12 resultados para Arabidopsis
em Université de Montréal, Canada
Resumo:
Le maintien de la stabilit du gnome est essentiel pour la propagation de linformation gntique et pour la croissance et la survie des cellules. Tous les organismes possdent des systmes de prvention des dommages et des rarrangements de lADN et nos connaissances sur ces processus dcoulent principalement de ltude des gnomes bactriens et nuclaires. Comparativement peu de choses sont connues sur les systmes de protection des gnomes dorganelles. Cette tude rvle limportance des protines liant lADN simple-brin de la famille Whirly dans le maintien de la stabilit du gnome des organelles de plantes. Nous rapportons que les Whirlies sont requis pour la stabilit du gnome plastidique chez Arabidopsis thaliana et Zea mays. Labsence des Whirlies plastidiques favorise une accumulation de molcules rearranges produites par recombinaison non-homologue mdie par des rgions de microhomologie. Ce mcanisme est similaire au microhomology-mediated break-induced replication (MMBIR) retrouv chez les bactries, la levure et lhumain. Nous montrons galement que les organelles de plantes peuvent rparer les bris double-brin en utilisant une voie semblable au MMBIR. La dltion de diffrents membres de la famille Whirly entrane une accumulation importante de rarrangements dans le gnome des organelles suite linduction de bris double-brin. Ces rsultats indiquent que les Whirlies sont aussi importants pour la rparation fidle des gnomes dorganelles. En se basant sur des donnes biologiques et structurales, nous proposons un modle o les Whirlies modulent la disponibilit de lADN simple-brin, rgulant ainsi le choix des voies de rparation et permettant le maintien de la stabilit du gnome des organelles. Les divers aspects de ce modle seront tests au cours dexpriences futures ce qui mnera une meilleure comprhension du maintien de la stabilit du gnome des organelles.
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Au cours du dveloppement des vgtaux, de ltablissement de lidentit cellulaire des premiers organes au guidage du tube pollinique, la communication cellule cellule est dune importance capitale. En rponse, les voies de signalisation molculaires sont labores pour la perception dun signal extrieur et la transduction en une rponse gnique via une cascade intracellulaire. Les rcepteurs kinases font partie des protines perceptrices des stimuli et constituent chez les plantes une catgorie de protines avec une occurrence considrable, mais dont trs peu dinformations dtailles sont disponibles ce jour. Une famille de rcepteurs kinases chez Arabidopsis thaliana, AtORK11 (Arabidopsis thaliana Ovule Receptor Kinase 11), a t identifie par orthologie un rcepteur spcifique aux ovaires chez une solanacee sauvage, Solanum chacoense. La fonction prsume de cette famille de rcepteurs kinases de type leucine-rich repeat, suggre par son patron dexpression, implique les vnements relatifs au dveloppement des gamtophytes et la reproduction. Afin de caractriser la fonction des quatre gnes de la famille (AtORK11a, AtORK11b, AtORK11c et AtORK11d) une stratgie danalyse de mutants dinsertion de lADN-T et dvaluation du mode daction par complmentation bimolculaire par fluorescence (BiFC) a t entreprise. Aucune fonction prcise na pu tre attribue aux doubles mutants dinsertion, par contre la surexpression dune construction dominante ngative indique un rle dans le dveloppement gamtophytique. Il a aussi t dmontr que les quatre rcepteurs peuvent interagir par homodimrisation aussi bien que par htrodimrisation. Une hypothse de redondance fonctionnelle est ainsi mise jour parmi la famille des gnes AtORK11.
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Chez les angiospermes, la reproduction passe par la double fcondation. Le tube pollinique dlivre deux cellules spermatiques au sein du gamtophyte femelle. Une cellule fconde la cellule uf pour produire un zygote; lautre fconde la cellule centrale pour produire lendosperme. Pour assurer un succs reproductif, le dveloppement du gamtophyte femelle au sein de lovule doit tablir un patron cellulaire qui favorise les interactions avec le tube pollinique et les cellules spermatiques. Pour ce faire, un dialogue doit stablir entre les diffrentes cellules de lovule lors de son dveloppement, de mme que lors de la fcondation. Dailleurs, plusieurs types de communications intercellulaires sont supposes suite la caractrisation de plusieurs mutants dveloppementaux. De mme, ces communications semblent persister au sein du zygote et de lendosperme pour permettre la formation dun embryon viable au sein de la graine. Malgr les dveloppements rcents qui ont permis de trouver des molcules de signalisation supportant les modles dinteractions cellulaires avancs par la communaut scientifique, les voies de signalisation sont de loin trs incompltes. Dans le but de caractriser des gnes encodant des protines de signalisation potentiellement impliqus dans la reproduction chez Solanum chacoense, lanalyse dexpression des gnes de type RALF prsents dans une banque dESTs (Expressed Sequence Tags) spcifiques lovule aprs fcondation a t entreprise. RALF, Rapid Alcalinization Factor, est un peptide de 5 kDa qui fait partie de la superfamille des protines riches en cystines (CRPs), dont les rles physiologiques au sein de la plante sont multiples. Cette analyse dexpression a conduit une analyse approfondie de ScRALF3, dont lexpression au sein de la plante se limite essentiellement lovule. Lanalyse de plantes transgniques dinterfrence pour le gne ScRALF3 a rvl un rle particulier lors de la mgagamtognse. Les plantes transgniques prsentent des divisions mitotiques anormales qui empchent le dveloppement complet du sac embryonnaire. Le positionnement des noyaux, de mme que la synchronisation des divisions au sein du syncytium, semblent responsables de cette perte de progression lors de la mgagamtognse. Lisolement du promoteur de mme que lanalyse plus prcise dexpression au sein de lovule rvle une localisation sporophytique du transcrit. La voie de signalisation de lauxine rgule galement la transcription de ScRALF3. De surcrot, ScRALF3 est un peptide empruntant la voie de scrtion mdie par le rticulum endoplasmique et lappareil de Golgi. En somme, ScRALF3 est un important facteur facilitant la communication entre le sporophyte et le gamtophyte pour amener maturit le sac embryonnaire. Lidentification dun orthologue potentiel chez Arabidopsis thaliana a conduit la caractrisation de AtRALF34. Labsence de phnotype lors du dveloppement du sac embryonnaire suggre, cependant, de la redondance gntique au sein de la grande famille des gnes de type RALF. Nanmoins, les peptides RALFs apparaissent comme dimportants rgulateurs lors de la reproduction chez Solanum chacoense et Arabidopsis thaliana.
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Contrairement la plupart des eucaryotes non-photosynthtiques, les vgtaux doivent assurer la stabilit dun gnome additionnel contenu dans le plastide, un organite dorigine endosymbiotique. Malgr la taille modeste de ce gnome et le faible nombre de gnes quil encode, celui-ci est absolument essentiel au processus de photosynthse. Pourtant, mme si ce gnome est dune importance cruciale pour le dveloppement de la plante, les principales menaces son intgrit, ainsi que les consquences dune dstabilisation gnralise de sa squence dADN, demeurent largement inconnues. Dans lobjectif dlucider les consquences de linstabilit gnomique chloroplastique, nous avons utilis le mutant why1why3polIb dArabidopsis thaliana, qui prsente dimportants niveaux de rarrangements gnomiques chloroplastiques, ainsi que la ciprofloxacine, un compos induisant des brisures double-brins dans lADN des organites. Ceci nous a permis dtablir quune quantit importante de rarrangements gnomiques provoque une dstabilisation de la chane de transport des lectrons photosynthtique et un grave stress oxydatif associ au processus de photosynthse. tonnamment, chez why1why3polIb, ces hautes concentrations despces oxygnes ractives ne mnent ni la perte de fonction des chloroplastes affects, ni la mort cellulaire des tissus. Bien au contraire, ce dsquilibre rdox semble tre lorigine dune reprogrammation gnique nuclaire permettant de faire face ce stress photosynthtique et confrant une tolrance aux stress oxydatifs subsquents. Grce une nouvelle mthode danalyse des donnes de squenage de nouvelle gnration, nous montrons galement quun type particulier dinstabilit gnomique, demeur peu caractris jusqu maintenant, constitue une des principales menaces au maintien de lintgrit gnomique des organites, et ce, tant chez Arabidopsis que chez lhumain. Ce type dinstabilit gnomique est dnomm rarrangement de type U-turn et est vraisemblablement associ au processus de rplication. Par une approche gntique, nous dmontrons que les protines chloroplastiques WHY1, WHY3 et RECA1 empchent la formation de ce type dinstabilit gnomique, probablement en favorisant la stabilisation et le redmarrage des fourches de rplication bloques. Une forte accumulation de rarrangements de type U-turn semble dailleurs tre lorigine dun svre trouble dveloppemental chez le mutant why1why3reca1. Ceci soulve de nombreuses questions quant limplication de ce type dinstabilit gnomique dans de nombreux troubles et pathologies possdant une composante mitochondriale.
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Mmoire numris par la Direction des bibliothques de l'Universit de Montral.
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Suite au projet de squenage du gnome dArabidopsis thaliana, plus de 400 rcepteurs de types serine/thronine kinases (Protein Receptor Kinase ou PRK) ont t prdits. Par contre, seulement sept paires de rcepteurs/ligands ont t caractrises jusqu prsent par des techniques de biochimie et danalyse, de mutants. Parmi ceux-ci figurent les PRK : BRI1, CLV1, SRK, SR160, Haesa-IDA et PEPR1 qui jouent un rle important dans le dveloppement, lauto-incompatibilit sporophytique et les mcanismes de dfense. Le but de mon projet de matrise tait de dvelopper un bioessai haut dbit qui permettra la dcouverte de ligands peptidiques. Le bioessai utilisera des PRK chimriques composs du domaine extracellulaire (lectodomaine) de la PRK ltude fusionne au domaine intracellulaire dune PRK qui agira comme rapporteur. Deux stratgies sont prsentement dveloppes dans notre laboratoire : la premire consiste fusionner la PRK ltude avec le domaine intracellulaire (lendodomaine) du rcepteur tyrosine kinase animal EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor). Suite linteraction avec une fraction protique contenant un ligand correspondant la PRK tudie, une transphosphorylation de lendodomaine (le domaine kinase) serait dtectable. La seconde stratgie utilise lendodomaine du rcepteur BRI1, un rcepteur rpondant aux brassinostrodes. Suite linteraction avec une fraction protique contenant un ligand correspondant la PRK tudie, cette fois-ci nous devrions tre en mesure de mesurer lactivation dun gne rapporteur rpondant normalement une activation par les brassinostrodes.
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Comparativement au gnome contenu dans le noyau de la cellule de plante, nos connaissances des gnomes des deux organelles de cette cellule, soit le plastide et la mitochondrie, sont encore trs limites. En effet, un nombre trs restreint de facteurs impliqus dans la rplication et la rparation de lADN de ces compartiments ont t identifis ce jour. Au cours de notre tude, nous avons dmontr limplication de la famille de protines Whirly dans le maintien de la stabilit des gnomes des organelles. Des plantes mutantes pour des gnes Whirly chez Arabidopsis thaliana et Zea mays montrent en effet une augmentation du nombre de molcules dADN rarranges dans les plastides. Ces nouvelles molcules sont le rsultat dune forme de recombinaison illgitime nomme microhomology-mediated break-induced replication qui, en temps normal, se produit rarement dans le plastide. Chez un mutant dArabidopsis ne possdant plus de protines Whirly dans les plastides, ces molcules dADN peuvent mme tre amplifies jusqu cinquante fois par rapport au niveau de lADN sauvage et causer un phnotype de varigation. Ltude des mutants des gnes Whirly a men la mise au point dun test de sensibilit un antibiotique, la ciprofloxacine, qui cause des bris double brin spcifiquement au niveau de lADN des organelles. Le mutant dArabidopsis ne contenant plus de protines Whirly dans les plastides est plus sensible ce stress que la plante sauvage. Lagent chimique induit en effet une augmentation du nombre de rarrangements dans le gnome du plastide. Bien quun autre mutant ne possdant plus de protines Whirly dans les mitochondries ne soit pas plus sensible la ciprofloxacine, on retrouve nanmoins plus de rarrangements dans son ADN mitochondrial que dans celui de la plante sauvage. Ces rsultats suggrent donc une implication pour les protines Whirly dans la rparation des bris double brin de lADN des organelles de plantes. Notre tude de la stabilit des gnomes des organelles a ensuite conduit la famille des protines homologues des polymrases de lADN de type I bactrienne. Plusieurs groupes ont en effet suggr que ces enzymes taient responsables de la synthse de lADN dans les plastides et les mitochondries. Nous avons apport la preuve gntique de ce lien grce des mutants des deux gnes PolI dArabidopsis, qui encodent des protines hautement similaires. La mutation simultane des deux gnes est ltale et les simples mutants possdent moins dADN dans les organelles des plantes en bas ge, confirmant leur implication dans la rplication de lADN. De plus, les mutants du gne PolIB, mais non ceux de PolIA, sont hypersensibles la ciprofloxacine, suggrant une fonction dans la rparation des bris de lADN. En accord avec ce rsultat, la mutation combine du gne PolIB et des gnes des protines Whirly du plastide produit des plantes avec un phnotype trs svre. En dfinitive, lidentification de deux nouveaux facteurs impliqus dans le mtabolisme de lADN des organelles nous permet de proposer un modle simple pour le maintien de ces deux gnomes.
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Les plantes doivent assurer la protection de trois gnomes localiss dans le noyau, les chloroplastes et les mitochondries. Si les mcanismes assurant la rparation de lADN nuclaire sont relativement bien compris, il nen va pas de mme pour celui des chloroplastes et des mitochondries. Or il est important de bien comprendre ces mcanismes puisque des dommages lADN non ou mal rpars peuvent entraner des rarrangements dans les gnomes. Chez les plantes, de tels rarrangements dans lADN mitochondrial ou dans lADN chloroplastique peuvent conduire une perte de vigueur ou un ralentissement de la croissance. Rcemment, notre laboratoire a identifi une famille de protines, les Whirly, dont les membres se localisent au niveau des mitochondries et des chloroplastes. Ces protines forment des ttramres qui lient lADN monocatnaire et qui accomplissent de nombreuses fonctions associes au mtabolisme de lADN. Chez Arabidopsis, deux de ces protines ont t associes au maintien de la stabilit du gnome du chloroplaste. On ignore cependant si ces protines sont impliques dans la rparation de lADN. Notre tude chez Arabidopsis dmontre que des cassures bicatnaires de lADN sont prises en charge dans les mitochondries et les chloroplastes par une voie de rparation dpendant de trs courtes squences rptes (de cinq cinquante paires de bases) dADN. Nous avons galement montr que les protines Whirly modulent cette voie de rparation. Plus prcisment, leur rle serait de promouvoir une rparation fidle de lADN en empchant la formation de rarrangements dans les gnomes de ces organites. Pour comprendre comment les protines Whirly sont impliques dans ce processus, nous avons lucid la structure cristalline dun complexe Whirly-ADN. Nous avons ainsi pu montrer que les Whirly lient et protgent lADN monocatnaire sans spcificit de squence. La liaison de lADN seffectue entre les feuillets de sous-units contigus du ttramre. Cette configuration maintient lADN sous une forme monocatnaire et empche son appariement avec des acides nucliques de squence complmentaire. Ainsi, les protines Whirly peuvent empcher la formation de rarrangements et favoriser une rparation fidle de lADN. Nous avons galement montr que, lors de la liaison de trs longues squences dADN, les protines Whirly peuvent sagencer en superstructures dhexamres de ttramres, formant ainsi des particules sphriques de douze nanomtres de diamtre. En particulier, nous avons pu dmontrer limportance dun rsidu lysine conserv chez les Whirly de plantes dans le maintien de la stabilit de ces superstructures, dans la liaison cooprative de lADN, ainsi que dans la rparation de lADN chez Arabidopsis. Globalement, notre tude amne de nouvelles connaissances quant aux mcanismes de rparation de lADN dans les organites de plantes ainsi que le rle des protines Whirly dans ce processus.
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La fertilisation chez les plantes dpend de la livraison des cellules spermatiques contenues dans le pollen lovule. Au contact du stigmate, le grain de pollen shydrate et forme une protubrance, le tube pollinique, charg de livrer les noyaux spermatiques lovule. Le tube pollinique est une cellule croissance rapide, anisotrope et non autotrophe; ainsi tout au long de sa croissance travers lapoplaste du tissu pistillaire, le tube pollinique puise ses sources de carbohydrates et de minraux du pistil. Ces lments servent la synthse des constituants de la paroi qui seront achemins par des vsicules de scrtion jusqu lapex du tube. Ce dernier doit aussi rsister des pressions mcaniques pour maintenir sa forme cylindrique et doit rpondre diffrents signaux directionnels pour pouvoir atteindre lovule. Mon projet de doctorat tait de comprendre le rle du cytosquelette dans la croissance anisotrope du tube pollinique et didentifier les lments responsables de sa croissance et de son guidage. Le cytosquelette du tube pollinique est compos des microfilaments dactine et des microtubules. Pour assurer une bonne croissance des tubes polliniques in vitro, les carbohydrates et les lments de croissance doivent tre ajouts au milieu des concentrations bien spcifiques. Jai donc optimis les conditions de croissance du pollen dArabidopsis thaliana et de Camellia japonica qui ont t utiliss avec le pollen de Lilium longiflorum comme modles pour mes expriences. Jai dvelopp une mthode rapide et efficace de fixation et de marquage du tube pollinique base sur la technologie des microondes. Jai aussi utilis des outils pharmacologiques, mcaniques et molculaires coupls diffrentes techniques de microscopie pour comprendre le rle du cytosquelette dactine lors de la croissance et le tropisme du tube pollinique. Jai trouv que le cytosquelette dactine et plus prcisment lanneau dactine localis dans la partie sub-apicale du tube est fortement impliqu dans la croissance et le maintien de larchitecture du tube travers le contrle de la livraison des vsicules de scrtion. Jai construit une chambre galvanotropique qui peut tre monte sur un microscope invers et qui sert envoyer des signaux tropistiques bien prcis des tubes polliniques en croissance. Jai trouv que les filaments dactine sont impliqus dans la capacit du tube pollinique changer de direction. Ce comportement tropistique dpend de la concentration du calcium dans le milieu de croissance et du flux de calcium travers des canaux calciques. Le gradient de calcium tabli dans le tube pollinique affecte lactivit de certaines protines qui se lient lactine et dont le rle est la rorganisation des filaments dactine. Parmi ces protines, il y a celles de dpolymrisation de lactine (ADF) dont deux spcifiquement exprimes dans le gamtophyte mle dArabidopsis (ADF7 et ADF10). Par marquage avec des proteins fluorescents, jai trouv que lADF7 et lADF10 ont des expressions diffrentielles pendant la microsporogense et la germination et croissance du tube pollinique et quelles partagent entre elles des rles importants durant ces diffrents stades.
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Les processus mitochondriaux tels que la rplication et la traduction sont effectus par des complexes multiprotiques. Par contre, le mtabolisme et la voie de maturation des ARN mitochondriaux (p. ex prcurseurs des ARNt et des ARNr) sont habituellement traits comme une suite de ractions catalyses par des protines spares. Lexcution fidle et optimale de ces processus mitochondriaux, exige un couplage troit ncessaire pour la canalisation des intermdiaires mtaboliques. Or, les vidences en faveur de l'interconnexion postule de ces processus cellulaires sont peu nombreuses et proviennent en grande partie des interactions protine-protine. Contrairement la perception classique, nos rsultats rvlent lorganisation des fonctions cellulaires telles que la transcription, la traduction, le mtabolisme et la rgulation en supercomplexes multifonctionnels stables, dans les mitochondries des champignons (ex Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus nidulans et Neurospora crassa), des animaux (ex Bos taurus), des plantes (B. oleracea et Arabidopsis thaliana) et chez les bactries (ex E. coli) partir desquelles les mitochondries descendent. La composition de ces supercomplexes chez les champignons et les animaux est comparable celle de levure, toutefois, chez les plantes et E. coli ils comportent des diffrences notables (ex, prsence des enzymes spcifiques la voie de biosynthse des sucres et les lctines chez B. oleracea). Chez la levure, en accord avec les changements ds la rpression catabolique du glucose, nos rsultats rvlent que les supercomplexes sont dynamiques et que leur composition en protines dpend des stimulis et de la rgulation cellulaire. De plus, nous montrons que linactivation de la voie de biosynthse des lipides de type II (FASII) perturbe lassemblage et/ou la biogense du supercomplexe de la RNase P (responsable de la maturation en 5 des prcurseurs des ARNt), ce qui suggre que de multiples effets pliotropiques peuvent tre de nature structurale entre les protines. Chez la levure et chez E. coli, nos tudes de la maturation in vitro des prcurseurs des ARNt et de la protomique rvlent lassociation de la RNase P avec les enzymes de la maturation dARNt en 3. En effet, la voie de maturation des pr-ARNt et des ARNr, et la dgradation des ARN mitochondriaux semblent tres associes avec la machinerie de la traduction au sein dun mme supercomplexe multifonctionnel dans la mitochondrie de la levure. Chez E. coli, nous avons caractris un supercomplexe similaire qui inclut en plus de la RNase P: la PNPase, le complexe du RNA degradosome, lARN polymrase, quatre facteurs de transcription, neuf aminoacyl-tRNA synthtases, onze protines ribosomiques, des chaperons et certaines protines mtaboliques. Ces rsultats supposent lassociation physique de la transcription, la voie de maturation et daminoacylation des ARNt, la dgradation des ARN. Le nombre de cas o les activits cellulaires sont fonctionnellement et structurellement associes est certainement la hausse (ex, lditosome et le complexe de la glycolyse). En effet, lorganisation en supercomplexe multifonctionnel reprsente probablement lunit fonctionnelle dans les cellules et les analyses de ces super-structures peuvent devenir la prochaine cible de la biologie structurale.
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La stabilit gnomique des organelles de plantes suscite un grand intrt dans le domaine de la biologie vgtale. En effet, plusieurs tudes rcentes suggrent que ce type dinstabilit gnomique pourrait mener lisolation de traits intressants en lagronomie. Plusieurs protines sont dailleurs dj t identifis comme tant impliqus dans le maintien de la stabilit de ces gnomes, tels que MSH1, la famille des POLI, OSB1, les protines Whirly et les Recombinases A (RECA). Le gnome nuclaire dArabidopsis thaliana encode trois protines sapparentant la Recombinase A bactrienne et qui sont cibles la mitochondrie et/ou au chloroplaste, soit RECA1, RECA2 et RECA3. Globalement, ces gnes partagent une similarit de squence de 61% avec leur homologue bactrien chez Escherichia coli. Chez les bactries ces protines jouent un rle essentiel dans la recombinaison homologue et sont impliques dans la rparation de lADN. Chez Arabidopsis, il a t dmontr que RECA2 et RECA3 sont ncessaires au maintien de lintgrit du gnome mitochondriale. Toutefois leur contribution la stabilit du gnome chloroplastique ainsi que le rle de RECA1 restent obscures. Le but de ce projet est donc de dterminer la contribution ventuelle des protines RECA dArabidopsis dans la rparation de lADN chloroplastique et plus prcisment le rle du gne RECA1. Nous nonons lhypothse que les RECA de plantes se comportent effectivement comme leurs orthologues bactriens en tant impliqus dans la recombinaison homologue. Dans le cadre de ce projet, nous avons tent disoler des lignes mutantes pour chacun des gnes RECA dArabidopsis. En somme, nous avons pu obtenir des lignes convenables pour notre tude que dans le cas du gne RECA1. Ces lignes ont t utilises pour valuer la contribution de ce gne la stabilit du gnome du chloroplaste. Ensuite, pour tudier la relation pistatique des gnes RECA1, WHY1 et WHY3, un croisement des diffrentes lignes mutantes pour ces gnes a t ralis. Nous avons ensuite tudi la sensibilit de toutes ces lignes mutantes la ciprofloxacine, un agent causant des bris double brin exclusivement dans les organelles de plantes. Finalement, iii nous avons test la prsence de rarrangements dans le gnome du chloroplaste en condition normal ou en prsence de stress gnotoxique. Nos rsultats dmontrent que les protines Whirly et RECA1 sont impliques dans deux voies de rparation de lADN diffrentes et que les Whirly sont suffisantes pour soccuper des bris dADN double brin en labsence de RECA1. Nous dmontrons galement que labsence de Whirly et RECA1 entraine une forte augmentation de la quantit de rarrangements dans le gnome du chloroplaste. De plus nous proposons que la polymrase POLIB est implique dans la mme voie de rparation que RECA1. Finalement nous proposons un modle pour expliquer nos rsultats et impliquons RECA1 dans un mcanisme de rparation dADN et aussi un rle potentiel dans la rplication.
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Chez les plantes fleurs, lovaire est lorgane reproducteur femelle et il interagit de faon importante avec les gamtes mles durant la croissance, le guidage, la rception et la rupture du tube pollinique ainsi que la fusion des gamtes. Le processus dbute lorsque de nombreux gnes de lovule sont activs longue distance lors de la rception du pollen sur le stigmate. Afin dexplorer les signaux provenant de lovule ayant un impact important sur les interactions pollenpistil, particulirement les molcules scrtes impliques dans la signalisation espcespcifique, lexpression gnique des ovules sous forme dARNm ainsi et la scrtion protique ont t tudies chez Solanum chacoense, une espce diplode de pomme de terre sauvage. S. chacoense a subi beaucoup dhybridation interspcifique avec dautres espces sympathiques de solanaces, facilitant ainsi grandement ltude des interactions pollenovule de faon espcespcifique ainsi que leur volution. Dans ce projet, des ovules provenant de trois conditions diffrentes ont t compars: des ovules matures de type sauvage, des ovules lgrement immatures, rcolts deux jours avant lanthse et des ovules provenant du mutant frk1 pour lesquels le sac embryonnaire est absent. Un squenage dARN haut dbit a dabord t effectu sur les ovules de type sauvage de S. chacoense afin de gnrer un assemblage de rfrence comprenant 33852 squences codantes. Dautres squenages ont t effectus sur les trois conditions dovules et sur les feuilles afin de faire une analyse dexpression diffrentielle des gnes. En comparaison avec les ovules de type sauvage, 818 gnes sont rprims dans les ovules du mutant frk1. Un sous-groupe de 284 gnes, taient galement sous-exprims dans les ovules lgrement immatures, suggrant un rle spcifique dans les stades tardifs de la maturation du sac embryonnaire (stade de dveloppent FG6 FG7) ainsi que du guidage du tube pollinique, puisque ni les ovules du mutant frk1 ni ceux lgrement immatures ne sont capables dattirer les tubes polliniques lors dessais de croissance semi in vivo. De plus, 21% de ces gnes sont des peptides riches en cystines (CRPs). En utilisant un transcriptome assembl de novo provenant de deux proches parents de S. chacoense, S. gandarillasii et S. tarijense, une analyse dorthologie a t effectue sur ces CRPs, rvlant une grande variabilit et une volution rapide chez les solanaces. De nouveaux motifs de cystine uniques cette famille ont galement t dcouverts. En comparant avec des tudes similaires chez Arabidopsis, le sac embryonnaire de S. chacoense montre un transcriptome fortement divergent, particulirement en en ce qui a trait la catgorisation fonctionnelle des gnes et de la similarit entre les gnes orthologues. De plus,mme si la glycosylation nest pas requise lors du guidage mycropylaire du tube pollinique chez Arabidopsis, Torenia ou le mas, des extraits dovules glycosyls de S. chacoense sont capables daugmenter la capacit de guidage de 18%. Cette tude est donc la premire montrer une corrlation entre glycosylation et le guidage du tube pollinique par lovule. En complment lapproche transcriptomique, une approche protomique portant sur les protine scrtes par lovule (le secrtome) a t utilise afin didentifier des protines impliques dans linteraction entre ovule et tube pollinique. Des exsudats dovules matures (capables dattirer le tube pollinique) et dovules immatures (incapables dattirer le tube pollinique) ont t rcolts en utilisant une nouvelle mthode dextraction par gravit permettant de rduire efficacement les contaminants cytosoliques moins de 1% de lchantillon. Un total de 305 protines scrtes par les ovules (OSPs) ont t identifies par spectromtrie de masse, parmi lesquelles 58% taient spcifiques aux ovules lorsque compares avec des donnes de protines scrtes par des tissus vgtatifs. De plus, la scrtion de 128 OSPs est augmente dans les ovules matures par rapport aux ovules immatures. Ces 128 protines sont donc considres en tant que candidates potentiellement impliques dans la maturation tardive de lovule et dans le guidage du tube pollinique. Cette tude a galement montr que la maturation du sac embryonnaire du stade FG6 au stade FG7 influence le niveau de scrtion de 44% du scrtome total de lovule. De faon surprenante, la grande majorit (83%) de ces protines nest pas rgule au niveau de lARN, soulignant ainsi limportance de cette approche dans ltude du guidage du tube pollinique comme complment essentiel aux tudes transcriptomiques. Parmi tous les signaux scrts par lovule et relis au guidage, obtenus partir des approches transcriptomiques et protomiques dcrites ci-haut, nous avons spcifiquement valu limplication des CRPs dans le guidage du tube pollinique par lovule chez S. chacoense, vu limplication de ce type de protine dans les interactions pollen-pistil et le guidage du tube pollinique chez dautres espces. Au total, 28 CRPs taient prsentes dans les ovules capables dattirer le tube pollinique tout en tant absentes dans les ovules incapables de lattirer, et ce, soit au niveau de lARNm et/ou au niveau du scrtome. De celles-ci, 17 CRPs ont t exprimes dans un systme bactrien et purifies en quantit suffisante pour tester le guidage. Alors que des exsudats dovules ont t utiliss avec succs pour attirer par chimiotactisme le tube pollinique, les candidats exprims dans les bactries nont quant eux pas t capables dattirer les tubes polliniques. Comme lutilisation de systmes dexpression htrologue eucaryote peut permettre un meilleur repliement et une plus grande activit des protines, les candidats restants seront de nouveau exprims, cette fois dans un systme de levure ainsi que dans un systme vgtal pour produire les peptides scrts. Ceux-ci seront ensuite utiliss lors dessais fonctionnels pour valuer leur capacit guider les tubes polliniques et ainsi isoler les attractants chimiques responsable du guidage du tube pollinique chez les solanaces comme S. chacoense.
