2D, 3D and 4D active compound delivery in tissue engineering and regenerative medicine

Recent advances in tissue engineering and regenerative medicine have shown that controlling cells microenvironment during growth is a key element to the development of successful therapeutic system. To achieve such control, researchers have first proposed the use of polymeric scaffolds that were able to support cellular growth and, to a certain extent, favor cell organization and tissue structure. With nowadays availability of a large pool of stem cell lines, such approach has appeared to be rather limited since it does not offer the fine control of the cell micro-environment in space and time (4D). Therefore, researchers are currently focusing their efforts on developing strategies that include active compound delivery systems in order to add a fourth dimension to the design of 3D scaffolds. This review will focus on recent concepts and applications of 2D and 3D techniques that have been used to control the load and release of active compounds used to promote cell differentiation and proliferation in or out of a scaffold. We will first present recent advances in the design of 2D polymeric scaffolds and the different techniques that have been used to deposit molecular cues and cells in a controlled fashion. We will continue presenting the recent advances made in the design of 3D scaffolds based on hydrogels as well as polymeric fibers and we will finish by presenting some of the research avenues that are still to be explored.

Regenerative potential of corneal endothelium from patients with fuchs endothelial corneal dystrophy

La dystrophie cornéenne endothéliale de Fuchs (FECD, pour l’abréviation du terme anglais « Fuchs endothelial corneal dystrophy ») est une maladie de l'endothélium cornéen. Sa pathogenèse est mal connue. Aucun traitement médical n’est efficace. Le seul traitement existant est chirurgical et consiste dans le remplacement de l’endothélium pathologique par un endothélium sain provenant de cornées de la Banque des yeux. Le traitement chirurgical, en revanche, comporte 10% de rejet immunologique. Des modèles expérimentaux sont donc nécessaires afin de mieux comprendre cette maladie ainsi que pour le développement de traitements alternatifs. Le but général de cette thèse est de développer un modèle expérimental de la FECD en utilisant le génie tissulaire. Ceci a été réalisé en trois étapes. 1) Tout d'abord, l'endothélium cornéen a été reconstruit par génie tissulaire en utilisant des cellules endothéliales en culture, provenant de patients atteints de FECD. Ce modèle a ensuite été caractérisé in vitro. Brièvement, les cellules endothéliales cornéennes FECD ont été isolées à partir de membranes de Descemet prélevées lors de greffes de cornée. Les cellules au deuxième ou troisième passages ont ensuite été ensemencées sur une cornée humaine préalablement décellularisée. Suivant 2 semaines de culture, les endothélia cornéens reconstruits FECD (n = 6) ont été évalués à l'aide d'histologie, de microscopie électronique à transmission et d’immunomarquages de différentes protéines. Les endothélia cornéens reconstruits FECD ont formé une monocouche de cellules polygonales bien adhérées à la membrane de Descemet. Les immunomarquages ont démontré la présence des protéines importantes pour la fonctionnalité de l’endothélium cornéen telles que Na+-K+/ATPase α1 et Na+/HCO3-, ainsi qu’une expression faible et uniforme de la protéine clusterine. 2) Deux techniques chirurgicales (DSAEK ; pour « Descemet stripping automated endothelial keratoplasty » et la kératoplastie pénétrante) ont été comparées pour la transplantation cornéenne dans le modèle animal félin. Les paramètres comparés incluaient les défis chirurgicaux et les résultats cliniques. La technique « DSAEK » a été difficile à effectuer dans le modèle félin. Une formation rapide de fibrine a été observée dans tous les cas DSAEK (n = 5). 3) Finalement, la fonctionnalité in vivo des endothélia cornéens reconstruits FECD a été évaluée (n = 7). Les évaluations in vivo comprenaient la transparence, la pachymétrie et la tomographie par cohérence optique. Les évaluations post-mortem incluaient la morphométrie des cellules endothéliales, la microscopie électronique à transmission et des immunomarquage de protéines liées à la fonctionnalité. Après la transplantation, la pachymétrie a progressivement diminué et la transparence a progressivement augmenté. Sept jours après la transplantation, 6 des 7 greffes étaient claires. La microscopie électronique à transmission a montré la présence de matériel fibrillaire sous-endothélial dans toutes les greffes d’endothelia reconstruits FECD. Les endothélia reconstruits exprimaient aussi des protéines Na+-K+/ATPase et Na+/HCO3-. En résumé, cette thèse démontre que les cellules endothéliales de la cornée à un stade avancé FECD peuvent être utilisées pour reconstruire un endothélium cornéen par génie tissulaire. La kératoplastie pénétrante a été démontrée comme étant la procédure la plus appropriée pour transplanter ces tissus reconstruits dans l’œil du modèle animal félin. La restauration de l'épaisseur cornéenne et de la transparence démontrent que les greffons reconstruits FECD sont fonctionnels in vivo. Ces nouveaux modèles FECD démontrent une réhabilitation des cellules FECD, permettant d’utiliser le génie tissulaire pour reconstruire des endothelia fonctionnels à partir de cellules dystrophiques. Les applications potentielles sont nombreuses, y compris des études physiopathologiques et pharmacologiques.

Exploring TERRA (TElomeric Repeat-containing RNA) Expression and Regulation During Cell Growth in Saccharomyces cerevisiae

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The specific in vivo role of PPARgamma and its downstream signaling pathway in the pathophysiology of Osteoarthritis

L'arthrose est une maladie articulaire dégénérative, avec une pathogenèse inconnue. Des études récentes suggèrent que l'activation du facteur de transcription du récepteur activateur de la prolifération des peroxysomes (PPAR) gamma est une cible thérapeutique pour ce maladie. Les agonistes du PPARγ inhibent l'inflammation et réduisent la synthèse des produits de dégradation du cartilage in vitro et in vivo. Cependant, des études utilisant des agonistes du PPARγ n’élucident pas les effets exacts médiés par ce gène complexe. En effet, certains de ces agonistes ont la capacité de régulariser d'autres voies de signalisation indépendantes de PPARγ, ainsi entraînant des effets secondaires graves. Afin d'obtenir une efficacité thérapeutique avec potentiellement moins de problèmes de sécurité, il est donc essentiel d'élucider, in vivo, le rôle exact de PPARγ dans la physiopathologie OA. Mon projet de thèse permettra de déterminer, pour la première fois, le rôle spécifique de PPARγ in vivo dans la physiopathologie OA. Les souris utilisées pour l’étude avaient une délétion conditionnelle du gène PPARγ dans le cartilage. Ces dernières ont été générées en employant le système LoxP/Cre. Pour tester cette hypothèse, j'ai généré deux types de souris avec une délétion au PPARγ, (a) une suppression du gène PPARγ spécifiquement dans le cartilage germinale pour l'étude de l'arthrose liée au développement et à l'âge et (b) la suppression inductible du gène PPARγ spécifiquement dans le cartilage chez la souris adulte pour les études OA. L’étude précédente dans notre laboratoire, utilisant ces souris ayant une délétion au gène PPARγ germinales, montre que ces souris présentent des anomalies du développement du cartilage. J'ai également exploré si ces souris qui présentent des défauts précoces du développement ont toutes les modifications phénotypiques dans le cartilage au cours du vieillissement. Mes résultats ont montré que les souris adultes, ayant une délétion au gène PPARγ, ont présenter un phénotype de l'arthrose spontanée associée à une dégradation du cartilage, l’hypocellularité, la fibrose synoviale. Cette étude a montré que PPARγ est un régulateur essentiel pour le cartilage, et c’est le manque (l’absence) de ce dernier qui conduit à un phénotype de l'arthrose spontanée accélérée (American Journal of Pathologie). A partir de ce but de l'étude, on n’a pas pu vérifier si ces souris présentaient l’OA spontanée en raison des défauts de développement ou à la suite de la délétion du gène PPARγ. Pour contourner les défauts de développement, j'ai généré des souris ayant une délétion du gène PPARγ spécifiquement dans le cartilage inductible avec le système Col2rTACre. Ces souris ont été soumises à modèle de la chirurgie OA (DMM: déstabilisation du ménisque médial) et les résultats révèlent que les souris PPARγ KO ont une dégradation accélérée du cartilage, une hypocellularité, une fibrose synoviale et une augmentation de l'expression des marqueurs cataboliques et des marqueurs inflammatoire. La perte de PPAR dans le cartilage articulaire est un évènement critique qui initie la dégradation de cartilage dans OA. Les études récentes suggèrent que le procès d’autophagie, une forme de survie cellulaire programmée, est altéré pendant l’OA et peut contribuer vers une protection diminuée des cellules, résultant la dégradation du cartilage. J’ai donc exploré le rôle de PPARγ dans la protection des cellules en déterminant l’effet de manque de PPARγ dans le cartilage par l’expression de mTOR (régulateur négatif principal d’autophagie) et les gènes d’autophagie durant OA. Mes résultats ont montré que les souris KO PPARγ présentent également une augmentation sur l'expression de mTOR et une diminution sur l’expression des marqueurs autophagiques en comparaison avec les chondrocytes articulaires isolés des souris contrôles OA. J'ai suggéré l'hypothèse que PPARγ contrôle la régulation de la signalisation de mTOR/autophagie, et finalement la mort des chondrocytes et l’expression des facteurs cataboliques et les facteurs inflammatoire. Pour tester cette hypothèse, j’ai fait la transfection des chondrocytes arthrosiques PPARγ-KO avec le vecteur d’expression de PPARγ pour déterminer si la restauration de l'expression de PPARγ peut sauver le phénotype des cellules PPARγ-KO OA. J'ai observé que la restauration de l'expression de PPARγ dans les cellules PPARγ-KO en présence du vecteur d'expression PPARγ, a pu considérablement régulariser négativement l'expression de mTOR et mettre en règle positivement l'expression des gènes autophagiques ainsi que le sauvetage significative de l'expression du collagène de type II et l’aggrecan et de baisser de manière significative l'expression de marqueurs cataboliques critiques et des marqueurs inflammatoires. Pour prouver que l’augmentation de la signalisation de mTOR et la diminution de l'autophagie est responsable du phénotype OA accélérée observée dans les souris PPARγ KO in vivo, j'ai généré les souris doubles KO PPARγ- mTOR inductible spécifique du cartilage en utilisant le système Col2 - rtTA -Cre et soumis ces souris à DMM modèle de l'arthrose. Mes résultants démontrent que les souris avec PPARγ- mTOR doubles KO ont été significativement protégés contre les OA DMM induites associées à une protection significative contre la destruction du cartilage, la perte de protéoglycanes et la perte de chondro-cellularité par rapport aux souris témoins. Considérant que mTOR est un répresseur majeur de l'autophagie, j'ai trouvé que l'expression de deux marqueurs de l'autophagie critiques (ULK1 et LC3B) a été significativement plus élevée dans les chondrocytes extraits les souris doubles KO PPARγ-mTOR par rapport aux souris témoins. En plus, les études de sauvetage in vitro en utilisant le vecteur d'expression PPAR et les études in vivo utilisant les souris doubles KO PPARγ- mTOR montrent que PPARγ est impliqué dans la régulation de la protéine signalant de mTOR/autophagie dans le cartilage articulaire. Ces résultats contournent PPARγ et sa signalisation en aval de mTOR/autophagie en tant que cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement de l'arthrose.

Three essays on metamorphoses of social capital and associational culture in Eastern Europe

Ce triptyque d’essais présente le caractère versatile et évasif du concept moderne de capital social à plusieurs niveaux – global, national et régional, ainsi que dans le présent et dans le passé. Le premier article conteste l’hypothèse prédominante selon laquelle il y a une cohabitation entre l’engagement civique et la démocratie. Malgré sa validité au niveau général, la relation n’est pas confirmée si les catégories hétérogènes sont désagrégées. Pour les pays post-communistes de l'Europe, la relation entre le type de régime et la tendance de s'associer ressemble à celle des démocraties latines consolidées si la participation dans les associations volontaires est choisie comme mesure de la vitalité du capital social. Par conséquent, la vie civique moins intense ne prédit pas de difficultés pour la démocratie. Le deuxième article est une compilation originale de plus de 100 organisations classifiées selon les standards contemporains et une collection de présentations d'une douzaine d'organisations bulgares, les plus populaires depuis le XIXème siècle. Cette contribution importante à l’historiographie de la vie associative bulgare jusqu’à 1944 est le résultat d'un travail qui combine des entrevues avec des historiens et une recherche dans les archives. Le panoptique organisationnel sert de réfutation empirique de l’hypothèse qui attribue la faiblesse organisationnelle présente du poste-communisme à la pénurie de vie organisationnelle développée par le passé. ii Les mérites du troisième article sont doubles. Au niveau empirique on démontre que l’organisation culturelle la plus importante en Bulgarie a apparu comme une institution nationaliste imitant les organisations similaires des autres pays Européens. Elle s’est développée graduellement par une adaptation des expériences étrangères aux conditions locales. La collection des références bulgares est unique et représente le produit d’un travail méticuleux sur les documents et les entrevues. Au niveau abstrait, on confirme l’applicabilité de la théorie du transfert de la politique publique à un cas historique existant avant la théorie elle-même. Finalement, l’analyse détaillée des précurseurs du cabinet de lecture bulgare représente une contribution à la sociologie politique de l’histoire de la lecture. Mots clés: Europe de l’Est, poste-communisme, démocratie, société civile, engagement civique, organisations volontaires, troisième secteur, affiliation, transfert d'idées, apprentissage organisationnel.

Validation des effets antidiabétiques de Rhododendron groenlandicum, une plante médicinale des Cri de la Baie James, dans le modèle in vitro et in vivo : élucidation des mécanismes d’action et identification des composés actifs

Le diabète est un syndrome métabolique caractérisé par une hyperglycémie chronique due à un défaut de sécrétion de l’insuline, de l’action de l’insuline (sensibilité), ou une combinaison des deux. Plus d'un million de canadiens vivent actuellement avec le diabète. La prévalence de cette maladie est au moins trois fois plus élevée chez les autochtones que dans la population canadienne en général. Notre équipe vise à étudier les effets potentiellement antidiabétiques de certaines plantes médicinales utilisées par les Cris d'Eeyou Istchee (Baie James, Québec) où l’adhérence aux traitements médicamenteux est faible, en partie à cause de la déconnection culturelle de ces derniers. Grâce à une approche ethnobotanique, notre équipe a identifié 17 plantes médicinales utilisées par cette population pour traiter des symptômes du diabète. Parmi ces plantes, l’extrait éthanolique de Rhododendron groenlandicum (Thé du Labrador) a montré un fort potentiel antidiabétique chez plusieurs lignées cellulaires, notamment les adipocytes (3T3-L1). Cette plante induit la différenciation adipocytaire probablement par l’activation du peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR γ). Cette stimulation améliore la résistance à l’insuline et constitue un mécanisme privilégié pour une classe de médicaments antidiabétiques, les thiazolidinediones. Le but de la présente étude est de valider l’efficacité et l’innocuité de R. groenlandicum in vivo, dans un modèle animal de résistance à l’insuline, d’élucider les mécanismes par lesquels cet extrait exerce ses effets antidiabétiques et d’identifier les principes actifs responsables de son activité. L'isolation et l'identification des constituants actifs ont été réalisées à l’aide d'une approche de fractionnement guidé par bioessai; en l'occurrence, l'adipogénèse. Cette approche, réalisée dans la lignée adipocytaire 3T3-L1, a pour but de mesurer leur teneur en triglycérides. Des études in vivo ont été réalisées sur le modèle de souris DIO (diet induced obesity). L'extrait éthanolique du R. groenlandicum a été incorporé à la nourriture grasse (35% d’apport calorique lipidique) à trois doses différentes (125, 250 et 500 mg / kg) sur une période de 8 semaines. Des tissus cibles de l’insuline (foie, muscle squelettique et tissus adipeux) ont été récoltés afin de faire des analyses d’immunobuvardage de type western. La quercétine, la catéchine et l’épicatéchine ont été identifiées comme étant les composés actifs responsables de l'effet antidiabétique du R. groenlandicum. Seules la catéchine et l’épicatéchine activent l’adipogénèse uniquement à forte concentration (125-150 M), tandis que la quercétine l’inhibe. L’étude in vivo a montré que le traitement avec R. groenlandicum chez les souris DIO réduit le gain de poids de 6%, diminue l'hyperglycémie de 13% et l’insulinémie plasmatique de 65% et prévient l’apparition des stéatoses hépatiques (diminution de 42% de triglycéride dans le foie) sans être toxique. Les analyses d’immunobuvardage ont montré que R. groenlandicum stimule la voie de l’insuline via la phosphorylation de l’Akt et a augmenté le contenu protéique en Glut 4 dans les muscles des souris traitées. Par contre, dans le foie, le R. groenlandicum passerait par deux voies différentes, soit la voie insulino-dépendante par l’activation de l’AKT, soit la voie insulino-indépendante par la stimulation de l’AMPK. L’amélioration observée des stéatoses hépatiques chez les souris DIO traitées, a été confirmée par une baisse du facteur de transcription, SREBP-1, impliqué dans la lipogénèse de novo, ainsi qu’une diminution de l’inflammation hépatique (diminution de l’activité d’IKK α/β). En conclusion, l’ensemble de ces résultats soutiennent le potentiel thérapeutique de Rhododendron groenlandicum et de ses composants actifs dans le traitement et la prévention du diabète de type 2. Nous avons validé l'innocuité et l'efficacité de cette plante issue de la médecine traditionnelle Cri, qui pourrait être un traitement alternatif du diabète de type 2 dans une population ayant une faible adhérence au traitement pharmacologique existant.

In vitro and in vivo virulence evaluation of the new genotype of porcine circovirus type 2 and identification of a new cell line permissive to virus replication

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal