790 resultados para signalisation cellulaire
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La progression dun individu au travers dun environnement diversifi dpend des informations visuelles qui lui permettent dvaluer la taille, la forme ou mme la distance et le temps de contact avec les obstacles dans son chemin. Il peut ainsi planifier en avance les modifications ncessaires de son patron locomoteur afin dviter ou enjamber ces entraves. Ce concept est aussi applicable lorsque le sujet doit atteindre une cible, comme un prdateur tentant dattraper sa proie en pleine course. Les structures neurales impliques dans la gense des modifications volontaires de mouvements locomoteurs ont t largement tudies, mais relativement peu dinformation est prsentement disponible sur les processus intgrant linformation visuelle afin de planifier ces mouvements. De nombreux travaux chez le primate suggrent que le cortex parital postrieur (CPP) semble jouer un rle important dans la prparation et lexcution de mouvements datteinte visuellement guids. Dans cette thse, nous avons investigu la proposition que le CPP participe similairement dans la planification et le contrle de la locomotion sous guidage visuel chez le chat. Dans notre premire tude, nous avons examin ltendue des connexions cortico-corticales entre le CPP et les aires motrices plus frontales, particulirement le cortex moteur, laide dinjections de traceurs fluorescents rtrogrades. Nous avons cartographi la surface du cortex moteur de chats anesthsis afin didentifier les reprsentations somatotopiques distales et proximales du membre antrieur dans la partie rostrale du cortex moteur, la reprsentation du membre antrieur situe dans la partie caudale de laire motrice, et enfin la reprsentation du membre postrieur. Linjection de diffrents traceurs rtrogrades dans deux rgions motrices slectionnes par chat nous a permis de visualiser la densit des projections divergentes et convergentes paritales, diriges vers ces sites moteurs. Notre analyse a rvl une organisation topographique distincte de connexions du CPP avec toutes les rgions motrices identifies. En particulier, nous avons not que la reprsentation caudale du membre antrieur reoit majoritairement des projections du ct rostral du sillon parital, tandis que la partie caudale du CPP projette fortement vers la reprsentation rostrale du membre antrieur. Cette dernire observation est particulirement intressante, parce que le ct caudal du sillon parital reoit de nombreux inputs visuels et sa cible principale, la rgion motrice rostrale, est bien connue pour tre implique dans les fonctions motrices volontaires. Ainsi, cette tude anatomique suggre que le CPP, au travers de connexions tendues avec les diffrentes rgions somatotopiques du cortex moteur, pourrait participer llaboration dun substrat neural idal pour des processus tels que la coordination inter-membre, intra-membre et aussi la modulation de mouvements volontaires sous guidage visuel. Notre deuxime tude a test lhypothse que le CPP participe dans la modulation et la planification de la locomotion visuellement guide chez le chat. En nous rfrant la cartographie corticale obtenue dans nos travaux anatomiques, nous avons enregistr lactivit de neurones paritaux, situs dans les portions des aires 5a et 5b qui ont de fortes connexions avec les rgions motrices impliques dans les mouvements de la patte antrieure. Ces enregistrements ont t effectus pendant une tche de locomotion qui requiert lenjambement dobstacles de diffrentes tailles. En dissociant la vitesse des obstacles de celle du tapis sur lequel le chat marche, notre protocole exprimental nous a aussi permit de mettre plus demphase sur limportance de linformation visuelle et de la sparer de linflux proprioceptif gnr pendant la locomotion. Nos enregistrements ont rvl deux groupes de cellules paritales actives en relation avec lenjambement de lobstacle: une population, principalement situe dans laire 5a, qui dcharge seulement pendant le passage du membre au dessus delentrave (cellules spcifiques au mouvement) et une autre, surtout localise dans laire 5b, qui est active au moins un cycle de marche avant lenjambement (cellules anticipatrices). De plus, nous avons observ que lactivit de ces groupes neuronaux, particulirement les cellules anticipatrices, tait amplifie lorsque la vitesse des obstacles tait dissocie de celle du tapis roulant, dmontrant limportance grandissante de la vision lorsque la tche devient plus difficile. Enfin, un grand nombre des cellules actives spcifiquement pendant lenjambement dmontraient une corrlation soutenue de leur activit avec le membre controlatral, mme sil ne menait pas dans le mouvement (cellules unilatrales). Inversement, nous avons not que la majorit des cellules anticipatrices avaient plutt tendance maintenir leur dcharge en phase avec lactivit musculaire du premier membre enjamber lobstacle, indpendamment de sa position par rapport au site denregistrement (cellules bilatrales). Nous suggrons que cette disparit additionnelle dmontre une fonction diversifie de lactivit du CPP. Par exemple, les cellules unilatrales pourraient moduler le mouvement du membre controlatral au-dessus de lobstacle, quil mne ou suive dans lordre denjambement, tandis que les neurones bilatraux sembleraient plutt spcifier le type de mouvement volontaire requis pour viter lentrave. Ensembles, nos observations indiquent que le CPP a le potentiel de moduler lactivit des centres moteurs au travers de rseaux corticaux tendus et contribue diffrents aspects de la locomotion sous guidage visuel, notamment linitiation et lajustement de mouvements volontaires des membres antrieurs, mais aussi la planification de ces actions afin dadapter la progression de lindividu au travers dun environnement complexe.
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L'axe hypothalamo-hypophyso-surrnalien (HPA) permet de maintenir l'homostasie de l'organisme face divers stress. Qu'ils soient de nature psychologique, physique ou inflammatoire/infectieux, les stress provoquent la synthse et la libration de CRH par l'hypothalamus. Les cellules corticotropes hypophysaires peroivent ce signal et en raction, produisent et scrtent l'ACTH. Ceci induit la synthse des glucocorticodes (Gc) par le cortex surrnalien; ces strodes mettent le systme mtabolique en tat dalerte pour la rponse au stress et lagression. Les Gc ont le rle essentiel de contrler les dfenses de l'organisme, en plus d'exercer une rtro-inhibition sur l'axe HPA. L'ACTH est une petite hormone peptidique produite par le clivage d'un prcurseur: la pro-opiomlanocortine (POMC). cause de sa position critique dans la normalisation de l'homostasie, le contrle transcriptionnel du gne Pomc a fait l'objet d'tudes approfondies au cours des dernires dcennies. Nous savons maintenant que la rgion promotrice du gne Pomc permet une expression cible dans les cellules POMC hypophysaires. L'tude du locus Pomc par des technologies gnomiques m'a permis de dcouvrir un nouvel lment de rgulation qui est conserv travers l'volution des mammifres. La caractrisation de cet enhancer a dmontr qu'il dirige une expression restreinte l'hypophyse, et plus particulirement dans les cellules corticotropes. De faon intressante, l'activit de cet lment dpend d'un nouveau site de liaison recrutant un homodimre du facteur de transcription Tpit, dont l'expression est galement limite aux cellules POMC de l'hypophyse. La dcouverte de cet enhancer ajoute une toute nouvelle dimension la rgulation de l'expression de POMC. Les cytokines pro-inflammatoires IL6/LIF et les Gc sont connus pour leur antagonisme sur la raction inflammatoire et sur le promoteur Pomc via l'action des facteurs de transcription Stat3 et GR respectivement. L'analyse gnomique des sites lis ii par ces deux facteurs nous a rvl une interrelation complexe et a permis de dfinir un code transcriptionnel entre ces voies de signalisation. En plus de leur action par interaction directe avec lADN au niveau des squences rgulatrices, ces facteurs interagissent directement entre eux avec des rsultats transcriptionnels diffrents. Ainsi, le recrutement de GR par contact protine:protine (tethering) sur Stat3 tant li l'ADN provoque un antagonisme transcriptionnel. Inversement, le tethering de Stat3 sur GR supporte une action synergique, tout comme leur co-recrutement l'ADN sur des sites contigus ou composites. Lors d'une activation soutenue, ce synergisme entre les voies IL6/LIF et Gc induit une rponse inne de dfense cellulaire. Ainsi lors d'un stress majeur, ce mcanisme de dfense est mis en branle dans toutes les cellules et tissus. En somme, les travaux prsents dans cette thse dfinissent les mcanismes transcriptionnels engags dans le combat de l'organisme contre les stress. Plus particulirement, ces mcanismes ont t dcrits au niveau de la rponse globale des corticotropes et du gne Pomc. Il est essentiel pour l'organisme d'induire adquatement ces mcanismes afin de faire face aux stress et d'viter des drglements comme les maladies inflammatoires et mtaboliques.
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Les mlanomes malins (MM) constituent le deuxime type de cancer le plus frquent chez les jeunes adultes canadiens (entre 20 et 44 ans) ainsi quun des rares cancers dont lincidence augmente annuellement. moins que les MM ne soient exciss temps par chirurgie, les chances de survie des patients sont pratiquement nulles puisque ce type de tumeur est trs rfractaire aux traitements conventionnels. Il est bien connu que lexposition aux rayons ultraviolets (UV), induisant des photoproduits gnotoxiques, est une dterminante majeure dans lacquisition de MM. cet effet, la rparation par excision de nuclotides (NER) est la ligne de dfense principale contre le dveloppement des mlanomes puisquelle est la voie de rparation prpondrante en ce qui a trait aux dits photoproduits. Malgr cela, la contribution potentielle de dfauts de la NER au dveloppement des MM dans la population normale nest toujours pas bien tablie. Notre laboratoire a prcdemment dvelopp une mthode base sur la cytomtrie de flux qui permet de mesurer la NER en fonction du cycle cellulaire. Cette mthode a dj mise en vidence quune dficience de lactivit de la protine ATR peut mener une dficience de la NER exclusive la phase S dans des fibroblastes humains. Pareillement, nous avons dmontr que plusieurs lignes cellulaires cancreuses modles comportent une dficience en NER en phase S, suggrant quune telle dficience puisse caractriser certains types de cancers. Nous avons voulu savoir si une dficience en NER en phase S pouvait tre associe une proportion significative de mlanomes et si le tout pouvait tre attribuable une diminution de lactivit dATR. Nos objectifs ont donc t de : (i) mesurer lefficacit de la NER en fonction du cycle cellulaire dans les MM en comparaison avec les mlanocytes primaires, (ii) vrifier si le niveau dactivit dATR corrle avec lefficacit de la NER en phase S dans les lignes de MM et (iii) voir si un gne frquemment mut dans les mlanomes (tels PTEN et BRAF) pouvait cooprer avec ATR pour rguler la NER en phase S dans les mlanomes. Nous avons dmontr que 13 lignes de MM sur 16 ont une capacit grandement diminue rparer les photoproduits induits par UV spcifiquement en phase S. De plus, cette dficience corrle fortement avec une rduction de lactivation dATR et, dans plusieurs lignes de MM, avec une phosphorylation dAkt plus importante. Lutilisation dARN interfrent ou dun inhibiteur du suppresseur de tumeurs PTEN, a permis, en plus daugmenter la phosphorylation dAkt, de rduire la rparation des photoproduits et lactivation dATR dans les cellules en phase S. En addition, (i) lexpression ectopique de la protine PTEN sauvage dans des lignes dficientes en PTEN (mais pas dune protine PTEN sans activit phosphatase) ou (ii) linhibition pharmacologique dAkt a permis daugmenter la rparation en phase S ainsi que lactivation dATR. En somme, cette tude dmontre quune signalisation dATR dpendante de PTEN/Akt amenant une rparation dficiente des photoproduits gnomiques causs par les UV en phase S peut tre dterminante dans le dveloppement des mlanomes induits par UV.
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Une drgulation de la voie de signalisation Ras/Raf/MEK/ERK1/2 est observe dans plus de 30% des cancers et des mutations activatrices de RAS sont observes dans 30% 50% des adnomes colorectaux. la suite dune analyse extensive de biopsies de tumeurs colorectales humaines par micromatrices tissulaires (TMA), nous avons observ que 44% des tissus cancreux exprimaient MEK1/2 phosphoryls, contre 10% des tissus normaux. L'analyse des TMA a galement rvl que 79% des tumeurs arboraient un marquage nuclaire de MEK1/2 phosphoryls, contre 4 % pour les tissus normaux. Bien que la voie MEK/ERK1/2 soit frquemment active dans les cancers, le rle prcis des isoformes de MEK1 et de MEK2 n'a jamais t clairement tablie. De mme, l'impact de cette localisation nuclaire aberrante de phospho-MEK1/2, dans l'initiation et la progression des cancers colorectaux, est inconnu. Lors d'un premier projet, nous avons dmontr, que lexpression de MEK1 ou MEK2 activ est suffisante pour transformer in vitro des cellules intestinales pithliales de rat (IEC-6). L'expression des mutants actifs de MEK1 ou MEK2 est suffisante pour induire une drgulation de la prolifration cellulaire et engendrer la formation d'adnocarcinomes invasifs dans un modle de greffe orthotopique du clon chez la souris. Nous avons galement dmontr que l'inhibition de MEK2 par shRNA supprime compltement la prolifration des lignes humaines de cancer du clon, alors que la suppression de MEK1 a peu d'effet sur la capacit de prolifration. Le deuxime projet, nous a permis d'observer que l'expression d'un mutant nuclaire de MEK1 dans les cellules IEC-6 transforme drastiquement les cellules. Une augmentation de prolifration, une rsistance l'anoikose, un drglement du cycle cellulaire, de l'instabilit chromosomique (CIN), de la ttra/aneuplodie sont observs. La caractrisation des mcanismes responsables de cette localisation aberrante de MEK1/2 phosphoryls, a permis d'identifier la protine Sef, un rgulateur de la localisation cytoplasmique de MEK/ERK1/2. Nous avons dmontr que l'expression d'une forme oncognique de Ras (H-RasV12) inhibe l'expression de Sef, engendrant alors une accumulation nuclaire de MEK1/2 activs. Plus encore, la rexpression de Sef restaure la localisation cytoplasmique de MEK1/2 et renverse les proprits tumorigniques ainsi que l'aneuplodie induite par Ras activ. Un troisime projet, visant la caractrisation des mcanismes associs la CIN et l'aneuplode engendrs par l'activation aberrante de la voie de Ras-ERK1/2, a permis d'observer que l'hyperactivation de ERK1/2 induit des anomalies mitotiques menant la binuclation. Une localisation errone et une surexpression de la kinase Aurora A, de mme que des protines de passage du complexe chromosomique (CPC), Aurora B, Survivine et INCENP, sont observes. L'inhibition partielle de l'activation de ERK1/2 par de faible dose de PD184352, un inhibiteur de MEK1/2, est suffisante pour renverser la surexpression de ces rgulateurs mitotiques, de mme que corriger les anomalies de la mitose et rduire la ttra/aneuplodie engendre par Ras oncognique. Ainsi, nous avons dmontr, pour la premire fois, que la voie des MAP kinases ERK1/2 est implique dans la CIN, la ttraplodie et l'aneuplodie. Nos rsultats suggrent que la perte de Sef est un vnement oncognique prcoce, qui contribue la localisation nuclaire aberrante de MEK1/2 qui est observe dans les tumeurs colorectales. Cette localisation anormale de MEK1/2 est associe l'initiation de la transformation, la progression tumorale et la CIN, via l'activit soutenue de ERK1/2. Ces informations sont capitales et dmontrent limportance de la voie de signalisation Ras/Raf/MEK/ERK1/2 dans le processus de tumorignse colorectale.
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Les mcanismes cellulaires anti-prolifratifs, lesquels comprennent lapoptose, aussi appele la mort cellulaire programme, larrt transitoire du cycle cellulaire et la snescence, permettent la cellule de prvenir, en rponse diffrents stress, laccumulation de mutations pouvant conduire une prolifration incontrle et, ventuellement, au dveloppement dune tumeur. La rgulation de ces diffrents mcanismes requiert lactivation de protines appeles des suppresseurs de tumeur, dont le principal est p53. p53 est un facteur de transcription dont la stabilisation et lactivation conduit une hausse de lexpression de gnes directement impliqus dans larrt de la prolifration. Au cours des dernires annes, lensemble des travaux sur p53 ont permis de mettre en vidence la complexit de sa fonction, de mme que la multitude de voies de signalisation et de protines avec lesquelles il coopre pour maintenir lintgrit du gnome. De ce fait, ltude des mcanismes dactivation de p53 est de mise pour la comprhension de sa rgulation et, ventuellement, pour la prvention et llaboration de nouvelles stratgies de traitement contre le cancer. Lobjet de cette thse est la mise en vidence dun mcanisme dactivation de p53 et de la snescence par la protine SOCS1, un suppresseur de la signalisation par les cytokines. Ce mcanisme implique une interaction directe entre les deux protines, plus prcisment entre le domaine SH2 de SOCS1 et le domaine de transactivation de p53. SOCS1 interagit galement, au niveau de son SOCS Box, avec les kinases ATM et ATR de la voie du dommage lADN de faon faciliter la phosphorylation de p53 en srine 15. Ainsi, en interagissant la fois avec p53 et ATM/ATR, SOCS1 contribue la stabilisation et lactivation de p53. En accord avec ce modle, linhibition de SOCS1 dans des fibroblastes humains normaux tend diminuer le nombre de cellules snescentes suite lexpression de loncogne ca-STAT5A et rduire laccumulation nuclaire de p53 dans ces cellules. De la mme faon, les lymphocytes T provenant de souris Socs1-/-Ifn-/- sont moins susceptibles dentrer en apoptose que les lymphocytes provenant de souris Socs1+/+Ifn+/+, suite une exposition des radiations. Dans les deux contextes, on observe une baisse de lexpression des gnes cibles de p53, ce qui dmontre que SOCS1 est implique dans lactivation de p53 in vivo. Cette thse a galement pour but de mettre en vidence limplication de SOCS1 dans lactivation dautres facteurs de transcription et, par le fait mme, de dmontrer quelle peut agir comme un rgulateur plus gnral de la transcription. Une tude approfondie de linteraction entre SOCS1 et p53 a permis de dmontrer que le domaine de transactivation II de p53 (acides amins 36-67) est suffisant pour linteraction. Plus prcisment, il semble que le tryptophane 53 (W53) et la phnylalanine 54 (F54) sont les principaux rsidus impliqus. Une analyse structurale de ce domaine de p53 a conduit lidentification dun motif conserv dans plusieurs autres facteurs de transcription pourvus dun domaine de transactivation acide, dont p63, p73 et E2F1. En accord avec ces rsultats, SOCS1 est en mesure dinteragir avec chacune des deux protines. Ainsi, la capacit de SOCS1 dinteragir et de rguler lactivit de p53 peut stendre dautres facteurs de transcription. En terminant, le mcanisme prsent dans cette thse contribue la comprhension de la rgulation de p53, le principal suppresseur de tumeur de la cellule. De plus, il met en vidence une nouvelle fonction de SOCS1, laquelle tait jusqualors essentiellement connue pour inhiber la voie de signalisation JAK/STAT. Ce nouveau rle pour SOCS1 permet dexpliquer de quelle manire une activation aberrante de la signalisation par les cytokines peut dclencher la snescence ou lapoptose. Enfin, le fait que SOCS1 puisse rguler diffrents facteurs de transcription permet de la qualifier de rgulateur gnral des facteurs de transcription composs dun domaine de transactivation acide.
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Les lymphocytes B et T sont issus de cellules prognitrices lymphodes de la moelle osseuse qui se diffrencient grce laction de facteurs de transcription, cytokines et voies de signalisation, dont linterleukine-7 (IL-7)/IL-7 rcepteur (IL-7R). Le facteur de transcription c-Myc est exprim par les cellules lymphodes et contrle leur croissance et leur diffrenciation. Cette rgulation transcriptionnelle peut tre coordonne par le complexe c-Myc/Myc-Interacting Zinc finger protein-1 (Miz-1). Le but de ce projet tait de comprendre les mcanismes qui impliquent Miz-1 et le complexe c-Myc/Miz-1 dans le dveloppement des lymphocytes B et T. Pour raliser ce projet, des souris dficientes pour le domaine de transactivation de Miz-1 (Miz-1POZ) et des souris allles mutantes pour c-MycV394D, mutation qui empche linteraction avec Miz-1, ont t gnres. La caractrisation des souris Miz 1POZ a dmontr que linactivation de Miz-1 perturbe le dveloppement des lymphocytes B et T aux stades prcoces de leur diffrenciation qui dpend de lIL-7. Lanalyse de la cascade de signalisation IL-7/IL-7R a montr que ces cellules surexpriment la protine inhibitrice SOCS1 qui empche la phosphorylation de STAT5 et perturbe la rgulation la hausse de la protine de survie Bcl-2. De plus, Miz-1 se lie directement au promoteur de SOCS1 et contrle son activit. En plus de contrler laxe IL-7/IL-7R/STAT5/Bcl-2 spcifiquement aux stades prcoces du dveloppement afin dassurer la survie des progniteurs B et T, Miz-1 rgule laxe EBF/Pax-5/Rag-1/2 dans les cellules B afin de coordonner les signaux ncessaires pour la diffrenciation des cellules immatures. La caractrisation des souris c-MycV394D a montr, quant elle, que les fonctions de Miz-1 dans les cellules B et T semblent indpendantes de c-Myc. Les cellules T des souris Miz-1POZ ont un dfaut de diffrenciation additionnel au niveau de la -slection, tape o les signaux initis par le TCR remplacent ceux induits par IL-7 pour assurer la prolifration et la diffrenciation des thymocytes en stades plus matures. cette tape du dveloppement, une forme fonctionnelle de Miz-1 semble tre requise pour contrler le niveau dactivation de la voie p53, induite lors du processus de rarrangement V(D)J du TCR. Lexpression de gnes pro-apoptotiques PUMA, NOXA, Bax et du rgulateur de cycle cellulaire p21CIP1 est rgule la hausse dans les cellules des souris Miz-1POZ. Ceci provoque un dbalancement pro-apoptotique qui empche la progression du cycle cellulaire des cellules TCR-positives. La survie des cellules peut tre rtablie ce stade de diffrenciation en assurant une coordination adquate entre les signaux initis par lintroduction dun TCR transgnique et dun transgne codant pour la protine Bcl-2. En conclusion, ces tudes ont montr que Miz-1 intervient deux niveaux du dveloppement lymphode: lun prcoce en contrlant la signalisation induite par lIL-7 dans les cellules B et T, en plus de laxe EBF/Pax-5/Rag-1/2 dans les cellules B; et lautre tardif, en coordonnant les signaux de survie issus par le TCR et p53 dans les cellules T. tant donn que les thymocytes et lymphocytes B immatures sont sujets plusieurs rondes de prolifration, ces tudes serviront mieux comprendre limplication des rgulateurs du cycle cellulaire comme c-Myc et Miz-1 dans la gnration des signaux ncessaires la diffrenciation non aberrante et la survie des ces cellules. Enfin, les modles exprimentaux, souris dficientes ou allles mutantes, utiliss pour ce travail permettront de mieux dfinir les bases molculaires de la transformation maligne des lymphocytes B et T et de rvler les mcanismes conduisant au lymphome.
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Limplantation retarde ou diapause embryonnaire dcrit l'arrt ou le retardement pendant l'embryogense. Chez le vison, la diapause est corrle avec une scrtion pituitaire insuffisante de la prolactine, ayant pour rsultat la diffrentiation incomplte du corpus luteum et rduction de la progestrone. Des tudes antrieures suggrent que le blastocyste de vison en diapause demeure dans un tat de quiescence ou se dveloppe lentement. Pour lucider ceci, la rplication de l'ADN a t tudie. Les rsultats dmontrent synthse de lADN et prolifration cellulaire dans les embryons au stade de morula, avant la diapause et dans les blastocystes aprs la ractivation. La rplication de l'ADN a t galement dtecte dans des blastocystes en diapause et en diapause prolonge. L'implantation est considre comme une interaction bidirectionnelle entre le blastocyste et l'utrus. Il a t montr que les prostaglandines sont importantes pour la vascularisation de lutrus au moment de limplantation et peuvent ractiver l'utrus des visons aprs la diapause. La concentration protinique et la localisation de la phospholipase citosolique A2 (CPLA2) et de la cyclooxygenase 2 (COX2) ont t tudies dans l'utrus de vison. Lexpression de la CPLA2 et COX2 taient sur-rgules au moment de l'implantation. Il est connu que la prolactine active les corpus luteum des visons. L'ide de un lien entre la prolactine et la voie de signalisation des prostaglandines a t teste en mesurant les rcepteurs de prolactine. Les rsultats montrent une augmentation de lexpression des rcepteurs de prolactine l'implantation suggrant que la prolactine pourrait activer la voie de prostaglandine l'utrus par son propre rcepteur. La conclusion, les embryons pendant la diapause ne sont pas arrtes compltement et les protines lies la voie de prostaglandine sont implique dans la ractivation de l'utrus.
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Les cellules sont capables de dtecter les distributions spatiales de protines et ainsi de migrer ou stendre dans la direction approprie. Une comprhension de la rponse cellulaire aux modifications de ces distributions spatiales de protines est essentielle pour lavancement des connaissances dans plusieurs domaines de recherches tels que le dveloppement, limmunologie ou loncologie. Un exemple particulirement complexe est le guidage daxones se droulant pendant le dveloppement du systme nerveux. Ce dernier ncessite la prsence de plusieurs distributions de molcules de guidages tant attractives ou rpulsives pour connecter correctement ce rseau complexe quest le systme nerveux. Puisque plusieurs indices de guidage collaborent, il est particulirement difficile didentifier la contribution individuelle ou la voie de signalisation qui est dclenche in vivo, il est donc ncessaire dutiliser des mthodes pour reproduire ces distributions de protines in vitro. Plusieurs mthodes existent pour produire des gradients de protines solubles ou lies aux substrats. Quelques mthodes pour produire des gradients solubles sont dj couramment utilises dans plusieurs laboratoires, mais elles limitent ltude aux distributions de protines qui sont normalement scrtes in vivo. Les mthodes permettant de produire des distributions lies au substrat sont particulirement complexes, ce qui restreint leur utilisation quelques laboratoires. Premirement, nous prsentons une mthode simple qui exploite le photoblanchiment de molcules fluorescentes pour crer des motifs de protines lies au substrat : Laser-assisted protein adsorption by photobleaching (LAPAP). Cette mthode permet de produire des motifs de protines complexes dune rsolution micromtrique et dune grande porte dynamique. Une caractrisation de la technique a t faite et en tant que preuve de fonctionnalit, des axones de neurones du ganglion spinal ont t guids sur des gradients dun peptide provenant de la laminine. Deuximement, LAPAP a t amlior de manire pouvoir fabriquer des motifs avec plusieurs composantes grce lutilisation de lasers a diffrentes longueurs donde et danticorps conjugus des fluorophores correspondants ces longueurs donde. De plus, pour acclrer et simplifier le processus de fabrication, nous avons dvelopp LAPAP a illumination champ large qui utilise un modulateur spatial de lumire, une diode lectroluminescente et un microscope standard pour imprimer directement un motif de protines. Cette mthode est particulirement simple comparativement la version originale de LAPAP puisquelle nimplique pas le contrle de la puissance laser et de platines motorises, mais seulement denvoyer limage du motif dsir au modulateur spatial. Finalement, nous avons utilis LAPAP pour dmontrer que notre technique peut tre utilise dans des analyses de haut contenu pour quantifier les changements morphologiques rsultant de la croissance neuronale sur des gradients de protines de guidage. Nous avons produit des milliers de gradients de laminin-1 ayant diffrentes pentes et analys les variations au niveau du guidage de neurites provenant dune ligne cellulaire neuronale (RGC-5). Un algorithme pour analyser les images des cellules sur les gradients a t dvelopp pour dtecter chaque cellule et quantifier la position du centrode du soma ainsi que les angles dinitiation, final et de braquage de chaque neurite. Ces donnes ont dmontr que les gradients de laminine influencent langle dinitiation des neurites des RGC-5, mais ninfluencent pas leur braquage. Nous croyons que les rsultats prsents dans cette thse faciliteront lutilisation de motifs de protines lies au substrat dans les laboratoires des sciences de la vie, puisque LAPAP peut tre effectu a laide dun microscope confocal ou dun microscope standard lgrement modifi. Cela pourrait contribuer laugmentation du nombre de laboratoires travaillant sur le guidage avec des gradients lis au substrat afin datteindre la masse critique ncessaire des perces majeures en neuroscience.
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Le traitement du cancer laide dune exposition aux radiations ionisantes peut mener au dveloppement de plusieurs effets secondaires importants, dont un retard de rparation et de rgnration du tissu hmatopotique. Les mcanismes responsables de ces effets demeurent encore inconnus, ce qui limite le dveloppement de nouvelles approches thrapeutiques. laide dun modle murin de prise de greffe, nos rsultats dmontrent que lendommagement du microenvironnement par lirradiation a un impact limitant sur le nichage hmatopotique. Parce que le microenvironnement est compos principalement de cellules drives des cellules souches msenchymateuses (CSM), nous avons valu le potentiel des CSM rgnrer le tissu hmatopotique par la reconstitution de la niche osseuse. Cette thrapie a men une augmentation remarquable du nichage hmatopotique chez les souris irradies. Les causes molculaires impliques dans le nichage hmatopotiques sont encore inconnues, mais nous avons remarqu laugmentation de la scrtion de la cytokine granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) dans lespace mdullaire suite lirradiation. Le G-CSF est impliqu dans la mobilisation cellulaire et est fort possiblement nuisible une prise de greffe. Nous avons valu le potentiel dune thrapie base de CSM scrtant le rcepteur soluble du G-CSF afin de squestrer le G-CSF transitoirement et les rsultats obtenus dmontrent que le blocage du G-CSF favorise le nichage hmatopotique. Globalement, les donnes prsentes dans ce mmoire dmontrent que le microenvironnement osseux et le niveau de G-CSF dans la moelle sont importants dans le processus de nichage hmatopotique et que la baisse du potentiel de rgnration du tissu hmatopotique suite lirradiation peut tre renverse laide dune thrapie cellulaire de CSM gntiquement modifies ou non.
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Chez les animaux vision binoculaire, la vision tridimensionnelle permet la perception de la profondeur grce l'intgration de l'information visuelle en provenance des deux yeux. La premire tape de cette intgration est rendue possible anatomiquement par la sgrgation des axones controlatraux et ipsilatraux des cellules ganglionnaires de la rtine (CGR) au niveau du chiasma optique. Les axones controlatraux croisent la ligne mdiane au chiasma en route du nerf optique vers le cerveau. linverse, les axones ipsilatraux s'cartent du chiasma et continuent dans le tractus optique ipsilatral, en vitant la ligne mdiane vers leurs cibles crbrales. Les mcanismes molculaires la base de ce phnomne ne sont pas compltement compris. Les tudes prsentes dans cette thse montrent que Boc, le rcepteur de Sonic Hedgehog (Shh) dans le guidage axonal, est enrichi dans les CGRs ipsilatrales de la rtine en dveloppement. La prsence de Shh sur la ligne mdiane, et le mode d'expression complmentaire du rcepteur nous ont conduit mettre l'hypothse que Shh pourrait repousser les axones ipsilatraux au niveau du chiasma en activant le rcepteur Boc. Conformment cette hypothse, nous avons constat que seulement les CGR exprimant Boc se rtractent in vitro en rponse Shh et que cette rponse est perdue dans les CGR mutantes pour Boc. In vivo, nous dmontrons que Boc est requis pour la sgrgation normale des axones ipsilatraux au niveau du chiasma optique et, inversement, que l'expression ectopique de Boc dans les CGR contralatrales empche leurs axones de traverser le chiasma optique. Dans lensemble, ces rsultats suggrent que Shh repousse les axones ipsilatraux au niveau du chiasma optique par son rcepteur Boc. Cette premire partie de notre travail identifie un nouveau couple ligand-rcepteur requis pour la sgrgation des axones au niveau du chiasma optique. Une interaction molculaire implique dans cette sgrgation implique lphrine-B2 et ses rcepteurs EphB (EphB1). Dans la deuxime partie de notre travail, nous montrons, in vivo, en utilisant des souris doubles et quadruples mutantes pour les rcepteurs Boc, EphB1 ou les trois rcepteurs EphB, que labrogation des deux voies de signalisation Shh et phrine-B2 conduit l'absence de projections ipsilatrales. Ceci indique que les deux signalisations agissent de faon indpendante dans des voies parallles. De manire intressante, ces souris mutantes ont t utilises comme modle gntique pour dmontrer des dfauts dans la perception de la profondeur de champs chez des animaux dpourvus de projections visuelles ipsilatrales. Ainsi, les travaux prsents dans cette thse dmontrent pour la premire fois que la formation des projections rtiniennes ipsilatrales est essentielle ltablissement de la vision binoculaire et dpend des voies induites par les rcepteurs dphrine-B2 et Shh.
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Thse numrise par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Universit de Montral.
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Thse diffuse initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Universit de Montral/Centre d'dition numrique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur.
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La leucmie lymphoblastique aigu (LLA) est responsable denviron 25% de lensemble des cancers pdiatriques. Chez 85% des enfants diagnostiqus, la LLA entrane une prolifration massive et incontrle de lymphocytes immatures de type prcurseurs B dans la moelle osseuse (LLA pr-B). Des avances intressantes ont t faites au cours des trente dernires annes et ont men une augmentation de lefficacit des traitements thrapeutiques. Plus de 80% des enfants atteints de LLA seront guris de cette maladie. Malheureusement, ces traitements manquent de spcificit cause du manque de connaissances sur les mcanismes molculaires impliqus durant linitiation et le dveloppement de la LLA pr-B pdiatrique. En dautres termes, nous connaissons peu de chose sur ltiologie de cette maladie. Plus de 25% des enfants atteints de la LLA pr-B prsentent la translocation chromosomique t(12;21)(p13;q22) qui implique les gnes ETV6 et AML1. Celle-ci est forme in utero et mne lexpression de la protine chimre transcriptionnelle ETV6-AML1, dont la prsence seule ne suffit pas au dveloppement de la LLA pr-B. Ainsi, dautres vnements gntiques sont ncessaires au dveloppement de cette leucmie. La dltion de lallle rsiduel de ETV6 est un vnement gntique frquemment rencontr au moment du diagnostic de la LLA pr-B t(12;21)+. Cette dltion entrane linactivation complte de ETV6 dans les lymphocytes pr-B leucmiques. ETV6 est un rpresseur transcriptionnel de la famille Ets. Mon hypothse de recherche est que ETV6 agit comme gne suppresseur de tumeur dans la LLA pr-B pdiatrique. Linactivation de ETV6 causerait une drgulation de lexpression de ses cibles transcriptionnelles et, par le fait mme, favoriserait linitiation et le droulement de la leucmogense pdiatrique. Dans le cadre de mon projet, comme peu de cibles transcriptionnelles de ETV6 sont connues, jai effectu des expriences dimmunoprcipitation de la chromatine et des essais lucifrases qui ont permis didentifier six nouvelles cibles transcriptionnelles: TP53 (p53 et 133p53), SPHK1, IL-18, PTGER4 et LUM. Jai dmontr que la rgulation transcriptionnelle mdie par ETV6 requiert la prsence de ses deux domaines fonctionnels: PNT (interactions protiques) et ETS (liaison lADN). Ces domaines favorisent la reconnaissance dun site EBS consensus dans une rgion situe prs du promoteur de base. Ce mcanisme peut dpendre du promoteur rgul par ETV6, mais galement du contexte cellulaire. Des tudes fonctionnelles ralises sur des lymphocytes pr-B leucmiques ont permis de mesurer limpact de la drgulation de lexpression des cibles transcriptionnelles de ETV6 sur trois voies biologiques: la prolifration cellulaire, lapoptose induite par un stress gnotoxique et la migration cellulaire dirige par la voie de signalisation CXCL12/CXCR4. Ceci a permis de dmontrer limplication des gnes SPHK1, IL-18 et PTGER4 durant la leucmogense pdiatrique. Cette tude est une des premires suggrer le rle de ETV6 comme gne suppresseur de tumeur dans la LLA pr-B pdiatrique. Suite linactivation du rpresseur transcriptionnel ETV6, laugmentation de lexpression de ses cibles transcriptionnelles favoriserait la prolifration et la survie des lymphocytes pr-B leucmiques dans la moelle osseuse. Lidentification de nouveaux gnes impliqus dans le dveloppement de la LLA pr-B pdiatrique ouvre la porte au dveloppement de nouveaux traitements thrapeutiques qui pourront prsenter une meilleure spcificit envers ltiologie de la maladie.
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Le glaucome est la deuxime cause de ccit irrversible dans le monde. La perte de vision qui se produit lors du glaucome sexplique par une dgnrescence du nerf optique et une mort progressive et slective des cellules ganglionnaires de la rtine (CRG). L'hypertension oculaire est un facteur de risque majeur dans le glaucome, mais des dfauts du champ visuel continuent se dvelopper chez un contingent de patients malgr l'administration de mdicaments qui abaissent la pression intraoculaire (PIO). Par consquent, bien que la PIO reprsente le seul facteur de risque modifiable dans le dveloppement du glaucome, son contrle ne suffit pas protger les CRGs et prserver la fonction visuelle chez de nombreux patients. Dans ce contexte, j'ai avanc l'hypothse centrale voulant que les stratgies de traitement du glaucome visant promouvoir la protection structurale et fonctionnelle des CRGs doivent agir sur les mcanismes molculaires qui conduisent la mort des ces neurones. Dans la premire partie de ma thse, j'ai caractris l'effet neuroprotecteur de la galantamine, un inhibiteur de l'actylcholinestrase qui est utilis cliniquement dans le traitement de la maladie d'Alzheimer. Cette tude sest base sur l'hypothse que la galantamine, en modulant l'activit du rcepteur de l'actylcholine, puisse amliorer la survie des CRGs lors du glaucome. Nous avons utilis un modle exprimental bien caractris d'hypertension oculaire induite par ladministration d'une solution saline hypertonique dans une veine pisclrale de rats Brown Norway. Les rsultats de cette tude (Almasieh et al. Cell Death and Disease, 2010) ont dmontr que l'administration quotidienne de galantamine amliore de manire significative la survie des corps cellulaires et des axones CRGs. La protection structurelle des CRGs saccompagne dune prservation remarquable de la fonction visuelle, value par l'enregistrement des potentiels voqus visuels (PEV) dans le collicule suprieur, la cible principale des CRGs chez le rongeur. Une autre constatation intressante de cette tude est la perte substantielle de capillaires rtiniens et la rduction du dbit sanguin associ la perte des CRGs dans le glaucome exprimental. Il est trs intressant que la galantamine ait galement favoris la protection de la microvascularisation et amlior le dbit sanguin rtinien des animaux glaucomateux (Almasieh et al. en prparation). J'ai notamment dmontr que les neuro-et vasoprotections mdies par la galantamine se produisent par iv l'activation des rcepteurs muscariniques de l'actylcholine. Dans la deuxime partie de ma thse, j'ai tudi le rle du stress oxydatif ainsi que l'utilisation de composs rducteurs pour tester l'hypothse que le blocage d'une augmentation de superoxyde puisse retarder la mort des CRG lors du glaucome exprimental. J'ai profit d'un compos novateur, un antioxydant base de phosphineborane (PB1), pour tester sur son effet neuroprotecteur et examiner son mcanisme d'action dans le glaucome exprimental. Les donnes dmontrent que l'administration intraoculaire de PB1 entrane une protection significative des corps cellulaire et axones des CRGs. Les voies molculaires conduisant la survie neuronale mdie par PB1 ont t explores en dterminant la cascade de signalisation apoptotique en cause. Les rsultats dmontrent que la survie des CRGs mdie par PB1 ne dpend pas dune inhibition de signalisation de protines kinases actives par le stress, y compris ASK1, JNK ou p38. Par contre, PB1 induit une augmentation marque des niveaux rtiniens de BDNF et une activation en aval de la voie de survie des ERK1 / 2 (Almasieh et al. Journal of Neurochemistry, 2011). En conclusion, les rsultats prsents dans cette thse contribuent une meilleure comprhension des mcanismes pathologiques qui conduisent la perte de CRGs dans le glaucome et pourraient fournir des pistes pour la conception de nouvelles stratgies neuroprotectrices et vasoprotectrices pour le traitement et la gestion de cette maladie.
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Mmoire numris par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Universit de Montral.
