Développement de méthodes analytiques de séparation des produits de digestion enzymatique des dérivés de cellulose

La cellulose et ses dérivés sont utilisés dans un vaste nombre d’applications incluant le domaine pharmaceutique pour la fabrication de médicaments en tant qu’excipient. Différents dérivés cellulosiques tels que le carboxyméthylcellulose (CMC) et l’hydroxyéthylcellulose (HEC) sont disponibles sur le commerce. Le degré de polymérisation et de modification diffèrent énormément d’un fournisseur à l’autre tout dépendamment de l’origine de la cellulose et de leur procédé de dérivation, leur conférant ainsi différentes propriétés physico-chimiques qui leurs sont propres, telles que la viscosité et la solubilité. Notre intérêt est de développer une méthode analytique permettant de distinguer la différence entre deux sources d’un produit CMC ou HEC. L’objectif spécifique de cette étude de maitrise était l’obtention d’un profil cartographique de ces biopolymères complexes et ce, par le développement d’une méthode de digestion enzymatique donnant les oligosaccharides de plus petites tailles et par la séparation de ces oligosaccharides par les méthodes chromatographiques simples. La digestion fut étudiée avec différents paramètres, tel que le milieu de l’hydrolyse, le pH, la température, le temps de digestion et le ratio substrat/enzyme. Une cellulase de Trichoderma reesei ATCC 26921 fut utilisée pour la digestion partielle de nos échantillons de cellulose. Les oligosaccharides ne possédant pas de groupements chromophores ou fluorophores, ils ne peuvent donc être détectés ni par absorbance UV-Vis, ni par fluorescence. Il a donc été question d’élaborer une méthode de marquage des oligosaccharides avec différents agents, tels que l’acide 8-aminopyrène-1,3,6-trisulfonique (APTS), le 3-acétylamino-6-aminoacridine (AA-Ac) et la phénylhydrazine (PHN). Enfin, l’utilisation de l’électrophorèse capillaire et la chromatographie liquide à haute performance a permis la séparation des produits de digestion enzymatique des dérivés de cellulose. Pour chacune de ces méthodes analytiques, plusieurs paramètres de séparation ont été étudiés.

Analyse fonctionnelle de deux nouvelles mutations récessives de l’AQP2 impliquées dans le diabète insipide néphrogénique par expression dans les ovocytes de Xenopus laevis

Le diabète insipide néphrogénique (DIN) autosomal peut être causé par les mutations du gène codant pour le canal à eau aquaporine-2 (AQP2). Un modèle couramment utilisé pour l’étude des protéines membranaires telle l’AQP2 est l’expression hétérologue dans les ovocytes de Xenopus laevis. Malheureusement, les techniques déjà existantes de purification de membranes plasmiques sont soit trop longues, trop difficiles ou demandent trop de matériel, ne permettent pas l’analyse adéquate du ciblage des formes sauvage comme mutantes, un élément crucial de ce type d’étude. Nous avons donc dans un premier temps mis au point une technique rapide et efficace de purification de membranes plasmiques qui combine la digestion partielle de la membrane vitelline, sa polymérisation à la membrane plasmique suivi de centrifugations à basse vitesse pour récolter les membranes purifiées. Nous avons utilisé cette technique dans l’étude de deux nouveaux cas familiaux de patients hétérozygotes possédant les mutations V24A et R187C dans un cas et K228E et R187C dans le second cas. Pour chaque mutation, nous avons analysé autant les éléments de fonctionnalité que les paramètres d’expression des protéines mutantes. Les expériences de perméabilité membranaire démontrent que les ovocytes exprimant AQP2-V24A (Pf = 16.3 ± 3.5 x 10-4 cm/s, 10 ng) et AQP2- K228E (Pf = 19.9 ± 7.0 x 10-4 cm/s, 10 ng) ont des activités similaires à celle exprimant la forme native (Pf = 14.4 ± 5.5 x 10-4 cm/s, 1 ng), tandis que AQP2- R187C (Pf = 2.6 ± 0.6 x 10-4 cm/s, 10 ng) ne semble avoir aucune activité comme ce qui est observé chez les ovocytes non-injectés (Pf = 2.8 ± 1.0 x 10-4 cm/s). Les études de co-expression ont démontré un effet d’additivité lorsque AQP2-V24A et -K228E sont injectées avec la forme native et un effet s’apparentant à la dominance négative lorsque AQP2-R187C est injecté avec la forme native, avec AQP2-V24A ou avec –K228E. Les résultats obtenus par immunobuvardage représente bien ce qui a été démontré précédemment, on remarque la présence des mutations K228E, V24A et la forme sauvage à la membrane plasmique, contrairement à la mutation R187C. Cependant, lorsque les mutations sont exprimées dans des cellules mIMCD-3, il n’y a qu’une faible expression à la membrane de la forme –K228E et une absence totale des formes –V24A et –R187C à la membrane plasmique, contrairement à la forme native. Les résultats de nos études démontrent que tout dépendant du système d’expression les formes –K228E et –V24A peuvent être utiles dans l’étude des problèmes d’adressage à la membrane à l’aide de chaperonne chimique. De plus, la forme –R187C démontre des difficultés d’adressage qui devront être étudiées afin de mieux comprendre la synthèse des formes natives.

Marquage fluorescent des protéines pour étudier les enzymes protéolytiques solubles et immobilisées par la cartographie peptidique électrophorétique

La cartographie peptidique est une méthode qui permet entre autre d’identifier les modifications post-traductionnelles des protéines. Elle comprend trois étapes : 1) la protéolyse enzymatique, 2) la séparation par électrophorèse capillaire (CE) ou chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) des fragments peptidiques et 3) l’identification de ces derniers. Cette dernière étape peut se faire par des méthodes photométriques ou par spectrométrie de masse (MS). Au cours de la dernière décennie, les enzymes protéolytiques immobilisées ont acquis une grande popularité parce qu’elles peuvent être réutilisées et permettent une digestion rapide des protéines due à un rapport élevé d’enzyme/substrat. Pour étudier les nouvelles techniques d’immobilisation qui ont été développées dans le laboratoire du Professeur Waldron, la cartographie peptidique par CE est souvent utilisée pour déterminer le nombre total de peptides détectés et leurs abondances. La CE nous permet d’avoir des séparations très efficaces et lorsque couplée à la fluorescence induite par laser (LIF), elle donne des limites de détection qui sont 1000 fois plus basses que celles obtenues avec l’absorbance UV-Vis. Dans la méthode typique, les peptides venant de l’étape 1) sont marqués avec un fluorophore avant l’analyse par CE-LIF. Bien que la sensibilité de détection LIF puisse approcher 10-12 M pour un fluorophore, la réaction de marquage nécessite un analyte dont la concentration est d’au moins 10-7 M, ce qui représente son principal désavantage. Donc, il n’est pas facile d’étudier les enzymes des peptides dérivés après la protéolyse en utilisant la technique CE-LIF si la concentration du substrat protéique initial est inférieure à 10-7 M. Ceci est attribué à la dilution supplémentaire lors de la protéolyse. Alors, afin d’utiliser le CE-LIF pour évaluer l’efficacité de la digestion par enzyme immobilisée à faible concentration de substrat,nous proposons d’utiliser des substrats protéiques marqués de fluorophores pouvant être purifiés et dilués. Trois méthodes de marquage fluorescent de protéine sont décrites dans ce mémoire pour étudier les enzymes solubles et immobilisées. Les fluorophores étudiés pour le marquage de protéine standard incluent le naphtalène-2,3-dicarboxaldéhyde (NDA), la fluorescéine-5-isothiocyanate (FITC) et l’ester de 6-carboxyfluorescéine N-succinimidyl (FAMSE). Le FAMSE est un excellent réactif puisqu’il se conjugue rapidement avec les amines primaires des peptides. Aussi, le substrat marqué est stable dans le temps. Les protéines étudiées étaient l’-lactalbumine (LACT), l’anhydrase carbonique (CA) et l’insuline chaîne B (INB). Les protéines sont digérées à l’aide de la trypsine (T), la chymotrypsine (CT) ou la pepsine (PEP) dans leurs formes solubles ou insolubles. La forme soluble est plus active que celle immobilisée. Cela nous a permis de vérifier que les protéines marquées sont encore reconnues par chaque enzyme. Nous avons comparé les digestions des protéines par différentes enzymes telles la chymotrypsine libre (i.e., soluble), la chymotrypsine immobilisée (i.e., insoluble) par réticulation avec le glutaraldéhyde (GACT) et la chymotrypsine immobilisée sur billes d’agarose en gel (GELCT). Cette dernière était disponible sur le marché. Selon la chymotrypsine utilisée, nos études ont démontré que les cartes peptidiques avaient des différences significatives selon le nombre de pics et leurs intensités correspondantes. De plus, ces études nous ont permis de constater que les digestions effectuées avec l’enzyme immobilisée avaient une bonne reproductibilité. Plusieurs paramètres quantitatifs ont été étudiés afin d’évaluer l’efficacité des méthodes développées. La limite de détection par CE-LIF obtenue était de 3,010-10 M (S/N = 2,7) pour la CA-FAM digérée par GACT et de 2,010-10 M (S/N = 4,3) pour la CA-FAM digérée par la chymotrypsine libre. Nos études ont aussi démontrées que la courbe d’étalonnage était linéaire dans la région de travail (1,0×10-9-1,0×10-6 M) avec un coefficient de corrélation (R2) de 0,9991.

Une nouvelle stratégie de traitement de la maladie cœliaque basée sur les polymères séquestrants

La maladie cœliaque ou sprue cœliaque est une intolérance au gluten. Il s’agit d’une maladie inflammatoire de l’intestin liée à l’ingestion de gluten chez des personnes génétiquement susceptibles. Ce désordre présente une forte prévalence puisqu’il touche 1 % de la population mondiale. En l’état actuel des choses, il n’existe aucun outil pharmacologique pour traiter ou pallier à cette maladie. Cependant, grâce aux avancées dans la compréhension de sa pathogenèse, de nouvelles cibles thérapeutiques ont été identifiées. À l’heure actuelle, le seul traitement efficace consiste à suspendre la consommation de l’agent pathogène, à savoir le gluten. Le gluten est un ensemble de protéines de stockage des céréales contenu dans le blé, l’orge et le seigle. Le gluten du blé se subdivise en gluténines et gliadines. Ce sont ces dernières qui semblent les plus impliquées dans la maladie cœliaque. Les gliadines et ses protéines apparentées (i.e. sécalines et hordéines, respectivement dans le seigle et l’orge) sont riches en prolines et en glutamines, les rendant résistantes à la dégradation par les enzymes digestives et celles de la bordure en brosse. Les peptides résultant de cette digestion incomplète peuvent induire des réponses immunitaires acquises et innées. L’objectif principal de cette thèse était de tester un nouveau traitement d’appoint de la maladie cœliaque utile lors de voyages ou d’évènements ponctuels. Dans les années 80, une observation italienne montra l’inhibition de certains effets induits par des gliadines digérées sur des cultures cellulaires grâce à la co-incubation en présence de mannane: un polyoside naturel composé de mannoses. Malheureusement, ce traitement n’était pas applicable in vivo à cause de la dégradation par les enzymes du tractus gastro-intestinales du polymère, de par sa nature osidique. Les polymères de synthèse, grâce à la diversité et au contrôle de leurs propriétés physico-chimiques, se révèlent être une alternative attrayante à ce polymère naturel. L’objectif de cette recherche était d’obtenir un polymère liant la gliadine, capable d’interférer dans la genèse de la maladie au niveau du tube digestif, afin d’abolir les effets délétères induits par la protéine. Tout d’abord, des copolymères de type poly (hydroxyéthylméthacrylate)-co-(styrène sulfonate) (P(HEMA-co-SS)) ont été synthétisés par polymérisation radicalaire contrôlée par transfert d’atome (ATRP). Une petite bibliothèque de polymères a été préparée en faisant varier la masse molaire, ainsi que les proportions de chacun des monomères. Ces polymères ont ensuite été testés quant à leur capacité de complexer la gliadine aux pH stomacal et intestinal et les meilleurs candidats ont été retenus pour des essais cellulaires. Les travaux ont permis de montrer que le copolymère P(HEMA-co-SS) (45:55 mol%, 40 kDa) permettait une séquestration sélective de la gliadine et qu’il abolissait les effets induits par la gliadine sur différents types cellulaires. De plus, ce composé interférait avec la digestion de la gliadine, suggérant une diminution de peptides immunogènes impliqués dans la maladie. Ce candidat a été testé in vivo, sur un modèle murin sensible au gluten, quant à son efficacité vis-à-vis de la gliadine pure et d’un mélange contenant du gluten avec d’autres composants alimentaires. Le P(HEMA-co-SS) a permis de diminuer les effets sur les paramètres de perméabilité et d’inflammation, ainsi que de moduler la réponse immunitaire engendrée par l’administration de gliadine et celle du gluten. Des études de toxicité et de biodistribution en administration aigüe et chronique ont été réalisées afin de démontrer que ce dernier était bien toléré et peu absorbé suite à son administration par la voie orale. Enfin des études sur des échantillons de tissus de patients souffrants de maladie cœliaque ont montré un bénéfice therapeutique du polymère. L’ensemble des travaux présentés dans cette thèse a permis de mettre en évidence le potentiel thérapeutique du P(HEMA-co-SS) pour prévenir les désordres reliés à l’ingestion de gluten, indiquant que ce type de polymère pourrait être exploité dans un avenir proche.

Rôle du stress oxydant en période néonatale dans l'hypertension artérielle et la dysfonction vasculaire et métabolique de l'adulte

Thèse réalisée dans le cadre d'une cotutelle entre l'Université de Montréal et l'Université d'Auvergne en France

Nutrition parentérale du nouveau-né : modulation du stress oxydant et conséquences hépatiques

Introduction : Les enfants prématurés ont la particularité de naître alors que leur développement est souvent incomplet et nécessite la mise en œuvre de soins intensifs visant à poursuivre leur croissance en dehors de l’environnement utérin. Souvent cependant, le stade développemental de l’enfant ne lui permet pas d’assimiler une alimentation entérale du fait de l’immaturité de son système digestif. Le recours à une voie centrale délivrant les nutriments assurant le développement devient alors une nécessité. Ce type de nutrition, appelée nutrition parentérale (NP, ou total parenteral nutrition TPN), permet l’administration de molécules simples, directement dans le sang du prématuré. Il n’est toutefois pas exempt de risques puisqu’exposée à la lumière, la NP peut s’oxyder et générer des molécules oxydantes telles que des hydroperoxydes lipidiques susceptibles de se fragmenter par la suite en hydroxy-alkénals. Ceci devient problématique au vu de l’immaturité des systèmes de défenses antioxydants du nouveau-né prématuré. L’utilisation prolongée de la NP est d’ailleurs à l’origine de maladie hépatiques dans lesquelles le stress oxydant et la nécro-inflammation sont des composantes majeures. Nous avons émis l’hypothèse que l’infusion chez les enfants prématurés, d’aldéhydes d’origine lipidique est en relation avec le développement du stress oxydant et de l’inflammation hépatique. Objectif : Notre étude a consisté à évaluer la relation entre les quantités d’hydroxy-alkénals dans la NP et les effets hépatiques engendrés sur les marqueurs de stress oxydant et les voies de signalisation responsables d’une induction de processus inflammatoire. Dans ce but, nous avons cherché à mesurer la peroxydation lipidique dans l’émulsion lipidique de la NP et la conséquence de l’infusion en continue d’hydroxy-alkénals sur les marqueurs de stress oxydant, sur la voie de signalisation médiée par le Nuclear Factor κB et sur le déclenchement du processus inflammatoire hépatique. A la suite de ce travail, nous avons également travaillé sur des alternatives à la photoprotection, qui est la seule méthode réellement optimale pour réduire la peroxydation des lipides de la NP, mais cliniquement difficilement praticable. Résultats : Nos résultats ont mis en évidence la génération de 4-hydroxynonenal in vitro dans la NP, ce phénomène est augmenté par une exposition lumineuse. Dans ce cadre, nous avons montré l’inefficacité de l’ajout de multivitamines dans l’émulsion lipidique comme alternative à la photoprotection. Dans la validation biologique qui a suivi sur un modèle animal, nos résultats ont permis de démontrer que l’augmentation des adduits glutathion-hydroxynonenal était imputable à l’augmentation de 4-hydroxynonenal (4-HNE) dans la NP, et non à une peroxydation endogène. Nos données indiquent que la probable augmentation hépatique des niveaux de 4-HNE a conduit à une activation du NFκB responsable de l’activation de la transcription des gènes pro-inflammatoires du Tumour Necrosis Factor-α (TNF-α) et de l’interleukine-1 (IL-1). Nous avons alors évalué la capacité d’une émulsion lipidique enrichie en acides gras polyinsaturés (AGPI) n-3 à baisser les concentrations de 4-HNE dans la NP, mais également à moduler le stress oxydant et les marqueurs pro-inflammatoires. Enfin, nous avons démontré, en collaboration avec l’équipe du Dr Friel, que certains peptides isolés du lait humain (par un processus mimant la digestion) permettent également une modulation du stress oxydant et du processus inflammatoire. Conclusion : Le stress oxydant exogène issu de la NP a conduit par activation de facteurs de transcription intra-hépatiques au déclenchement d’un processus inflammatoire potentiellement responsable du développement de maladies hépatiques reliées à la NP telle que la cholestase. Dans ce sens, les AGPI n-3 et les peptides antioxydants peuvent se poser en tant qu’alternatives crédibles à la photoprotection.

Détermination du béryllium dans les cheveux humains non exposés, les poils et les os de souris exposées à des poussières de béryllium

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Anaerobic Digestibility of Microalgae : Fate and Limitations of Long Chain Fatty Acids in the Biodegradation of Lipids

La digestion anaérobie est un processus biologique dans lequel un consortium microbien complexe fonctionnant en absence d’oxygène transforme la matière organique en biogaz, principalement en méthane et en dioxyde de carbone. Parmi les substrats organiques, les lipides sont les plus productifs de méthane par rapport aux glucides et aux protéines; mais leur dégradation est très difficile, en raison de leur hydrolyse qui peut être l’étape limitante. Les algues peuvent être une source importante pour la production de méthane à cause de leur contenu en lipides potentiellement élevé. L’objectif de cette étude était, par conséquent, d’évaluer la production en méthane des microalgues en utilisant la technique du BMP (Biochemical méthane Potential) et d’identifier les limites de biodégradion des lipides dans la digestion anaérobie. Le plan expérimental a été divisé en plusieurs étapes: 1) Comparer le potentiel énergétique en méthane des macroalgues par rapport aux microalgues. 2) Faire le criblage de différentes espèces de microalgues d’eau douce et marines afin de comparer leur potentiel en méthane. 3) Déterminer l'impact des prétraitements sur la production de méthane de quelques microalgues ciblées. 4) Identifier les limites de biodégradation des lipides algaux dans la digestion anaérobie, en étudiant les étapes limitantes de la cinétique des lipides et de chacun des acides gras à longues chaines. Les résultats ont montré que les microalgues produisent plus de méthane que les macroalgues. Les BMP des microalgues d'eau douce et marines n'ont montré aucune différence en termes de rendement en méthane. Les résultats des prétraitements ont montré que le prétraitement thermique (microonde) semblait être plus efficace que le prétraitement chimique (alcalin). Les tests de contrôle du BMP faits sur l'huile de palme, l’huile de macadamia et l'huile de poisson ont montré que l'hydrolyse des huiles en glycérol et en acides gras à longues chaines n'était pas l'étape limitante dans la production de méthane. L'ajout de gras dans les échantillons de Phaeodactylum dégraissée a augmenté le rendement de méthane et cette augmentation a été corrélée à la quantité de matières grasses ajoutées.

Conséquences de l’acclimatation à différents régimes thermiques sur les taux métaboliques standards des tacons du saumon de l’Atlantique(Salmo salar)

Les poissons vivant au sein d’une rivière sont soumis à des variations circadiennes de température pouvant influencer la croissance, la digestion et le métabolisme standard. Les modèles bioénergétiques utilisant les fonctions métaboliques pour déterminer la croissance d’un poisson ont souvent été élaborés avec des poissons acclimatés à des températures constantes. Ces modèles pourraient sous-estimer l’énergie dépensée par un poisson soumis à des températures fluctuantes. En utilisant la respirométrie par débit intermittent, les objectifs de ce travail étaient : (1) de quantifier les différences entre les taux métaboliques standards de poissons acclimatés à une température constante (20.2 oC ± 0.5 oC) et à des fluctuations circadiennes de température (19.8 oC ± 2.0 oC; 19.5 oC ± 3.0 oC) et (2) comparer deux méthodologies pour calculer les taux métaboliques standards de poissons sujets aux fluctuations circadiennes de températures : respirométrie (a) en température constante ou (b) en température fluctuante. Les poissons acclimatés à des fluctuations circadiennes de température ont des taux métaboliques standards plus élevés que des poissons acclimatés à une température constante. À 20.2 oC ± 0.5 oC, les taux métabolique standards ont été de 25% à 32% plus bas pour des poissons maintenus à une température constante que pour des poissons gardés sous des fluctuations circadiennes de température. Les méthodologies utilisées pour estimer les taux métaboliques standards de poissons sujets aux fluctuations de température offrent des résultats similaires.

Mercure, arsenic et sélénium au Burkina Faso : bioaccumulation, transfert trophique dans les systèmes aquatiques et évaluation de bioaccessibilité chez les humains

L’extraction aurifère est l’une des activités humaines qui a fortement accru l’émission de contaminants métalliques dans l’environnement. Le mercure (Hg), l’arsenic (As) et le sélénium (Se) sont 3 polluants métalliques de grande toxicité environnementale. En milieu aquatique, ils peuvent subir des transformations menant à des composés capables de bioaccumulation et de bioamplification. Il peut en résulter des concentrations 106 fois celle mesurée dans l’eau chez les poissons et les organismes situés en haut des chaînes alimentaires posant de ce fait de graves menaces pour la santé de ces organismes ainsi que leurs consommateurs y compris les humains. Cette étude a évalué les teneurs en Hg, As et Se dans les milieux aquatiques au Burkina Faso, une région d’Afrique sub-saharienne soumise à une exploitation minière intensive. Le risque potentiel pour les organismes aquatiques et les humains a été évalué en considérant les effets des interactions antagonistes Se/Hg et As/Se. La bioaccumulation et le transfert du Hg et du Se dans les réseaux trophiques sont également décrits. L’exposition au Hg de poissons par les humains a été également évalué au laboratoire par mesure de la bioaccessibilité comme équivalent de la biodisponibilité par simulation de la digestion humaine. En général, les milieux aquatiques étudiés étaient peu affectés par ces 3 métal(loïd)s bien que certaines espèces de poisson issus des réservoirs les plus profonds indiquent des teneurs de Hg au dessus de 500 ngHg/g (poids frais) recommandé par l’OMS. Ces niveaux sont susceptibles de présenter des risques toxicologiques pour les poissons et pour leurs consommateurs. En considérant l’antagonisme Se/Hg, 99 % des échantillons de poisson seraient moins exposés à la toxicité du Hg dû à la présence simultanée du sélénium dans le milieu et pourraient être consommés sans risque. Cependant, les effets potentiels de l’antagonisme As/Se pourraient réduire les effets bénéfiques du Se et ramener cette proportion à 83 %. L’application des mesures de signatures en isotopes stables d’azote (δ15N) et de carbone (δ13C) des organismes aquatiques a permis le traçage des voies de transfert du Hg et du Se dans les réseaux trophiques. On y observe des chaînes trophiques très courtes (3 - 4 niveaux trophiques) et des poissons majoritairement benthiques. L’approche isotopique n’a cependant pas permis de détecter les variations saisonnières des niveaux de contamination en Hg des poissons. L’exploration des contenus stomacaux des poissons a permis de mieux expliquer la baisse des concentrations en Hg et Se observées chez certains poissons au cours de la saison sèche en lien avec la variation de la composition des proies que l’analyse isotopique n’a pas cerné. L’étude suggère que l’analyse de contenus stomacaux ainsi que l’étude de la dynamique des communautés d’invertébrés couplées à celle des métaux pourraient améliorer la compréhension du fonctionnement des écosystèmes étudiés. Enfin, l’évaluation expérimentale de l’exposition au Hg indique que les modes de traitement avant consommation ainsi que l’usage de composés alimentaires tels le thé, le café lors de repas de poisson par certaines communautés humaines ont un impact sur la bioaccessibilité du Hg de poisson. Ces résultats, sous réserve de validation par des modèles animaux, suggèrent la prise en compte des habitudes alimentaires des communautés dans l’élaboration adéquat des avis de consommation de poisson.

Identification et caractérisation des principaux fragments du collagène de type II du cartilage équin, produit in vitro par l'enzyme cathepsine K

La dégradation protéolytique du collagène de type II est considérée comme étant un facteur majeur dans le processus irréversible de dégradation de la matrice cartilagineuse lors d’ostéoarthrose. Outre les collagénases de la famille des métaloprotéinases de la matrice (MMP-1, -8, -13), la cathepsine K est parmi les seules enzymes susceptibles de dégrader la triple hélice intacte du collagène de type II, devenant ainsi un élément pertinent pour les recherches sur l’ostéoarthrose. L’objectif à court terme de notre étude consiste en l’identification et la caractérisation de sites de clivage spécifiques de la cathepsine K sur le collagène de type II équin. La technique d’électrophorèse SDS-PAGE 1D permet la visualisation des produits de digestion et la validation des résultats de la caractérisation moléculaire des fragments protéolytiques. La caractérisation est réalisée en combinant la digestion trypsique précédant l’analyse HPLC-ESI/MS. Les résultats ont permis d’établir les sites, présents sur la carte peptidique de la molécule de collagène de type II équin, des 48 résidus prolines (P) et 5 résidus lysines (K) supportant une modification post-traductionnelle. De plus, 6 fragments majeurs, différents de ceux produits par les MMPs, sont observés par SDS-PAGE 1D puis confirmés par HPLC-ESI/MS, correspondant aux sites suivants : F1 [G189-K190], F2 [G252-P253], F3 [P326-G327], F4 [P428-G429], F5 [P563-G564] et F6 [P824-G825]. Le fragment F1 nouvellement identifié suggère un site de clivage différent de l’étude antérieure sur le collagène de type II bovin et humain. L’objectif à long terme serait le développement d’anticorps spécifiques au site identifié, permettant de suivre l’activité protéolytique de la cathepsine K par immunohistochimie et ÉLISA, dans le cadre du diagnostic de l’ostéoarthrose.

A study of chymotrypsin immobilization conditions for improved peptide mapping

La cartographie peptidique est une technique de grande importance utilisée lors de l’identification des protéines et la caractérisation des modifications post-traductionnelles des protéines. Deux méthodes sont utilisées afin de couper les protéines en peptides pour la cartographie : les méthodes chimiques et les méthodes enzymatiques. Dans ce projet, l’enzyme chymotrypsine a été utilisée pour l’hydrolyse (la digestion) des liens peptidiques. Cependant, l’autoprotéolyse des enzymes peut augmenter la complexité des échantillons, rendant ainsi ardue l’obtention de pics résolus suite à l’apparition de pics non-désirés dans la carte peptidique. Par conséquent, nous avons utilisé la réticulation des enzymes protéolytiques par réaction avec le glutaraldéhyde (GA) donnant une enzyme insoluble afin de réduire l’autoprotéolyse. L’immobilisation de la chymotrypsine par GA a été effectuée selon une méthode rapportée précédemment par le groupe Waldron. L’électrophorèse capillaire (CE) couplée à l’absorption UV-visible a été utilisée pour la séparation et la détection de peptides et pour obtenir ainsi une cartographie peptidique. Deux tampons différents ont été évalués afin d’obtenir les meilleures conditions pour la digestion de substrats protéiques par la chymotrypsine libre (soluble) ou la GAchymotrypsine et l’analyse par CE. Les cartes des peptides autoprotéolytiques ont été comparées entre les deux formats de chymotrypsine. Afin d’améliorer la cartographie peptidique, nous avons évalué trois méthodes de conditionnement du capillaire CE et deux méthodes pour stopper la digestion. Le bicarbonate d’ammonium s’est avéré être le tampon optimal pour la digestion en solution et l’utilisation d’un bain d’acétone et de glace sèche s’est avérée être la méthode optimale pour stopper la digestion. Une solution de SDS, 25 mM, dans l’étape de rinçage a été utilisée après chaque analyse CE et a permis d’améliorer la résolution des cartes peptidiques. La comparaison entre l’autoprotéolyse de la chymotrypsine libre et de celle immobilisé par GA a été effectuée par des tests utilisant une gamme de six différentes combinaisons de conditions afin d’évaluer le temps (30 et 240 min) et la température de digestion (4, 24 et 37°C). Dans ces conditions, nos résultats ont confirmé que le GA-chymotrypsine réduit l’autoprotéolyse par rapport à l’enzyme libre. La digestion (à 37°C/240 min) de deux substrats modèles par la chymotrypsine libre et immobilisée en fonction de la température de dénaturation du substrat a été étudiée. iii Avant la digestion, les substrats (l’albumine de sérum bovine, BSA, et la myoglobine) ont été dénaturés par chauffage pendant 45 min à trois températures différentes (60, 75 et 90°C). Les résultats ont démontré que la dénaturation par chauffage du BSA et de la myoglobine n’a pas amélioré la cartographie peptidique pour la GA-chymotrypsine, tandis que la digestion de ceux-ci en présence de la chymotrypsine libre a amélioré de façon quantifiable à des températures élevées. Ainsi, le chauffage du substrat à 90°C avec l’enzyme soluble facilite le dépliement partiel du substrat et sa digestion limitée, ce qui a été mieux pour la myoglobine que pour la BSA.

Le sens du goût chez l'aveugle congénital

Thèse réalisée en collaboration avec le Département de neurosciences et pharmacologie de l'Université de Copenhague, Danemark.

Nouvelles stratégies pour l’analyse des cyanotoxines par spectrométrie de masse

Les cyanobactéries ont une place très importante dans les écosystèmes aquatiques et un nombre important d’espèces considéré comme nuisible de par leur production de métabolites toxiques. Ces cyanotoxines possèdent des propriétés très variées et ont souvent été associées à des épisodes d’empoisonnement. L’augmentation des épisodes d’efflorescence d’origine cyanobactériennes et le potentiel qu’ils augmentent avec les changements climatiques a renchéri l’intérêt de l’étude des cyanobactéries et de leurs toxines. Considérant la complexité chimique des cyanotoxines, le développement de méthodes de détection simples, sensibles et rapides est toujours considéré comme étant un défi analytique. Considérant ces défis, le développement de nouvelles approches analytiques pour la détection de cyanotoxines dans l’eau et les poissons ayant été contaminés par des efflorescences cyanobactériennes nuisibles a été proposé. Une première approche consiste en l’utilisation d’une extraction sur phase solide en ligne couplée à une chromatographie liquide et à une détection en spectrométrie de masse en tandem (SPE-LC-MS/MS) permettant l’analyse de six analogues de microcystines (MC), de l’anatoxine (ANA-a) et de la cylindrospermopsine (CYN). La méthode permet une analyse simple et rapide et ainsi que la séparation chromatographique d’ANA-a et de son interférence isobare, la phénylalanine. Les limites de détection obtenues se trouvaient entre 0,01 et 0,02 μg L-1 et des concentrations retrouvées dans des eaux de lacs du Québec se trouvaient entre 0,024 et 36 μg L-1. Une deuxième méthode a permis l’analyse du b-N-méthylamino-L-alanine (BMAA), d’ANA-a, de CYN et de la saxitoxine (STX) dans les eaux de lac contaminés. L’analyse de deux isomères de conformation du BMAA a été effectuée afin d’améliorer la sélectivité de la détection. L’utilisation d’une SPE manuelle permet la purification et préconcentration des échantillons et une dérivatisation à base de chlorure de dansyle permet une chromatographie simplifiée. L’analyse effectuée par LC couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS) et des limites de détections ont été obtenues entre 0,007 et 0,01 µg L-1. Des échantillons réels ont été analysés avec des concentrations entre 0,01 et 0,3 µg L-1 permettant ainsi la confirmation de la présence du BMAA dans les efflorescences de cyanobactéries au Québec. Un deuxième volet du projet consiste en l’utilisation d’une technologie d’introduction d’échantillon permettant des analyses ultra-rapides (< 15 secondes/échantillons) sans étape chromatographique, la désorption thermique à diode laser (LDTD) couplée à l’ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) et à la spectrométrie de masse (MS). Un premier projet consiste en l’analyse des MC totales par l’intermédiaire d’une oxydation de Lemieux permettant un bris de la molécule et obtenant une fraction commune aux multiples congénères existants des MC. Cette fraction, le MMPB, est analysée, après une extraction liquide-liquide, par LDTD-APCI-MS/MS. Une limite de détection de 0,2 µg L-1 a été obtenue et des concentrations entre 1 et 425 µg L-1 ont été trouvées dans des échantillons d’eau de lac contaminés du Québec. De plus, une analyse en parallèle avec des étalons pour divers congénères des MC a permis de suggérer la possible présence de congénères ou d’isomères non détectés. Un deuxième projet consiste en l’analyse directe d’ANA-a par LDTD-APCI-HRMS pour résoudre son interférence isobare, la phénylalanine, grâce à la détection à haute résolution. La LDTD n’offre pas de séparation chromatographique et l’utilisation de la HRMS permet de distinguer les signaux d’ANA-a de ceux de la phénylalanine. Une limite de détection de 0,2 µg L-1 a été obtenue et la méthode a été appliquée sur des échantillons réels d’eau avec un échantillon positif en ANA-a avec une concentration de 0,21 µg L-1. Finalement, à l’aide de la LDTD-APCI-HRMS, l’analyse des MC totales a été adaptée pour la chair de poisson afin de déterminer la fraction libre et liée des MC et comparer les résultats avec des analyses conventionnelles. L’utilisation d’une digestion par hydroxyde de sodium précédant l’oxydation de Lemieux suivi d’une purification par SPE a permis d’obtenir une limite de détection de 2,7 µg kg-1. Des échantillons de poissons contaminés ont été analysés, on a retrouvé des concentrations en MC totales de 2,9 et 13,2 µg kg-1 comparativement aux analyses usuelles qui avaient démontré un seul échantillon positif à 2 µg kg-1, indiquant la possible présence de MC non détectés en utilisant les méthodes conventionnelles.

L’étude des stratégies de séparations préparatrices de protéines par électrophorèse capillaire

La protéomique est un sujet d'intérêt puisque l'étude des fonctions et des structures de protéines est essentiel à la compréhension du fonctionnement d'un organisme donné. Ce projet se situe dans la catégorie des études structurales, ou plus précisément, la séquence primaire en acides aminés pour l’identification d’une protéine. La détermination des protéines commence par l'extraction d'un mélange protéique issu d'un tissu ou d'un fluide biologique pouvant contenir plus de 1000 protéines différentes. Ensuite, des techniques analytiques comme l’électrophorèse en gel polyacrylamide en deux dimensions (2D-SDS-PAGE), qui visent à séparer ce mélange en fonction du point isoélectrique et de la masse molaire des protéines, sont utilisées pour isoler les protéines et pour permettre leur identification par chromatographie liquide and spectrométrie de masse (MS), typiquement. Ce projet s'inspire de ce processus et propose que l'étape de fractionnement de l'extrait protéique avec la 2D-SDS-PAGE soit remplacé ou supporté par de multiples fractionnements en parallèle par électrophorèse capillaire (CE) quasi-multidimensionnelle. Les fractions obtenues, contenant une protéine seule ou un mélange de protéines moins complexe que l’extrait du départ, pourraient ensuite être soumises à des identifications de protéines par cartographie peptidique et cartographie protéique à l’aide des techniques de séparations analytiques et de la MS. Pour obtenir la carte peptidique d'un échantillon, il est nécessaire de procéder à la protéolyse enzymatique ou chimique des protéines purifiées et de séparer les fragments peptidiques issus de cette digestion. Les cartes peptidiques ainsi générées peuvent ensuite être comparées à des échantillons témoins ou les masses exactes des peptides enzymatiques sont soumises à des moteurs de recherche comme MASCOT™, ce qui permet l’identification des protéines en interrogeant les bases de données génomiques. Les avantages exploitables de la CE, par rapport à la 2D-SDS-PAGE, sont sa haute efficacité de séparation, sa rapidité d'analyse et sa facilité d'automatisation. L’un des défis à surmonter est la faible quantité de masse de protéines disponible après analyses en CE, due partiellement à l'adsorption des protéines sur la paroi du capillaire, mais due majoritairement au faible volume d'échantillon en CE. Pour augmenter ce volume, un capillaire de 75 µm était utilisé. Aussi, le volume de la fraction collectée était diminué de 1000 à 100 µL et les fractions étaient accumulées 10 fois; c’est-à-dire que 10 produits de séparations étaient contenu dans chaque fraction. D'un autre côté, l'adsorption de protéines se traduit par la variation de l'aire d'un pic et du temps de migration d'une protéine donnée ce qui influence la reproductibilité de la séparation, un aspect très important puisque 10 séparations cumulatives sont nécessaires pour la collecte de fractions. De nombreuses approches existent pour diminuer ce problème (e.g. les extrêmes de pH de l’électrolyte de fond, les revêtements dynamique ou permanent du capillaire, etc.), mais dans ce mémoire, les études de revêtement portaient sur le bromure de N,N-didodecyl-N,N-dimethylammonium (DDAB), un surfactant qui forme un revêtement semi-permanent sur la paroi du capillaire. La grande majorité du mémoire visait à obtenir une séparation reproductible d'un mélange protéique standard préparé en laboratoire (contenant l’albumine de sérum de bovin, l'anhydrase carbonique, l’α-lactalbumine et la β-lactoglobulin) par CE avec le revêtement DDAB. Les études portées sur le revêtement montraient qu'il était nécessaire de régénérer le revêtement entre chaque injection du mélange de protéines dans les conditions étudiées : la collecte de 5 fractions de 6 min chacune à travers une séparation de 30 min, suivant le processus de régénération du DDAB, et tout ça répété 10 fois. Cependant, l’analyse en CE-UV et en HPLC-MS des fractions collectées ne montraient pas les protéines attendues puisqu'elles semblaient être en-dessous de la limite de détection. De plus, une analyse en MS montrait que le DDAB s’accumule dans les fractions collectées dû à sa désorption de la paroi du capillaire. Pour confirmer que les efforts pour recueillir une quantité de masse de protéine étaient suffisants, la méthode de CE avec détection par fluorescence induite par laser (CE-LIF) était utilisée pour séparer et collecter la protéine, albumine marquée de fluorescéine isothiocyanate (FITC), sans l'utilisation du revêtement DDAB. Ces analyses montraient que l'albumine-FITC était, en fait, présente dans la fraction collecté. La cartographie peptidique a été ensuite réalisée avec succès en employant l’enzyme chymotrypsine pour la digestion et CE-LIF pour obtenir la carte peptidique.