phase S durant laquelle l'acétylation d'H3K56 s'accumule derrière les fourches de réplication afin d'exercer son rôle de mécanisme de défense contre le dommage à l'ADN. De plus, nous avons identifié plusieurs suppresseurs qui permettent de contourner le rôle important d'Hst3 et Hst4 en réponse au dommage à l'ADN. Plusieurs suppresseurs révèlent un lien génétique inattendu entre deux formes abondantes d'acétylation des histones chez Saccharomyces cerevisiae, soit H3K56ac et H4K16ac.