16 resultados para Clone
em Université de Montréal, Canada
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Un rsum est galement disponible en anglais.
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Article publi avec l'autorisation de la Chambre des notaires du Qubec.
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Salmonella enterica srovar Typhi (Typhi) est une bactrie pathogne spcifique lhomme. Typhi est lagent tiologique de la fivre typhode chez lhumain, causant plus de 16 millions de nouveaux cas par anne et plus de 600 000 morts. Il a t dmontr que pour causer une infection systmique, Salmonella doit ncessairement survivre dans les macrophages de l'hte. Paradoxalement, S. enterica srovar Typhimurium, trs apparent Typhi (prs de 90 % dhomologie), na pas la capacit de se dissminer dans lorganisme humain et peut infecter plusieurs espces animales. Nous avons antrieurement identifi 36 gnes uniques Typhi (absents chez Typhimurium) situs sur 15 rgions diffrentes et exprims slectivement lors de linfection de macrophages humains. Ainsi, lune de ces rgions a suscit notre attention, soit la rgion sty4217-4222 et plus particulirement le produit du gne sty4221, une aminotransfrase hypothtique. Ce dernier gne est dintrt d lhomologie quil dtient avec une hmolysine connue (Hly) produite par Treponema denticola, possdant elle-mme une activit daminotransfrase. Chez T. denticola, Hly dgrade la cystine et produit du H2S qui est toxique pour lhte. Notre hypothse est que la spcificit dhte et la capacit de produire une infection systmique de Typhi sont dues lexpression de gnes qui ne se retrouvent pas chez dautres salmonelles. Le but de cette tude tait donc de caractriser le gne sty4221 quant son activit hmolytique, cytotoxique et tenter de dterminer son rle dans la virulence de cette bactrie. Le gne sty4221 a t clon sous le contrle dun promoteur inductible larabinose et exprim par E. coli. Lactivit hmolytique du clone a t dtermine par simple observation sur glose sang. Ce clone a galement permis dobserver leffet cytotoxique du surnageant de culture sur diffrentes lignes cellulaires, par quantification de la relche de LDH. Le gne sty4221 a t mut chez la souche sauvage de Typhi, ISP1820, limplication pathognique du gne a ainsi pu tre tudie. Des tests de phagocytose, dinvasion et de survie dans des macrophages humains ont t effectus, ainsi que des tests dadhsion et dinvasion sur des cellules HeLa. Par ailleurs, une premire tentative de purification de la protine a t entreprise. En somme, nous savons maintenant que STY4221 a des proprits hmolytiques, augmentes par la prsence de cystine. De plus, STY4221 a un effet cytotoxique sur les macrophages THP-I, mais aucun effet sur les HeLa. Or, sty4221 ne semble pas impliqu dans les tapes dadhsion, dinvasion, de phagocytose ou de survie. La caractrisation de sty4221 permettra sans doute dapprofondir nos connaissances sur les toxines trouves uniquement chez Typhi.
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Ladnovirus possde plusieurs caractristiques faisant de ce virus un candidat de choix pour la construction de vecteurs utiles dans les tudes de gnomique fonctionnelle. Dans la majorit de ces applications, on a recours un vecteur adnoviral de premire gnration dlt de sa rgion E1. Lutilisation de vecteurs adnoviraux comprend deux maillons faibles : la construction du vecteur et la production subsquente de ce dernier. Le dveloppement de mthodes alternatives est donc ncessaire pour renforcer ces deux maillons, permettant ainsi une utilisation tendue de ces vecteurs. Ce dveloppement va sarticuler sur deux axes : lingnierie du vecteur de transfert pour la construction de ladnovirus recombinant et lingnierie dune ligne cellulaire pour la production du vecteur. En utilisant un vecteur de transfert adnoviral co-exprimant, partir dun promoteur rgulable la ttracycline, la protase de ladnovirus et une protine de fluorescence verte (GFP) par lintermdiaire dun site dentre ribosomal interne (IRES), notre groupe a tabli que la slection positive, via lexpression ectopique de la protase, est un processus efficace pour la cration de librairie dadnovirus recombinants. Par contre, la diversit atteinte dans ce premier systme est relativement faible, environ 1 adnovirus recombinant par 1 000 cellules. Le travail effectu dans le cadre de cette thse vise construire un nouveau transfert de vecteur dans lequel lexpression de la protase sera indpendante de celle du transgne permettant ainsi doptimiser lexpression de la protase. Ce travail doptimisation a permis de rduire le phnomne de transcomplmentation du virus parental ce qui a fait grimper la diversit 1 virus recombinant par 75 cellules. Ce systme a t mis lpreuve en gnrerant une librairie adnovirale antisens dirige contre la GFP. La diversit de cette librairie a t suffisante pour slectionner un antisens rduisant de 75% lexpression de la GFP. Lamplification de ce vecteur adnoviral de premire gnration doit se faire dans une ligne cellulaire exprimant la rgion E1 telle que les cellules 293. Par contre, un adnovirus de premire gnration se rpliquant dans les cellules 293 peut changer, par recombinaison homologue, son transgne avec la rgion E1 de la cellule crant ainsi un adnovirus recombinant rplicatif (RCA), compromettant ainsi la puret des stocks. Notre groupe a dj brevet une ligne cellulaire A549 (BMAdE1) exprimant la rgion E1, mais qui ne peut pas recombiner avec le transgne du virus. Par contre, le niveau de rplication de ladnovirus dans les BMAdE1 est sous-optimal, peine 15-30% du niveau obtenu dans les cellules 293. Le travail fait dans le cadre de cette thse a permis de mettre en vidence quune expression insuffisante dE1B-55K tait responsable de la mauvaise rplication du virus dans les BMAdE1. Nous avons produit de nouveaux clones partir de la ligne parentale via une transduction avec un vecteur lentiviral exprimant E1B-55K. Nous avons confirm que certains clones exprimaient une plus grande quantit dE1B-55K et que ces clones amplifiaient de manire plus efficace un vecteur adnoviral de premire gnration. Ce clone a par la suite t adapt la culture en suspension sans srum.
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Introduction: Les efforts globaux pour contrler la tuberculose sont prsentement restreints par la prvalence croissante du VIH/SIDA. Quoique les closions de la tuberculose multi rsistante (TB-MDR) soient frquemment rapportes parmi les populations atteintes du SIDA, le lien entre VIH/SIDA et le dveloppement de rsistance nest pas clair. Objectifs: Cette recherche visait : (1) dvelopper une base de connaissances concernant les facteurs associs des closions de la TB-MDR parmi les patients atteints du VIH/SIDA; (2) utiliser ce cadre de connaissances pour accrotre des mesures prliminaires pour mieux contrler la tuberculose pulmonaire chez les patients atteints du VIH/SIDA; et (3) afin damliorer lapplication des ces mesures, affiner les techniques bactriologiques existantes pour Mycobacterium tuberculosis. Mthodologie: Quatre tudes ont t ralises : (1) Une tude longitudinale pour identifier les facteurs associs avec une closion de la TB-MDR parmi les patients atteints du SIDA qui ont reu le traitement directement supervis de courte dure (DOTS) pour la tuberculose pulmonaire au Lima et au Prou entre 1999 et 2005; (2) Une tude transversale pour dcrire diffrentes tapes de lhistoire naturelle de la tuberculose, la prvalence et les facteurs associs avec la mycobactrie quon retrouve dans les selles des patients atteints du SIDA; (3) Un projet pilote pour dvelopper des stratgies de dpistage pour la tuberculose pulmonaire parmi les patients hospitaliss atteints du SIDA, en utilisant lessaie Microscopic Observation Drug Susceptibility (MODS); et (4) Une tude laboratoire pour identifier les meilleures concentrations critiques pour dtecter les souches MDR de M. tuberculosis en utilisant lessaie MODS. Rsultats : tude 1 dmontre quune pidmie de TB-MDR parmi les patients atteints du SIDA qui ont reu DOTS pour la tuberculose pulmonaire ait t cause par la superinfection du clone de M. tuberculosis plutt que le dveloppement de la rsistance secondaire. Bien que ce clone ait t plus commun parmi la cohorte de patients atteints du SIDA, il navait aucune diffrence de risque pour superinfection entre les patients avec ou sans SIDA. Ces rsultats suggrent quun autre facteur, possiblement associ la diarrhe, peu contribuer la prvalence leve de ce clone chez les patients atteints du SIDA. tude 2 suggre que chez la plupart des patients atteints du SIDA il a t retrouv une mycobactrie dans leurs selles alors quils taient en phase terminale au niveau de la tuberculose pulmonaire. Or, les patients atteints du SIDA ayant t hospitaliss pendant les deux dernires annes pour une autre condition mdicale sont moins risque de se retrouver avec une mycobactrie dans leurs selles. tude 3 confirme que la tuberculose pulmonaire a t commune tous les patients hospitaliss atteints du SIDA, mais diagnostique incorrectement en utilisant les critres cliniques prsentement recommands pour la tuberculose. Or, lessaie MODS a dtect pour la plupart de ces cas. De plus, MODS a t galement efficace quand la mthode a t dirige aux patients souponns davoir la tuberculose, cause de leurs symptmes. tude 4 dmontre les difficults de dtecter les souches de M. tuberculosis avec une faible rsistance contre ethambutol et streptomycine en utilisant lessai MODS avec les concentrations de drogue prsentement recommandes pour un milieu de culture. Cependant, lutilit diagnostique de MODS peut tre amliore ; modifier les concentrations critiques et utiliser deux plaques et non une, pour des tests rguliers. Conclusion: Nos tudes soulvent la ncessit damliorer le diagnostic et le traitement de la tuberculose parmi les patients atteints du SIDA, en particulier ceux qui vivent dans des rgions avec moins de ressources. Par ailleurs, nos rsultats font ressortir les effets indirects que les soins de sant ont sur les patients infects par le VIH et quils peuvent avoir sur le dveloppement de la tuberculose.
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La technique de clonage par transfert nuclaire de cellules somatiques (SCNT) prsente une page importante dans les annales scientifiques, mais son application pratique demeure incertaine d son faible taux de succs. Les anomalies placentaires et de dveloppement ftal se traduisent par des pertes importantes de gestation et des mortalits nonatales. Dans un premier temps, la prsente tude a caractris les changements morphologiques des membranes ftales durant la gestation clone en les comparant des gestations contrles obtenues partir de linsmination artificielle. Les diffrentes anomalies morphologiques des placentomes telles que ldme chorioallantoique, la prsence de zones hyperchoiques et irrgulires dans la membrane amniotique et la prsence de cellules inflammatoires dgnres compromettent le dveloppement ftal normal de la gestation clone. Lexamen ultrasonographique reprsente une technique diagnostique importante pour faire le suivi dune gestation et de caractriser les changements placentaires dans le cadre dvaluation globale du bien-tre ftal. Le profil hormonal de trois strodes (progestrone (P4), estrone sulfate (E1S), et stradiol (E2)) et de la protine B spcifique de gestation (PSPB) dans le srum des vaches porteuses de clones SCNT a t dtermin et associ aux anomalies de gestations clones. Une diminution de la P4 srique au jour 80, une lvation du niveau de la concentration de la PSPB au jour 150, et une augmentation de la concentration dE2 srique durant le deuxime et troisime tiers de la gestation clone concident avec les anomalies de gestation dj reportes. Ces changements du profil hormonal associs aux anomalies phnotypiques du placenta compromettent le droulement normal de la gestation clone et gnent le dveloppement et le bien-tre ftal. Sur la base des observations faites sur le placenta de gestation clone, le mcanisme molculaire pouvant expliquer la disparition de lpithlium du placenta (linterface entre le tissue maternel et le placenta) a t tudi. Ltude a identifi des changements dans lexpression de deux protines dadhrence (E-cadhrin et -catenin) de cellules pithliales pouvant tre associes aux anomalies du placenta chez les gestations clones. Le tissu de cotyldons provenant de gestations clones et contrles a t analys par Western blot, RT-PCR quantitatif, et par immunohistochimie. Les rsultats prsentaient une diminution significative (p<0.05) de lexpression des dites protines dans les cellules trophoblastiques chez les gestations clones. Le RT-PCR quantitatif dmontrait que les gnes CCND1, CLDN1 et MSX1 cibls par la voie de signalisation de la Wnt/-catenin taient significativement sous exprims. La diminution de lexpression des protines E-cadherin et -catenin avec une rduction de lactivation de la protine -catenin durant le priode dattachement de lembryon peut potentiellement expliquer labsence totale ou partielle de lattachement des membranes ftales au tissu maternel et ventuellement, linsuffisance placentaire caractristique des gestations clones chez la vache. La caractrisation morphologique et fonctionnelle du placenta durant les gestations clones haut risque est essentielle pour valuer le statut de la gestation. Les rsultats de la prsente tude permettront de prdire le dveloppement et le bien-tre ftal de faon critique travers un protocole standardis et permettre des interventions mdicales pour amliorer le taux de succs des gestations clones chez les bovins.
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La dcouverte du systme des peptides natriurtiques (NP), au dbut des annes 80, fut une dcouverte majeure qui rvla le rle endocrinien du cur. Les connaissances sur la relaxation vasculaire, la diurse et la natriurse provoques par ce systme ont volu vers un niveau de complexit insouponn cette poque. Nous savons prsent que les NP sont impliqus dans plusieurs autres mcanismes dont la prolifration cellulaire, lapoptose, linhibition du systme rnine-angiotensine-aldostrone (RAAS) et le mtabolisme des adipocytes. Le mtabolisme des lipides est maintenant devenu une cible de choix dans la lutte contre lobsit. Cette condition aux proportions pandmiques est un facteur de risque majeur dans lapparition de lhypertension et du syndrome mtabolique (MetS). La comprhension des mcanismes et des dfauts de la voie des NP pourrait avoir un impact positif sur le contrle du MetS et de lhypertension. Lexpression du rcepteur des peptides natriuretiques de type 1 (NPR1/GCA) est contrle par plusieurs agents incluant son propre ligand, le peptide natriurtique de loreillette (ANP). La dcouverte dune boucle de retro-inhibition, dans les annes 90, a t un vnement majeur dans le domaine des NP. En effet, suite une stimulation lANP, le NPR1/GCA peut inhiber lactivit transcriptionnelle de son propre gne par un mcanisme dpendant du cGMP. Notre groupe a identifi un lment cis-rgulateur responsable de cette sensibilit au cGMP et mon projet consistait identifier la ou les protine(s) liant cet lment de rponse au cGMP (cGMP-RE). Nous avons identifi un clone liant le cGMP-RE en utilisant la technique du simple hybride chez la levure et une banque dADN complmentaire (ADNc) de rein humain. Ce clone provient dun ADNc de 1083-bp dont le gne est localis sur le chromosome 1 humain (1p33.36) et codant pour une protine dont la fonction tait inconnue jusquici. Nous avons nomm cette nouvelle protine GREBP en raison de sa fonction de cGMP Response Element Binding Protein. Des essais de liaison lADN ont montr que cette protine possde une affinit 18 fois plus leve pour le cGMP-RE que le contrle, tandis que des expriences de retard sur gel (EMSA) ont confirm la spcificit des interactions protine-ADN. De plus, limmuno-prcipitation de la chromatine (ChIP) a prouv que GREBP lie le cGMP-RE dans des conditions physiologiques. La liaison de GREBP au cGMP-RE inhibe lexpression du gne rapporteur lucifrase sous contrle du promoteur de npr1/gca. Linhibition de GREBP laide dARN interfrant active le promoteur de npr1/gca. Dans les cellules NCI-H295R, lANP stimule lexpression de grebp de 60% aprs seulement 3 heures et inhibe lexpression de npr1/gca de 30%. GREBP est une protine nuclaire surtout exprime dans le cur et ayant le facteur eIF3F comme partenaire. Les variations nuclotidiques du gne sont plus frquentes chez les patients hypertendus que chez des patients normotendus ou hypertendus souffrant de MetS. Nous rapportons ici lexistence dun gne spcifique lhumain qui agit comme rpresseur transcriptionnel de npr1/gca et potentiellement impliqu dans le dveloppement de lhypertension.
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La prvalence du Staphylococcus aureus rsistant la mthicilline (SARM) a augment de faon dramatique dans les dernires annes chez les patients atteints de fibrose kystique. Quoique le rle du SARM dans la pathognse de latteinte respiratoire de la fibrose kystique ne soit pas clairement dtermin, certaines tudes rcentes ont suggr une association entre la persistance du SARM et le dclin acclr de la fonction respiratoire. Cependant, limportance clinique des diverses souches qui colonisent les patients atteints de fibrose kystique na pas encore t lucide. Les objectifs de ce mmoire taient de dterminer les effets dune colonisation persistante par un SARM sur le statut clinique et respiratoire des enfants atteints de fibrose kystique. galement, nous tenions tudier les caractristiques des diffrentes souches de SARM dans cette population. Nous avons ralis une tude rtrospective en analysant les donnes cliniques ainsi que les mesures de la fonction respiratoire chez les enfants atteints de fibrose kystique suivis la Clinique de fibrose kystique du CHU Sainte-Justine entre 1996 et 2008 et ayant une colonisation persistante par un SARM. Afin de dterminer les souches qui colonisent cette population, nous avons effectu une caractrisation molculaire des isolats du SARM. Nous avons identifi 22 patients avec une colonisation persistante par un SARM. Les rsultats nont dmontr aucun changement significatif en ce qui concernait le taux de dclin de la fonction respiratoire avant ou aprs lacquisition du SARM. Cependant, la colonisation persistante par un SARM tait associe une augmentation du nombre dhospitalisations pour une exacerbation pulmonaire. La plupart de nos patients taient coloniss par le CMRSA-2, une souche pidmique au Canada. La prsente tude suggre que la souche pidmique CMRSA-2 pouvait affecter lvolution clinique des enfants atteints de fibrose kystique.
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Thse diffuse initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Universit de Montral/Centre d'dition numrique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur.
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Mmoire numris par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Universit de Montral
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Mmoire numris par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Universit de Montral
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La nature a dvelopp diverses stratgies afin dassurer le commencement de la vie dans des conditions dhomoplasmie, cest--dire des conditions telles que les cellules sont dotes du mme ADN mitochondrial. Toutefois, des nouveaux haplotypes de lacide dsoxyribonuclique mitochondrial (ADNmt) peuvent apparaitre et crotre de plusieurs faons tout au long de la dure dune vie menant lhtroplasmie. Par exemple, lhtroplasmie de lADNmt peut tre cre artificiellement par des technologies reproductives assistes, ainsi que naturellement par le processus de vieillissement. De ce fait, la thse de ce doctorat fut divise en deux principaux objectifs. Le premier tant celui danalyser les changements survenus dans lhtroplasmie de lADNmt produit par le transfert nuclaire des cellules somatiques (SCNT) lors du dveloppement de lembryon jusquau ftus et aux tissus adultes de bovins clons. En ce qui concerne le second objectif, il sagit danalyser les changements survenus dans lhtroplasmie de lADNmt causs par le vieillissement dans une cellule somatique adulte et dans des tissus germinaux durant lovognse, ainsi quau dbut de lembryogense et dans la procdure de culture in vitro sur des souris. Dans la premire srie dexpriences sur des bovins, des fibroblastes ftaux transportant une mutation dADNmt (insertion de 66 pb) furent fusionns avec des ovocytes receveurs transportant lADNmt du type sauvage. La prsence dADNmt venant de la cellule donneuse a t analyse diffrents stades de dveloppement, soit sur des embryons gs de 17 jours (n=17), des ftus gs de 40 jours (n=3), des ftus gs de 60 jours (n=3), un ftus g de 240 jours et 3 clones post-nataux gs de 18 24 mois. Chaque individu sest avr tre htroplasmique et 99 % (103/104) des chantillons de tissus analyss taient galement htroplasmiques. Cependant, lovaire venant du ftus de 240 jours fut le seul tre homoplasmique pour lADNmt de lovocyte receveur. Dans la plupart des chantillons analyss (95,2 %, soit 99/104) la moyenne dhtroplasmie tait de 1,46 %. Par contre, un ftus g de 40 jours a prsent un niveau lev dhtroplasmie (20,9 %), indiquant ainsi que des vnements rares daugmentation de lADNmt des cellules donneuses peuvent survenir. tant donn que la majorit des clones SCNT montrait de lhtroplasmie de lADNmt des proportions comparables celles des cellules donneuses au moment de la reconstruction de lembryon, on a pu conclure que lhtroplasmie produite par des techniques de transfert nuclaire utilisant des cellules somatiques est due une sgrgation neutre de lADNmt. Dans la seconde srie dexpriences sur des souris, des femelles de diffrents ges, c..d. jeunes (0 8 mois), moyennes (8 16 mois) et vieilles (16 24 mois), ont t synchronises (gonadotrophines) et sacrifies dans le but dobtenir des ovocytes au stade de vsicule germinal, et des ovocytes au stade mtaphase-II produits in vivo et in vitro. De plus, des embryons in vivo et in vitro au stade de deux-cellules et des embryons au stade de blastocystes ont t obtenus de femelles jeunes. Diffrents tissus somatiques, venant de femelles des trois stades dge ont t obtenus : cerveau, foie, muscle et du cumulus ovocytaire. De plus, leffet du vieillissement a t mesur selon la fertilit de la femelle. En effet, les effets sur lhtroplasmie du vieillissement, du stade de dveloppement et de la culture in vitro ont t mesurs dans des ovocytes et dans des embryons. Les effets du vieillissement sur les mitochondries ont t mesurs par rapport au nombre total de copies de lADNmt, au pourcentage des dltions communes et sur lexpression de trois gnes : Ndufs4, Mt-nd2 and Mt-nd4. Il a t possible dobserver que la fertilit des femelles dans la colonie de souris diminuait avec lge. En fait, le vieillissement affectait lADNmt dans les tissus somatiques, cependant il navait pas deffet sur le cumulus, les ovocytes et les embryons. Le nombre de dltions de lADNmt augmentait pendant la reprise de la miose et celui-ci diminuait au dbut du dveloppement embryonnaire. La culture in vitro naffectait pas la quantit dADNmt dans la plupart des tissus germinaux. Puisque nous navons pas trouv deffet de lge dans la majorit des paramtres mitochondriaux analyss dans les ovocytes et les embryons, il est suggr que la dltion commune de lADNmt dans les tissus germinaux est davantage relie au statut cellulaire de la production dnergie quau processus de vieillissement. Deux sources diffrentes de mutations de lADNmt produites dans les ovocytes normaux ou reconstitus ont produit diffrents rsultats dhtroplasmie au dbut de lembryognse. Chez les bovins, lhtroplasmie artificielle impliquant une petite insertion (66 pb) dans la rgion non codante (D-loop) de lADNmt a t vraisemblablement non nocive pour lembryon, tolrant la persistance de lADNmt tranger pendant les diffrents stades du dveloppement des clones. Chez les souris, lhtroplasmie naturelle produite par une grande dltion (4974 pb dltion commune) dans la rgion codante de lADNmt a t vraisemblablement nocive pour lembryon et par consquent limine pour assurer lhomoplasmie au dbut du dveloppement embryonnaire.
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La replication et lassemblage du virus de lhepatite C (VHC) sont regules finement dans le temps et lespace par les interactions proteiques entre le virus avec lhote. La comprehension de la biologie du virus ainsi que sa pathogenicite passe par les connaissances relatives aux interactions virus/hote. Afin didentifier ces interactions, nous avons exploite une approche dimmunoprecipitation (IP) couplee a une detection par spectrometrie de masse (MS), pour ensuite evaluer le role des proteines identifiees dans le cycle viral par une technique de silencage genique. Les proteines virales Core, NS2, NS3/4A, NS4B, NS5A et NS5B ont ete exprimees individuellement dans les cellules humaines 293T et immunoprecipitees afin disoler des complexes proteiques qui ont ete soumis a lanalyse MS. Ainsi, 98 proteines de lhote ont ete identifiees avec un enrichissement significatif et illustrant une specificite dinteraction. Lenrichissement de proteines connues dans la litterature a demontre la force de lapproche, ainsi que la validation de 6 nouvelles interactions virus/hote. Enfin, le role de ces interactants sur la replication virale a ete evalue dans un criblage genomique par ARN interferant (ARNi). Deux systemes rapporteurs de la replication virale ont ete utilises : le systeme de replicon sous-genomique (Huh7-Con1-Fluc) et le systeme infectieux (J6/JFH-1/p7Rluc2a), ainsi quun essai de toxicite cellulaire (Alamar Blue). Parmi les proteines de lhote interagissant avec le VHC, 28 proteines ont demontre un effet significatif sans effet de toxicite cellulaire, suggerant fortement un role dans la replication du VHC. Globalement, letude a mene a lidentification de nouvelles interactions virus/hote et lidentification de nouvelles cibles therapeutiques potentielles.
Derivation de cellules souches pluripotentes induites autologues a partir du clonage somatique equin
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Le recours aux cellules souches pour ameliorer la reparation et guerison des blessures et maladies musculosquelettiques chez le cheval est de plus en plus frequent. Les developpements recents dans la reprogrammation cellulaire ont permis le developpement de nouvelles sources de cellules souches pour ces therapies regeneratives. Des cellules souches pluripotentes induites (iPS) autologues peuvent etre derivees de cellules adultes par la reprogrammation directe a travers l'expression induite des genes de pluripotence. Le clonage par transfert nucleaire (SCNT) suivi de la derivation de cellules souches embryonnaires (ES) permet la reprogrammation indirecte des cellules adultes. Cependant, lefficacite de ces deux methodes pour la derivation de cellules pluripotentes genetiquement stables est faible. Nous avons donc combine les techniques SCNT et iPS dans le but de developper un protocole efficace de derivation de cellules iPS autologues a partir de fibroblastes de la peau equine. Quatre facteurs de reprogrammation ont ete introduits dans les cellules fibroblastes de ftus clones (ntFF) ainsi que les cellules ES provenant dembryons clones (ntES) pour induire leur reprogrammation en cellules iPS autologues. Les cellules ntFF-iPS et ntES-iPS ont des capacites proliferatives avancees et expriment des marqueurs de pluripotence importants. Par contre, les cellules ntES ont une efficacite de reprogrammation significativement superieure aux cellules nt-FF et forment des colonies trois fois plus rapidement. Contrairement aux cellules ntES, les cellules ntES-iPS demontrent une augmentation de lexpression des marqueurs de pluripotence et survivent a la culture cellulaire prolongee. Les resultats presentes dans ce memoire attestent que lutilisation de la reprogrammation secondaire de cellules FF et ES clonees permet la production de cellules souches pluripotentes autologues stables chez le cheval.
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Les cellules souches ont attir lattention du public ces dernires annes, grce non-seulement leur utilisation comme thrapies visant sattaquer certains types de cancers, mais aussi en relation avec leur potentiel dans le domaine de la mdecine regnrative. Il est tabli que le destin cellulaire des cellules souches embryonnaires (ESC) est rgul de faon intensive par un groupe de facteur cls agissant sur leur pluripotence. Il est nanmoins envisageable que certains dterminants influenant lauto-renouvellement et la diffrenciation de ces cellules soient toujours inconnus. Afin de tester cette hypothse, nous avons gnr, en utilisant une mthode par infections virales, une collection de ESC contenant des dltions chromosomales chevauchantes que nous avons baptise DelES (Deletion in ES cells). Cette librairie contient plus de 1000 clones indpendants dont les rgions dltes couvrent environ 25% du gnome murin. laide de cette ressource, nous avons conduit un criblage de formation de corps embryodes (EB), dmontrant que plusieurs clones dlts avaient un phnotype de diffrenciation anormal. Nos tudes de complmentation sur un groupe de clones ont par la suite permis lidentification de Rps14 - un gne codant pour une protine ribosomale (RP) comme tant haploinsuffisant pour la formation de EB. Dans un deuxime temps, lanalyse approfondie des rsultats de notre crible a permis didentifier un groupe de gnes codants pour des RP qui semblent essentiels pour la diffrenciation des ESC, mais dispensables pour leur auto-renouvellement. De manire intressante, les phnotypes anormaux de formation en EB les plus marqus sont associs des dltions de RP qui se retrouvent au site de sortie des ARN messagers (ARNm) du ribosome, soit Rps5, Rps14 et Rps28. tonnament, alors quun dbalancement des RP conduit gnralement une rponse de type p53, lhaploinsuffisance de ces trois gnes ne peut tre renverse par une simple rduction des niveaux dexpression de ce gne suppresseur de tumeurs. Finalement, nos tudes de profilage polysomal et de squenage haut-dbit montrent une signature spcifique de gnes lis au msoderme chez un clone htrozygote pour Rps5, suggrant ainsi une explication au phnotype de diffrenciation p53-indpendant identifi chez ces ESC. Nos travaux rapportent donc la cration dune ressource intressante de gnomique fonctionnelle qui a permis de mettre jour le rle essentiel que jouent les RP dans le processus de formation de EB. Nos rsultats permettent aussi de documenter une rponse p53-indpendante suite un dbalancement de RP dans un contexte opposant lauto-renouvellement et la diffrenciation des ESC.
