Caractérisation de l'anatomie et de la fonction du système endocannabinoïde dans la rétine adulte

Au cours des dernières années, un intérêt grandissant concernant les rôles physiologiques des endocannabinoïdes (eCBs) a été observé. Le système eCB est une cible attrayante pour la modulation du système immunitaire et de la douleur périphérique. Bien que le récepteur CB1 soit distribué dans le système nerveux, le récepteur CB2 est traditionnellement associé au système immunitaire. Ce dogme fait maintenant l’objet d’un débat depuis la découverte de l’expression du récepteur CB2 dans certains neurones. La rétine est un modèle important pour l’étude de processus neuronaux. La présence du récepteur CB1 y a été démontrée. Des études fonctionnelles rapportent que l’activation des récepteurs cannabinoïdes affecte le fonctionnement de plusieurs cellules rétiniennes. À ce jour, aucune étude ne s’est intéressée au rôle global des récepteurs CB1 et CB2 dans la rétine. Nous avons investigué les conséquences de l’élimination du récepteur CB1 (cnr1-/-) ou du récepteur CB2 (cnr2-/-) sur la fonction rétinienne mesurée par électrorétinographie. Nous avons également caractérisé la distribution du récepteur CB2 dans la rétine. Pour ce faire, nous avons comparé la spécificité de plusieurs anticorps dirigés contre le récepteur CB2. Seulement l’un des anticorps testés a montré une spécificité satisfaisante. Il a permis de détecter la présence du récepteur CB2 dans les cônes, les bâtonnets, les cellules horizontales, amacrines, bipolaires et ganglionnaires. Nos résultats d’électrorétinographie indiquent que seules les souris cnr2-/- présentent une amplitude accrue de l’onde a des ERG, en conditions scotopiques. En conditions photopiques, l’amplitude de l’onde b des souris cnr2-/- montre un schéma d’adaptation à la lumière différent des autres groupes. Aucun effet significatif n’a été observé chez les animaux cnr1-/-. Ces résultats permettent de conclure que les récepteurs CB1 et CB2 jouent des rôles différents dans le traitement visuel et que le récepteur CB2 semble être impliqué dans l’établissement des réponses rétiniennes.

Evidence for a reference frame transformation of vestibular contributions to voluntary reaching movements

Les estimations des mouvements de soi provenant des signaux vestibulaires contribuent à la planification et l’exécution des mouvements volontaires du bras lorsque le corps se déplace. Cependant, comme les senseurs vestibulaires sont fixés à la tête alors que le bras est fixé au corps, les signaux vestibulaires doivent être transformés d’un système de référence centré sur la tête à un système centré sur le corps pour pouvoir contribuer de façon appropriée au contrôle moteur du bras. Le but premier de ce travail était d’étudier l’évidence d’une telle transformation. La stimulation galvanique vestibulaire (SGV) a été utilisée pour activer les afférences vestibulaires et simuler une rotation autour d’un axe naso-occipital fixe pendant que des sujets humains faisaient des mouvements du bras dans le plan horizontal, avec la tête dans différentes orientations. Une transformation des signaux vestibulaires implique que la SVG devrait simuler une rotation autour d’un axe horizontal lorsque la tête est droite et autour d’un axe vertical lorsque la tête est en flexion antérieure. La SGV devrait ainsi perturber les mouvements du bras en fonction de l’orientation de la tête. Nos résultats démontrent que les signaux vestibulaires contribuant aux mouvements d’atteinte sont effectivement transformés en un système de référence centrée sur le corps. Le deuxième but de ce travail était d’explorer les mécanismes utilisant ces signaux vestibulaires transformés. En comparant les effets de la SGV appliquée avant ou pendant les mouvements d’atteinte nous avons montré que les signaux vestibulaires transformés contribuent à des mécanismes de compensation distincts durant la planification des mouvements d’atteinte comparativement à l’exécution.

Role of EFNBs and EphB4 in T cell development and function

Eph kinases are the largest family of cell surface receptor tyrosine kinases. The ligands of Ephs, ephrins (EFNs), are also cell surface molecules. Ephs interact with EFNs and the receptors and ligands transmit signals in both directions, i.e., from Ephs to EFNs and from EFNs to Ephs. Ephs and EFNs are widely involved in various developmental, physiological pathophysiological processes. Our group and others have reported the roles of Ephs/EFNs in the immune system. To further investigate the function of EphBs/EFNBs in T cell development and responses, we generated EFNB1, EFNB2, EphB4 conditional gene knockout (KO) mice and EFNB1/2 double KO mice. In the projects using EFNB1 and EFNB2 knockout mice, we specifically deleted EFNB1 or EFNB2 in T cells. The mice had normal size and cellularity of the thymus and spleen as well as normal T cell subpopulations in these organs. The bone marrow progenitors from KO mice and WT mice repopulated the host lymphoid organs to similar extents. The activation and proliferation of KO T cells was comparable to that of control mice. Naïve KO CD4 cells differentiated into Th1, Th2, Th17 and Treg cells similar to naïve control CD4 cells. In EFNB2 KO mice, we observed a significant relative increase of CD4CD8 double negative thymocytes in the thymus. Flowcytometry analysis revealed that there was a moderate increase in the DN3 subpopulation in the thymus. This suggests that EFNB2 is involved in thymocyte development. Our results indicate that the functions of EFNB1 and EFNB2 in the T cell compartment could be compensated by each other or by other members of the EFN family, and that such redundancy safeguards the pivotal roles of EFNB1 and EFNB2 in T cell development and function. In the project using EFNB1/B2 double knockout (dKO) model, we revealed a novel regulatory function of EFNb1 and EFNb2 in stabilizing IL-7Rα expression on the T cell surface. IL-7 plays important roles in thymocyte development, T cell homeostasis and survival. IL-7Rα undergoes internalization upon IL-7 binding. In the dKO mice, we observed reduced IL-7Rα expression in thymocytes and T cells. Moreover, the IL-7Rα internalization was accelerated in dKO CD4 cells upon IL-7 stimulation. In T cell lymphoma cell line, EL4, over-expression of either EFNB1 or EFNB2 retarded the internalization of IL-7Rα. We further demonstrated compromised IL-7 signaling and homeostatic proliferation of dKO T cells. Mechanism study using fluorescence resonance energy transfer and immunoprecipitation demonstrated that physical interaction of EFNB1 and EFNB2 with IL-7Rα was likely responsible for the retarded IL-7Rα internalization. In the last project, using medullary thymic epithelial cell (mTEC)-specific EphB4 knockout mice, we investigated T cell development and function after EphB4 deletion in mTEC. EphB4 KO mice demonstrated normal thymic weight and cellularity. T cell development and function were not influenced by the EphB4 deletion. Lastly, the KO mice developed normal delayed type hypersensitivity. Overall, our results suggest that comprehensive cross interaction between Eph and EFN family members could compensate function of a given deleted member in the T cell development, and only simultaneous deletion of multiple EFNBs will reveal their true function in the immune system. In fact, such redundancy signifies vital roles of Ephs and EFNs in the immune system.

Characterizing cortical myosin mini-filament regulation, length and its macroscopic implications in cytokinetic dynamics.

Au cours de la cytokinèse, le génome dédoublé est compartimentalisé en deux cellules filles. L’anneau contractile, une structure dynamique, est constitué d’actine, myosine (NMY-II) et d’autres protéines accessoires. NMY-2 est le seul moteur protéique impliqué dans la contraction de l’anneau durant la cytokinèse. Depuis longtemps, il a été considéré que celle-ci glissait le long des filaments d’actine grâce à sa capacité de traction. Récemment, plusieurs études ont découvert que son activité réticulante joue un rôle en cytokinèse et il est connu que la NMY-2 peut s’assembler en filaments bipolaires à partir de dimères. Ainsi, nous postulons que leur dimension (nombre de moteurs ATPasiques) pourrait dicter leur contribution en activité motrice et réticulante. Afin de déterminer la composition des filaments corticaux de NMY-2, nous avons utilisé une technique d'imagerie de molécules individuelles à l’aide de la microscopie TIRF. J’ai trouvé à travers l’analyse statistique de la distribution des NMY-2 mesurés que les filaments sont assemblés à deux dimensions constantes: Des filaments composés de 20 dimères et 30 dimères. La kinase Rho est une activatrice de NMY-2 nécessaire pour les niveaux physiologiques de NMY-2 sur l’anneau contractile, pour des cinétiques et fermeture concentrique de l’anneau. La déplétion de RhoK augmente l’abondance relative des filaments de 20 dimères. Ainsi, RhoK pourrait réguler le recrutement de la NMY et aussi l’assemblage des filaments corticaux de NMY-2. De plus, à l’aide de la microscopie confocale à temps réel, j’ai trouvé que lors de la déplétion de RhoK, il se produit une réduction du recrutement et du délai d’initiation du sillon, une fermeture lente et une augmentation significative de la concentricité de l’anneau. De plus, j’ai mesuré des défauts dans l’organisation corticale de l’anneau contractile en patch. La déplétion de MRCK-1 n’affecte pas l’initiation du sillon, les cinétiques de fermeture, ou la fermeture concentrique de l’anneau. Paradoxalement, la déplétion de MRCK-1 augmente le recrutement cortical de NMY-2, mais quand depleté simultanément avec Rho-K il diminue NMY-2 à l’équateur comparé à la déplétion seule de Rho-K. De plus, la double déplétion, conduit à un phénotype de concentricité de l’anneau, suivie d’un recentrage.

The involvement of nitric oxide in bovine follicular development and ovulation

Comprendre les événements paracriniens qui régulent la fertilité chez la vache est nécessaire non seulement en raison de l'importance agricole de cette espèce, mais aussi pour son utilisation potentielle comme modèle chez l’humain. L'oxyde nitrique (NO), un gaz de radicaux libres, a été impliqué dans la croissance folliculaire et l'ovulation chez les rongeurs et d'autres espèces, mais chez la vache c’est une énigme fascinante : le NO est produit par les cellules de la granulosa bovine et est régulé par la FSH, mais la présence et le profil d'expression des enzymes responsables de la synthèse de NO (NOS) dans les cellules de la granulosa tout au long de la croissance folliculaire ne sont pas claires. Les objectifs de cette thèse sont: (1) élucider le mécanisme de contrôle des NOS et les conséquences de la production d'oxyde nitrique pour le fonctionnement des cellules de la granulosa au cours du développement folliculaire chez la vache et (2) déterminer la régulation des NOS pendant la cascade ovulatoire induite par LH chez les cellules de la granulosa bovine et si l'activité des NOS pour l’expression des gènes critiques dans la cascade ovulatoire chez cette espèce. Les résultats sont séparés en 2 articles. Dans le premier article, la régulation de NOS2 dans les cellules de la granulosa bovine a été explorée. L'abondance des ARNm codant pour NOS2 a été stimulée par la FSH et l’IGF1 en augmentant l’estradiol, et un blocage de l'action de l’estradiol a conséquemment réduit les niveaux d'ARNm codant pour NOS2. De plus, l'inhibition de l'activité des NOS a augmenté l'apoptose dans les cellules de la granulosa in vitro. Dans le second article, il a été démontré que le pic de LH induit une activation des NOS dans les cellules de la granulosa, et que l'activité de NOS induit la production de NO, ce qui est essentiel pour l’expression des gènes critiques dans la cascade ovulatoire induite par LH comme EREG/AREG/PTGS2. Ensemble, les résultats présentés dans ces 2 articles suggèrent que les niveaux physiologiques d'activité des NOS peuvent contribuer à la croissance et la survie des cellules de la granulosa et indiquent également que NO peut être essentiel pour l'ovulation chez les bovins.

High-amylose carboxymethyl starch matrices for oral sustained drug-release : in vitro and in vivo evaluation

Les amidons non modifiées et modifiés représentent un groupe d’excipients biodégradables et abondants particulièrement intéressant. Ils ont été largement utilisés en tant qu’excipients à des fins diverses dans des formulations de comprimés, tels que liants et/ou agents de délitement. Le carboxyméthylamidon sodique à haute teneur en amylose atomisé (SD HASCA) a été récemment proposé comme un excipient hydrophile à libération prolongée innovant dans les formes posologiques orales solides. Le carboxyméthylamidon sodique à haute teneur en amylose amorphe (HASCA) a d'abord été produit par l'éthérification de l'amidon de maïs à haute teneur en amylose avec le chloroacétate. HASCA a été par la suite séché par atomisation pour obtenir le SD HASCA. Ce nouvel excipient a montré des propriétés présentant certains avantages dans la production de formes galéniques à libération prolongée. Les comprimés matriciels produits à partir de SD HASCA sont peu coûteux, simples à formuler et faciles à produire par compression directe. Le principal objectif de cette recherche était de poursuivre le développement et l'optimisation des comprimés matriciels utilisant SD HASCA comme excipient pour des formulations orales à libération prolongée. A cet effet, des tests de dissolution simulant les conditions physiologiques du tractus gastro-intestinal les plus pertinentes, en tenant compte de la nature du polymère à l’étude, ont été utilisés pour évaluer les caractéristiques à libération prolongée et démontrer la performance des formulations SD HASCA. Une étude clinique exploratoire a également été réalisée pour évaluer les propriétés de libération prolongée de cette nouvelle forme galénique dans le tractus gastro-intestinal. Le premier article présenté dans cette thèse a évalué les propriétés de libération prolongée et l'intégrité physique de formulations contenant un mélange comprimé de principe actif, de chlorure de sodium et de SD HASCA, dans des milieux de dissolution biologiquement pertinentes. L'influence de différentes valeurs de pH acide et de temps de séjour dans le milieu acide a été étudiée. Le profil de libération prolongée du principe actif à partir d'une formulation de SD HASCA optimisée n'a pas été significativement affecté ni par la valeur de pH acide ni par le temps de séjour dans le milieu acide. Ces résultats suggèrent une influence limitée de la variabilité intra et interindividuelle du pH gastrique sur la cinétique de libération à partir de matrices de SD HASCA. De plus, la formulation optimisée a gardé son intégrité pendant toute la durée des tests de dissolution. L’étude in vivo exploratoire a démontré une absorption prolongée du principe actif après administration orale des comprimés matriciels de SD HASCA et a montré que les comprimés ne se sont pas désintégrés en passant par l'estomac et qu’ils ont résisté à l’hydrolyse par les α-amylases dans l'intestin. Le deuxième article présente le développement de comprimés SD HASCA pour une administration orale une fois par jour et deux fois par jour contenant du chlorhydrate de tramadol (100 mg et 200 mg). Ces formulations à libération prolongée ont présenté des valeurs de dureté élevées sans nécessiter l'ajout de liants, ce qui facilite la production et la manipulation des comprimés au niveau industriel. La force de compression appliquée pour produire les comprimés n'a pas d'incidence significative sur les profils de libération du principe actif. Le temps de libération totale à partir de comprimés SD HASCA a augmenté de manière significative avec le poids du comprimé et peut, de ce fait, être utilisé pour moduler le temps de libération à partir de ces formulations. Lorsque les comprimés ont été exposés à un gradient de pH et à un milieu à 40% d'éthanol, un gel très rigide s’est formé progressivement sur leur surface amenant à la libération prolongée du principe actif. Ces propriétés ont indiqué que SD HASCA est un excipient robuste pour la production de formes galéniques orales à libération prolongée, pouvant réduire la probabilité d’une libération massive de principe actif et, en conséquence, des effets secondaires, même dans le cas de co-administration avec une forte dose d'alcool. Le troisième article a étudié l'effet de α-amylase sur la libération de principe actif à partir de comprimés SD HASCA contenant de l’acétaminophène et du chlorhydrate de tramadol qui ont été développés dans les premières étapes de cette recherche (Acetaminophen SR et Tramadol SR). La modélisation mathématique a montré qu'une augmentation de la concentration d’α-amylase a entraîné une augmentation de l'érosion de polymère par rapport à la diffusion de principe actif comme étant le principal mécanisme contrôlant la libération de principe actif, pour les deux formulations et les deux temps de résidence en milieu acide. Cependant, même si le mécanisme de libération peut être affecté, des concentrations d’α-amylase allant de 0 UI/L à 20000 UI/L n'ont pas eu d'incidence significative sur les profils de libération prolongée à partir de comprimés SD HASCA, indépendamment de la durée de séjour en milieu acide, le principe actif utilisé, la teneur en polymère et la différente composition de chaque formulation. Le travail présenté dans cette thèse démontre clairement l'utilité de SD HASCA en tant qu'un excipient à libération prolongée efficace.

Les protéines Staufen et leurs rôles dans la régulation posttranscriptionnelle de l’expression des gènes, la réponse aux dommages à l’ADN et le cycle cellulaire

Les différents mécanismes de régulation posttranscriptionnelle de l’expression des gènes sont de plus en plus reconnus comme des processus essentiels dans divers phénomènes physiologiques importants, comme la prolifération cellulaire et la réponse aux dommages à l’ADN. Deux des protéines impliquées dans ce type de régulation sont Staufen1 (Stau1) et Staufen2 (Stau2). Elles sont des protéines de liaison à l’ARN double brin qui contribuent au transport de l’ARN messager (ARNm), au contrôle de la traduction, à l’épissage alternatif et sont responsables de la dégradation de certains ARNm spécifiques. Les protéines Staufen peuvent en effet s’associer à des ARNm bien précis, d’autant plus que, majoritairement, Stau1 et Stau2 ne se retrouvent pas en complexe avec les mêmes cibles. De nombreuses évidences récentes montrent l’implication de divers mécanismes de régulation posttranscriptionnelle dans la réponse aux dommages à l’ADN, plusieurs protéines de liaison à l’ARN y participant d’ailleurs. De façon importante, cette réponse dicte un ou plusieurs destin(s) à la cellule qui doit réagir à la suite de dommages à l’intégrité de son ADN: réparation de l’ADN, arrêt de la prolifération cellulaire, apoptose. Nous avons donc fait l’hypothèse que l’expression de Stau1 et/ou de Stau2 pourrait être affectée en réponse à un stress génotoxique, ce qui pourrait avoir comme conséquence de moduler l’expression et/ou la stabilité de leurs ARNm cibles. De même, notre laboratoire a récemment observé que l’expression de Stau1 varie pendant le cycle cellulaire, celle-ci étant plus élevée jusqu’au début de la mitose (prométaphase), puis elle diminue alors que les cellules complètent leur division. Par conséquent, nous avons fait l’hypothèse que Stau1 pourrait lier des ARNm de façon différentielle dans des cellules bloquées en prométaphase et dans des cellules asynchrones. D’un côté, en employant la camptothécine (CPT), une drogue causant des dommages à l’ADN, pour traiter des cellules de la lignée de cancer colorectal HCT116, nous avons observé que seule l’expression de Stau2 est réduite de façon considérable, tant au niveau de la protéine que de l’ARNm. L’utilisation d’autres agents cytotoxiques a permis de confirmer cette observation initiale. De plus, nous avons constaté que l’expression de Stau2 est touchée même dans des conditions n’engendrant pas une réponse apoptotique, ce qui suggère que cette déplétion de Stau2 est possiblement importante pour la mise en place d’une réponse appropriée aux dommages à l’ADN. D’ailleurs, la surexpression de Stau2 conjointement avec le traitement à la CPT entraîne un retard dans l’induction de l’apoptose dans les cellules HCT116. Nous avons aussi montré que la diminution de l’expression de Stau2 est due à une régulation de sa transcription en réponse au stress génotoxique, ce pourquoi une région minimale du promoteur putatif de Stau2 est nécessaire. Également, nous avons identifié que le facteur de transcription E2F1, couramment impliqué dans la réponse aux dommages à l’ADN, peut contrôler l’expression de Stau2. Ainsi, E2F1 permet une augmentation de l’expression de Stau2 dans des cellules non traitées, mais cette hausse est abolie dans des cellules traitées à la CPT, ce qui suggère que la CPT pourrait agir en inhibant l’activation transcriptionnelle de Stau2 par E2F1. Enfin, nous avons observé que certains ARNm associés à Stau2, et codant pour des protéines impliquées dans la réponse aux dommages à l’ADN et l’apoptose, sont exprimés différemment dans des cellules traitées à la CPT et des cellules non traitées. D’un autre côté, nous avons identifié les ARNm associés à Stau1 lors de la prométaphase, alors que l’expression de Stau1 est à son niveau le plus élevé pendant le cycle cellulaire, grâce à une étude à grande échelle de micropuces d’ADN dans des cellules HEK293T. Nous avons par la suite confirmé l’association entre Stau1 et certains ARNm d’intérêts, donc codant pour des protéines impliquées dans la régulation de la prolifération cellulaire et/ou le déroulement de la mitose. Une comparaison de la liaison de ces ARNm à Stau1 dans des cellules bloquées en prométaphase par rapport à des cellules asynchrones nous a permis de constater une association préférentielle dans les cellules en prométaphase. Ceci suggère une augmentation potentielle de la régulation de ces ARNm par Stau1 à ce moment du cycle cellulaire. Les données présentées dans cette thèse indiquent vraisemblablement que la régulation posttranscriptionnelle de l’expression génique contrôlée par les protéines Staufen se fait en partie grâce à la modulation de l’expression de Stau1 et de Stau2 en fonction des conditions cellulaires. Nous envisageons alors que cette variation de l’expression des protéines Staufen ait des conséquences sur des sous-ensembles d’ARNm auxquels elles sont liées et que de cette façon, elles jouent un rôle pour réguler des processus physiologiques essentiels comme la réponse aux dommages à l’ADN et la progression dans le cycle cellulaire.

Métrologie de la douleur animale : validation sur des modèles de douleur viscérale bovine et articulaires canins

La douleur est une expérience multidimensionnelle comportant des aspects sensoriels, émotionnels et cognitifs. Théoriquement, des méthodes de mesures comportementales, physiologiques, neurophysiologiques et sensorielles peuvent quantifier la douleur. Peu d’études ont étudié la validation des mesures utilisées en médecine vétérinaire. La recherche combine les travaux de Maîtrise et de Doctorat, traite en partie de la validité de méthodes. Dans cet objectif, nos travaux de recherche étudiaient la validité de méthodes comportementales, physiologiques et neurophysiologiques usuelles pour la mesure de la douleur en comparant les expressions de douleur (vache et chien) chez des animaux contrôle par comparaison à des animaux sous analgésie préventive ou sous traitement curatif suivant une douleur induite par chirurgie (modèles de douleur viscérale bovine ou orthopédique canine) ou causée par une maladie naturelle (arthrose canine). Une première étude comparait les mesures de la douleur entre les vaches du groupe placebo et celles sous analgésie postopératoire sur une durée de 21 jours suivant l’induction d’une douleur viscérale chronique. Les vaches du groupe placebo ont présenté une plus forte sensibilité à la douleur et une diminution de la noradrénaline et de la transthyrétine mesurées dans le liquide cérébro-spinal, une diminution de l’activité motrice (AM) (moindre que dans les groupes avec analgésie), de l’agitation enregistrée par vidéo-analyse et une augmentation du stress selon la mesure de l’activité électrodermique (AED). Les méthodes d’intérêt identifiées étaient les marqueurs spinaux, la mesure de la sensibilisation, de comportements par vidéo-analyse et de l’AM par bio-télémétrie. En utilisant des méthodes semblables à celles précédemment décrites, deux études expérimentales de douleur orthopédique ont été réalisées afin de comparer les réponses à la douleur entre des chiens traités avec une analgésie préventive (opioïdes et anti-inflammatoires, étude #2) ou un biphosphonate (tiludronate, étude #3) par comparaison à des chiens contrôles. Seules les échelles de douleur étaient différentes entre les études de recherche. Pour l’étude #2, les ii chiens sous analgésie ont présenté de plus faibles scores de douleur mesurés avec l’échelle de douleur nommée 4A-VET et ceci simultanément à une faible réponse de l’AED une heure après la chirurgie de trochléoplastie. La fréquence du comportement spontané de ‘la marche avec plein appui de la patte opérée’ mesurée à l’aide de la vidéo-analyse augmentait chez les chiens sous analgésie préventive 24 heures après la chirurgie. L’étude #3 démontrait surtout l’apparition de sensibilisation centrale (à la fois par l’évaluation sensorielle quantitative et les marqueurs spinaux) chez les chiens contrôle, 56 jours après l’induction d’arthrose chirurgicale. Ainsi, les chiens traités avec le tiludronate ont présenté une différence sur la substance P et la transthyrétine cérébro-spinale, une diminution de la sensibilisation périphérique, plus d’appui de la patte opérée lors de la marche selon la mesure du pic de force verticale (PFV), une augmentation de la fréquence de ‘la marche avec plein appui de la patte opérée’. La sensibilisation centrale était associée à la diminution de PFV, et une augmentation de l’AED et du comportement spontané de ‘la marche avec plein appui de la patte opérée’. Pour l’étude #4, la validité et la sensibilité des méthodes ont été évaluées dans une condition d’arthrose naturelle chez des chiens traités avec une diète enrichie en moule verte, un produit ayant des effets anti-inflammatoires et chondroprotecteurs attendus. Les chiens traités présentaient une diminution des scores de douleur via l’échelle nommée CSOM, une augmentation de PFV et une augmentation de l’AM. Dans l’ensemble, les résultats confirment que la vidéo-analyse évaluait la douleur de façon objective et pour des modèles différents de douleur et les marqueurs spinaux sont prometteurs. Le PFV était spécifique de la douleur orthopédique. La sensibilisation était présente lors de douleur pathologique. L’AED n’est pas valide pour la mesure de la douleur. La baisse d’AM suggèrerait un comportement de douleur. Les études étaient exploratoires pour les échelles de douleur en raison de leur niveau (débutant) de développement et du manque d’informations sur les qualités métrologiques de ces mesures.

The regulatory roles of APE1 and Prdx1 interaction

L’apurinic/apyrimidic endonuclease 1 (APE1) est une protéine multifonctionnelle qui joue un rôle important dans la voie de réparation de l’ADN par excision de base. Elle sert également de coactivateur de transcription et est aussi impliquée dans le métabolisme de l’ARN et la régulation redox. APE1 peut cliver les sites AP ainsi que retirer des groupements, sur des extrémités 3’ créées suite à des bris simple brin, qui bloquent les autres enzymes de réparation, permettant de poursuivre la réparation de l’ADN, puisqu’elle possède plusieurs activités de réparation de l’ADN comme une activité phosphodiestérase 3’ et une activité exonucléase 3’→5’. Les cellules de mammifères ayant subi un knockdown d’APE1 présentent une grande sensibilité face à de nombreux agents génotoxiques. APE1 ne possède qu’une seule cystéine située au 65e acide aminé. Celle-ci est nécessaire pour maintenir l’état de réduction de nombreux activateurs de transcription tels que p53, NF-κB, AP-1, c-Jun at c-Fos. Ainsi, elle se retrouve impliquée dans la régulation de l’expression génique. APE1 passe également à travers au moins 4 types de modifications post-traductionnelles : l’acétylation, la désacétylation, la phosphorylation et l’ubiquitylation. La façon dont APE1 est recrutée pour accomplir ses différentes fonctions biologiques demeure un mystère, bien que cela puisse être relié à sa capacité d’interaction avec de multiples partenaires différents. Sous des conditions de croissance normales, il a été démontré qu’APE1 interagit avec de nombreux partenaires impliqués dans de multiples fonctions. Nous émettons l’hypothèse que l’état d’oxydation d’APE1 est ce qui contrôle les partenaires avec lesquels la protéine interagira, lui permettant d’accomplir des fonctions précises. Dans cette étude nous démontrons que le peroxyde d’hydrogène altère le réseau d’interactions d’APE1. Un nouveau partenaire d’interaction d’APE1, Prdx1, un membre de la famille des peroxirédoxines responsable de récupérer le peroxyde d’hydrogène, est caractérisé. Nous démontrons qu’un knockdown de Prdx1 n’affecte pas l’activité de réparation de l’ADN d’APE1, mais altère sa détection et sa distribution cellulaire à l’intérieur des cellules HepG2 conduisant à une induction accrue de l’interleukine 8 (IL-8). L’IL8 est une chimiokine impliquée dans le stress cellulaire en conditions physiologiques et en cas de stress oxydatif. Il a été démontré que l’induction de l’IL-8 est dépendante d’APE1 indiquant que Prdx1 pourrait réguler l’activité transcriptionnelle d’APE1. Il a été découvert que Prdx1 est impliquée dans la régulation redox suite à une réponse initiée par le peroxyde d’hydrogène. Ce dernier possède un rôle important comme molécule de signalisation dans de nombreux processus biologiques. Nous montrons que Prdx1 est nécessaire pour réduire APE1 dans le cytoplasme en réponse à la présence de H2O2. En présence de Prdx1, la fraction d’APE1 présent dans le cytoplasme est réduite suite à une exposition au peroxyde d’hydrogène, et Prdx1 est hyperoxydé suite à l’interaction entre les deux molécules. Cela suggère que le signal, que produit le peroxyde d’hydrogène, sur APE1 passe par Prdx1. Un knockdown d’APE1 diminue la conversion de la forme dimérique de Prdx1 vers la forme monomérique. Cette observation implique qu’APE1 pourrait être impliquée dans la régulation de l’activité catalytique de Prdx1 en accélérant son hyperoxydation.

Rôle du TLR2 dans l’hépatite fulminante induite par le virus de l’hépatite murine

Ce travail examine les mécanismes de l’immunité innée impliqués dans l’hépatite aiguë virale du modèle murin d’infection par le virus de l’hépatite virale murine de type 3 (MHV-3). Afin de déterminer le rôle du TLR2 dans l’aggravation de l’hépatite, des infections avec le virus MHV-3 ont été réalisées in vivo chez des souris C57BL/6 et des souris déficientes pour le gène tlr2 et in vitro dans des macrophages et des hépatocytes infectés avec le virus MHV-3 et le virus moins virulent MHV-A59. Les niveaux de transcription et de traduction des senseurs microbiens, des interférons (IFN) de type I, des cytokines et/ou des chimiokines ont été évalués par qRT-PCR et ELISA. Les cellules ont été traitées avec des petits ARNs interférants (siRNAs) pour le TLR2 et le CEACAM1a ou mises en présence d’inhibiteurs des voies d’endocytose. Les résultats révèlent le rôle stimulateur du TLR2 pour la réplication virale, la production de cytokines pro-inflammatoires IL-6 et TNF-α et des chimiokines CXCL1, CXCL10 et CCL2. Un nouveau mécanisme d’échappement aux senseurs viraux dépendant du TLR2 a également été mis en évidence dans les macrophages et les hépatocytes lors de l’infection de ces cellules avec le virus MHV-3, et non pas avec le virus moins virulent MHV-A59. Ces différents travaux révèlent un nouveau rôle du TLR2 lors d’infections virales dans l'aggravation de la réponse inflammatoire tout en protégeant le virus des autres senseurs de la réponse immune innée.

L’entérotoxine STb d’Escherichia coli déloge la claudine-1 des jonctions serrées

Escherichia coli produit diverses entérotoxines thermolabiles et thermostables. STb est une toxine de faible poids moléculaire résistant à la chaleur chargée de la diarrhée chez les animaux de la ferme. Une étude antérieure a montré que les cellules ayant internalisé la toxine STb provoquent un dysfonctionnement de la barrière épithéliale par des changements dans les protéines des jonctions serrées (TJ). Ces modifications contribuent probablement à la diarrhée observée. Pour mieux comprendre le mécanisme de l'augmentation de la perméabilité intestinale, nous avons traité les cellules du côlon humain (T84) avec la toxine purifiée STb une fois que les cellules ont été récoltées et les protéines extraites. Après l'utilisation d'une solution contenant 1% de Nonidet P-40 (un détergent non dénaturant, non ionique), nous avons étudié la distribution de la claudine -1, une protéine majeure des TJs, responsable de l'imperméabilité de l'épithélium, entre la membrane (NP40-insoluble) et le cytoplasme (NP40-soluble). En utilisant l’immunoblot et la microscopie confocale, nous avons observé que le traitement des monocouches de cellules T84 avec STb induit la redistribution de la claudine-1. Après 24h, les cellules cultivées en milieu faible en Ca+ (5 uM) et traitées par STb, ont montré qu’environ 40 % de plus de la claudine-1 se sont délogées dans le cytoplasme par comparaison au contrôle. En passant d’un milieu faible à un milieu contenant des quantités physiologiques de Ca++ (1,8 mM) nous avons observé une augmentation du taux de claudine- 1 délogé, comme la délocalisation comparable et ce, après 6h. Un milieu supplémenté avec la même concentration de Mg++ ou Zn++ n'a pas affecté le taux de délogement comparé au milieu contenant une faible teneur en Ca++. En utilisant des anticorps anti-phosphosérine et anti-phosphothréonine, nous avons observé que la perte des claudines-1 de la membrane a été accompagnée par une déphosphorylation de cette protéine des TJs. Dans l'ensemble, nos résultats ont montré une importante redistribution de la claudine-1 dans les cellules traitées par la toxine STb. La perte de la claudine-1 phosphorylée de la membrane est susceptible d'être impliquée dans la perméabilité accrue observée. Les mécanismes par lesquels ces changements sont provoqués restent à élucider.

Performer ... sans anxiété : programme d'intervention pour réduire l'anxiété de performance en milieu scolaire

Rapport d'analyse d'intervention présenté à la Faculté des arts et sciences en vue de l'obtention du grade de Maîtrise ès sciences (M. Sc.) en psychoéducation.

Analyse de l'effet de la contamination du sol sur la croissance et la physiologie de 11 cultivars de Salix

Mon mémoire de maîtrise a été réalisé dans le cadre du projet Génorem (www.genorem.ca), un projet multidisciplinaire qui réunit différents chercheurs de l'Université de Montréal et de l'Université McGill dans le but d'améliorer les techniques utilisées en bioremédiation. Dans le cadre de l'étude, des saules à croissance rapide (Salix sp.) ont été utilisés comme plantes modèles dans l'étude. Ainsi, 11 cultivars de saule ont été suivis afin de déterminer leur potentiel à produire un bon rendement de biomasse, à tolérer des conditions de stress sévère causé par la présence de HAPs (hydrocarbures aromatiques polycycliques) , BPCs (biphényles polychlorés) et d'hydrocarbures pétroliers C10-C50. L'expérimentation consistait en une plantation de saule à forte densité qui a été mise en place en 2011 sur le site d'une ancienne industrie de pétrochimie à Varennes, dans le sud du Québec. Les boutures des génotypes sélectionnés ont été plantées sur une superficie d'environ 5000 m2. Les plantes ont été suivies pendant les deux saisons de croissance suivant le recépage et une série de paramètres de croissance et de mesures physiologiques ont été récoltés (surface foliaire, taux de chlorophylle, conductance stomatique et statut nutritionnel) dans le but d'évaluer et de comparer les performances de chaque génotype sur un sol pollué. Les analyses statistiques ont démontré que le cultivar S. miyabeana (SX61) était le meilleur producteur de biomasse sur le site contaminé, tandis que S. nigra (S05) et S. acutifolia (S54) présentaient la meilleure capacité photosynthétique. S. dasyclados (SV1), S. purpurea (‘Fish Creek’) et S. caprea (S365) ont semblé particulièrement affectés par la présence de contaminants. La capacité d'établissement et la croissance de S. nigra (S05), S. eriocephala (S25) and S. purpurea x S. miyabeana (‘Millbrook’) indiquent une tolérance globale supérieure à la pollution . Cette analyse comparative des différentes réponses physiologiques des saules cultivés sur un sol contaminé pourra guider le processus de sélection de plantes et les techniques de bioremédiation dans les futurs projets de phytoremédiation.

Histone H2B-R95A mutant identifies the pheromone pathway that signals cell cycle arrest during rapamycin response

La rapamycine est un immunosuppresseur utilisé pour traiter plusieurs types de maladies dont le cancer du rein. Son fonctionnement par l’inhibition de la voie de Tor mène à des changements dans des processus physiologiques, incluant le cycle cellulaire. Chez Saccharomyces cerevisiae, la rapamycine conduit à une altération rapide et globale de l’expression génique, déclenchant un remodelage de la chromatine. Nous proposons que les modifications des histones peuvent jouer un rôle crucial dans le remodelage de la chromatine en réponse à la rapamycine. Notre objectif principal est d’identifier d’une banque de mutants d’histone les variantes qui vont échouer à répondre à la rapamycine dans une tentative de réaliser une caractérisation des modifications d’histone critiques pour la réponse à cette drogue. Ainsi, nous avons réalisé un criblage d’une banque de mutants d’histone et identifié plusieurs mutants d‘histone dont la résistance à la rapamycine a été altérée. Nous avons caractérisé une de ces variantes d’histone, à savoir H2B, qui porte une substitution de l’alanine en arginine en position 95 (H2B-R95A) et démontré que ce mutant est extrêmement résistant à la rapamycine, et non à d’autres drogues. Des immunoprécipitations ont démontré que H2B-R95A est défectueux pour former un complexe avec Spt16, un facteur essentiel pour la dissociation de H2A et H2B de la chromatine, permetant la réplication et la transcription par les ADN et ARN polymérases, respectivement. Des expériences de ChIP-Chip et de micropuce ont démontré que l’arginine 95 de H2B est requise pour recruter Spt16 afin de permettre l’expression d’une multitude de gènes, dont certains font partie de la voie des phéromones. Des évidences seront présentées pour la première fois démontrant que la rapamycine peut activer la voie des phéromones et qu’une défectuosité dans cette voie cause la résistante à cette drogue.

Influence du microenvironnement inflammatoire sur la sénescence contrôlée par la réponse aux dommages à l'ADN, et sa régulation par l’induction du stress à la chromatine

La sénescence cellulaire, ou l’arrêt irréversible de la prolifération, influence des processus physiologiques et pathologiques, comme le cancer. Parmi les caractéristiques de la sénescence, se retrouve le PSAS ou phénotype sécrétoire associé à la sénescence. Le PSAS est composé d’une variété de cytokines, facteurs de croissance et protéases. Ses actions pro- et anti-tumorale sont connues, mais l’on ignore laquelle prédomine. Mes travaux s’attardent aux effets du PSAS sur l’induction de la sénescence dans les cellules environnantes et à sa régulation. Nous avons démontré que le PSAS ne synergise pas avec la dysfonction télomérique chronique ou aigue, afin de causer un arrêt de croissance. Également, l’étude du mécanisme responsable de l’induction de la sénescence par stress à la chromatine, suggère que la kinase c-Abl n’est pas requise pour cette voie, contrairement à des publications antérieures. Mes travaux éclairent les mécanismes d’action et la régulation du PSAS dans la sénescence induite par dysfonction télomérique et par stress à la chromatine.