L’étude des stratégies de séparations préparatrices de protéines par électrophorèse capillaire

La protéomique est un sujet d'intérêt puisque l'étude des fonctions et des structures de protéines est essentiel à la compréhension du fonctionnement d'un organisme donné. Ce projet se situe dans la catégorie des études structurales, ou plus précisément, la séquence primaire en acides aminés pour l’identification d’une protéine. La détermination des protéines commence par l'extraction d'un mélange protéique issu d'un tissu ou d'un fluide biologique pouvant contenir plus de 1000 protéines différentes. Ensuite, des techniques analytiques comme l’électrophorèse en gel polyacrylamide en deux dimensions (2D-SDS-PAGE), qui visent à séparer ce mélange en fonction du point isoélectrique et de la masse molaire des protéines, sont utilisées pour isoler les protéines et pour permettre leur identification par chromatographie liquide and spectrométrie de masse (MS), typiquement. Ce projet s'inspire de ce processus et propose que l'étape de fractionnement de l'extrait protéique avec la 2D-SDS-PAGE soit remplacé ou supporté par de multiples fractionnements en parallèle par électrophorèse capillaire (CE) quasi-multidimensionnelle. Les fractions obtenues, contenant une protéine seule ou un mélange de protéines moins complexe que l’extrait du départ, pourraient ensuite être soumises à des identifications de protéines par cartographie peptidique et cartographie protéique à l’aide des techniques de séparations analytiques et de la MS. Pour obtenir la carte peptidique d'un échantillon, il est nécessaire de procéder à la protéolyse enzymatique ou chimique des protéines purifiées et de séparer les fragments peptidiques issus de cette digestion. Les cartes peptidiques ainsi générées peuvent ensuite être comparées à des échantillons témoins ou les masses exactes des peptides enzymatiques sont soumises à des moteurs de recherche comme MASCOT™, ce qui permet l’identification des protéines en interrogeant les bases de données génomiques. Les avantages exploitables de la CE, par rapport à la 2D-SDS-PAGE, sont sa haute efficacité de séparation, sa rapidité d'analyse et sa facilité d'automatisation. L’un des défis à surmonter est la faible quantité de masse de protéines disponible après analyses en CE, due partiellement à l'adsorption des protéines sur la paroi du capillaire, mais due majoritairement au faible volume d'échantillon en CE. Pour augmenter ce volume, un capillaire de 75 µm était utilisé. Aussi, le volume de la fraction collectée était diminué de 1000 à 100 µL et les fractions étaient accumulées 10 fois; c’est-à-dire que 10 produits de séparations étaient contenu dans chaque fraction. D'un autre côté, l'adsorption de protéines se traduit par la variation de l'aire d'un pic et du temps de migration d'une protéine donnée ce qui influence la reproductibilité de la séparation, un aspect très important puisque 10 séparations cumulatives sont nécessaires pour la collecte de fractions. De nombreuses approches existent pour diminuer ce problème (e.g. les extrêmes de pH de l’électrolyte de fond, les revêtements dynamique ou permanent du capillaire, etc.), mais dans ce mémoire, les études de revêtement portaient sur le bromure de N,N-didodecyl-N,N-dimethylammonium (DDAB), un surfactant qui forme un revêtement semi-permanent sur la paroi du capillaire. La grande majorité du mémoire visait à obtenir une séparation reproductible d'un mélange protéique standard préparé en laboratoire (contenant l’albumine de sérum de bovin, l'anhydrase carbonique, l’α-lactalbumine et la β-lactoglobulin) par CE avec le revêtement DDAB. Les études portées sur le revêtement montraient qu'il était nécessaire de régénérer le revêtement entre chaque injection du mélange de protéines dans les conditions étudiées : la collecte de 5 fractions de 6 min chacune à travers une séparation de 30 min, suivant le processus de régénération du DDAB, et tout ça répété 10 fois. Cependant, l’analyse en CE-UV et en HPLC-MS des fractions collectées ne montraient pas les protéines attendues puisqu'elles semblaient être en-dessous de la limite de détection. De plus, une analyse en MS montrait que le DDAB s’accumule dans les fractions collectées dû à sa désorption de la paroi du capillaire. Pour confirmer que les efforts pour recueillir une quantité de masse de protéine étaient suffisants, la méthode de CE avec détection par fluorescence induite par laser (CE-LIF) était utilisée pour séparer et collecter la protéine, albumine marquée de fluorescéine isothiocyanate (FITC), sans l'utilisation du revêtement DDAB. Ces analyses montraient que l'albumine-FITC était, en fait, présente dans la fraction collecté. La cartographie peptidique a été ensuite réalisée avec succès en employant l’enzyme chymotrypsine pour la digestion et CE-LIF pour obtenir la carte peptidique.

Étude d'un nouveau facteur impliqué dans la biosynthèse de la paroi bactérienne : le facteur ElyC

La résistance bactérienne aux antibiotiques est de nos jours une préoccupation majeure aux acteurs du monde de la santé publique. L’identification de nouvelles cibles bactériennes en vue de développer de nouveaux antibiotiques est donc nécessaire. La paroi bactérienne est une bonne cible car l’inhibition de sa biosynthèse cause la mort des bactéries. De récents travaux de notre laboratoire ont identifié de nombreux nouveaux facteurs importants pour la biosynthèse de la paroi chez Escherichia coli. L’un de ces facteurs renommé ElyC a un domaine DUF218 extrêmement conservé à travers les espèces bactériennes. L’absence du gène elyC entraîne la lyse bactérienne à température pièce. Des études bioinformatiques indiquent qu’ElyC est une protéine membranaire avec deux domaines transmembranaires et un domaine conservé DUF218 de fonction inconnue. Étant donné que les protéines agissent souvent en complexes, nous avons émis l’hypothèse qu’ElyC interagit avec d’autres protéines afin d'exécuter sa fonction biologique. Le but de mon projet est de déterminer la topologie d’ElyC et d’identifier ses partenaires protéiques. L’étude de la topologie a été faite par l’essai de modification de cystéine sur des souches exprimant individuellement le facteur ElyC avec un résidu cystéine en position N-terminale, dans la boucle ou en position C-terminale. Les partenaires protéiques d’ElyC ont été isolés par immuno-précipitation et identifiés par spectrométrie de masse. Les résultats obtenus ont révélé qu’ElyC est une protéine membranaire chez E. coli et est impliquée dans l'assemblage de l'enveloppe bactérienne, dans la chaîne de transport d'électrons et la phosphorylation oxydative. Ils ont permis aussi de confirmer l’existence d’un lien entre ElyC et le stress oxydatif. Cependant les résultats pour la détermination de la topologie restent à être clarifiés.

Développement d’une méthode SPRi-MALDI-IMS pour la quantification et l’identification des protéines dans des empreintes de tissus biologiques

Plusieurs tests médicaux, comme celui du dépistage du cancer du sein, se basent sur l’observation de section tissulaire sous un microscope. Ces tests se basent sur l’interprétation d’un spécialiste et les résultats peuvent varier d’un expert à un autre dû la subjectivité des observations. L’utilisation d’une technique analytique offrant une quantification et une identification de cibles moléculaires dans une section tissulaire permettrait aux experts de produire des diagnostics plus objectifs et diminuerait possiblement le nombre de faux diagnostics. Les travaux présentés dans ce mémoire portent sur le développement d’une technique SPRi-MALDI-IMS permettant l’imagerie en deux dimensions de protéines contenues dans une section tissulaire. La MALDI-IMS est la technique de choix pour l’imagerie de biomolécules dans les sections tissulaires. Par contre, elle ne parvient pas à elle seule à quantifier de façon absolue le matériel adsorbé à la surface. Donc, le couplage de la MALDI-IMS avec la SPRi permet la quantification absolue de protéines en deux dimensions et crée une technique répondant aux besoins des experts médicaux. Pour ce faire, nous avons étudié, l’effet de la chimie de surface sur la nature et la quantité de matériel adsorbé à la surface du capteur. De plus, la cinétique de transfert des protéines du tissu vers le capteur a dû être optimisée afin de produire des empreintes correspondant au tissu d’origine, afin d’atteindre la gamme dynamique des instruments SPRi et MALDI-IMS. La technique résultante de ces optimisations permet d’obtenir les premières images quantitatives et qualitatives de protéines en deux dimensions d’une seule section tissulaire.

Association entre les produits issus de la dégradation de la vitamine C, dépendante du H₂O₂, et le métabolisme des lipides hépatiques

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Régulation de la MAPK atypique ERK3 par le système ubiquitine-protéasome

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Rôles de deux corécepteurs impliqués dans le maintien des cellules T mémoires CD8+ et la maturation des cellules dendritiques

La reconnaissance d’un antigène présenté par les cellules présentatrices d’antigène induit la prolifération et la différenciation des lymphocytes T naïfs en lymphocytes T effecteurs et mémoires. Cette reconnaissance se fait par l’interaction du récepteur des cellules T (TCR) des lymphocytes T et le complexe CMH-peptide présent à la surface des DC. Cependant, des signaux additionnels sont requis, une meilleure activation des lymphocytes T implique des corécepteurs présents à la surface de ces deux types cellulaires. Après l’élimination de l’antigène, la plupart des lymphocytes T effecteurs vont mourir. Une petite population de lymphocytes T va persister pour se différencier en lymphocytes T mémoires capables de protéger l’organisme contre une réinfection. Les signaux qui contrôlent le maintien des lymphocytes T mémoires sont encore mal compris. Pour comprendre le rôle de la molécule de costimulation 4-1BB dans le maintien des lymphocytes T CD8 mémoires, nous avons émis l’hypothèse que l’état de phosphorylation de la protéine adaptatrice TRAF1, qui se lie à 4-1BB, module le maintien des lymphocytes T CD8 mémoires. Ainsi, nous avons montré par des expériences de spectrométrie de masse que TRAF1 s’associe préférentiellement à TBK1 lorsqu’elle n’est pas phosphorylée. Nous avons aussi montré que la présence de TRAF1 est requise pour stabiliser TBK1 au récepteur 4-1BB après stimulation des lymphocytes T. Par ailleurs, les lymphocytes T CD8 OT-I TRAF1-/- reconstituées avec un mutant phospho-déficient de TRAF1 (S139A) et ensuite différenciées en lymphocytes T mémoires in vitro induisent une activation de la voie de signalisation NF-ĸB contrairement à ceux exprimant la forme phospho-mimétique de TRAF1 (S139D). Ces premières études démontrent l’importance de l’état de phosphorylation de TRAF1 en aval de 4-1BB dans les cellules T. Dans la seconde partie, nous avons évalué le rôle d’un autre corécepteur; la neuropiline 1, dans la maturation des DC. A cet effet, nous avons émis l’hypothèse que l’interaction de la neuropiline 1 et ses ligands contribuerait à la fonction des DC. Nous avons démontré que l’absence de la neuropiline 1 n’a pas d’effet sur la maturation au LPS des DC. Cependant, la présence du VEGF (un ligand de Nrp-1) inhibe la maturation des DC dérivées de la moelle osseuse. Notre étude a démontré que VEGF inhibe l’expression des molécules de costimulation, la sécrétion des cytokines pro inflammatoires et la signalisation TLR4 principalement les voies MAP Kinase et NF-ĸB. Contrairement aux résultats avec les cellules WT, VEGF n’est pas capable d’affecter la maturation, la sécrétion des cytokines et la signalisation TLR4 des DC Nrp1-Lyz où la neuropiline 1 est délétée. Ainsi, nos résultats ont démontré que VEGF inhibe la maturation des DC de façon Nrp1-dépendante. Enfin, l’analyse des molécules partenaires de la neuropiline 1 montre que Nrp1, VEGF et TLR4 se retrouvent dans le même complexe. Nos résultats démontrent que VEGF, en présence de la neuropiline 1 est capable d’interagir avec TLR4 pour inhiber la maturation des DC. Toutefois, en absence de la neuropiline1, VEGF n’est pas capable de recruter TLR4 pour réduire l’expression des molécules de costimulation. Ces études sur les corécepteurs pourraient être importantes dans l’élaboration de nouvelles approches vaccinales.

Création de mutants cdc5 en vue de l’identification des substrats de PLK/Cdc5 lors de la réponse d’adaptation aux dommages à l’ADN.

Les kinases de la famille Polo (PLK) jouent un rôle majeur durant le cycle cellulaire, notamment en promouvant des processus essentiels tels que l’entrée en phase M et la sortie du cycle cellulaire. Elles sont également impliquées dans plusieurs cancers et ont un fort pouvoir tumorigène. Notre laboratoire a récemment montré que Cdc5 (la kinase PLK chez Saccharomyces cerevisiae) est également nécessaire pour l'adaptation aux dommages à l'ADN, et que la cible critique de Cdc5 au cours de ce processus pourrait être une cible peu conventionnelle localisée aux centrosomes de levures. Dans le but d’identifier ce substrat, une analyse intégrale du phosphoprotéome de PLK/Cdc5 par spectrométrie de masse devra être réalisée. Pour ce faire, un allèle CDC5 sensible à la température, c’est-à-dire une version mutante qui devient inactive à température élevée, devra être utilisée. Cet allèle devra être thermosensible à 30°C, afin de s’assurer qu’il sera le seul à être inactivé à cette température et que, par conséquent, seuls les substrats de Cdc5 seront identifiés. À cet effet, nous avons généré deux allèles cdc5 thermosensibles à 30°C : cdc5-17 et cdc5-18, puis analysé leur cycle cellulaire à 32°C. Les résultats de cette analyse ont montré que l’exposition des cellules à 32°C résulte en leur blocage en fin de mitose sous la forme bourgeonnée, témoignant d’un défaut dans la promotion de la sortie de la mitose. Ce défaut est causé par la mutation du gène CDC5 dont la protéine favorise la sortie de la mitose via deux voies : la voie du MEN (Mitotic Exit Network) et la voie du FEAR (Cdc Fourteen Early Anaphase Release). cdc5-17 et cdc5-18 représentent des outils biologiques précieux qui permettront de mieux analyser le phosphoprotéome de PLK/Cdc5 et de mener à l’identification des cibles de Cdc5 lors de la réponse d’adaptation aux dommages à l’ADN. Étant donné que l’adaptation aux dommages à l’ADN causés par des chimiothérapies représente l’un des facteurs permettant la prolifération des tumeurs cancéreuses, cette découverte serait un grand pas dans la lutte contre le cancer.

Origine de la réduction de la durée de vie des photoporteurs dans le InGaAsP implanté à basse température

Un matériau semi-conducteur utilisé lors de la fabrication d’antennes térahertz (THz), le quaternaire InGaAsP (E_g = 0,79 eV), subit une implantation ionique de Fe suivi d’un recuit thermique rapide (RTA) dans le but d’améliorer ses propriétés d’émission. Le recuit est nécessaire afin de recristalliser la couche amorphisée lors de l’implantation, donnant lieu à un polycristal rempli de défauts de recristallisation. On constate cependant que les matériaux implantés Fe offrent de meilleures performances que ceux simplement endommagés au Ga. Dans le but de départager l’effet des défauts de recristallisation et des impuretés de Fe, des mesures de spectroscopie transitoire des niveaux profonds (DLTS) et de DLTS en courant (I-DLTS), ainsi que de spectrométrie de masse d’ions secondaires par temps de vol (ToF-SIMS) ont été effectuées sur des échantillons non implantés et d’autres recristallisés. Les mesures DLTS et I-DLTS ont pour but de caractériser les niveaux profonds générés par ces deux procédures postcroissance, tout en identifiant le rôle que jouent les impuretés de Fe sur la formation de ces niveaux profonds. De plus, le voisinage des atomes de Fe dans le matériau recristallisé a été étudié à l’aide des mesures ToF-SIMS. Les mesures DLTS sur matériau recristallisé sont peu concluantes, car la mesure de capacité est faussée par la haute résistivité du matériau. Par contre, les mesures I-DLTS sur matériau recristallisé ont permis de conclure que les impuretés de Fe sont responsables de la formation d’une grande variété de niveaux d’énergie se trouvant entre 0,25 et 0,40 eV, alors que les défauts de structure induisent des niveaux de moins de 0,25 eV. La concentration de Fe est élevée par rapport au seuil de solubilité du Fe dans le matériau recristallisé. Il serait donc plausible que des agrégats de Fe se forment. Toutefois, cette hypothèse est infirmée par l'absence de pic aux masses correspondant à la molécule ^(56)Fe_2^+ sur les spectres ToF-SIMS. De plus, un modèle simple est utilisé afin d’estimer si certaines masses présentes sur les spectres ToF-SIMS correspondent à des liaisons non induites par la mesure dans le matériau recristallisé. Bien qu’aucune liaison avec le Ga et l'As n’est détectable, ce modèle n’exclut pas la possibilité de liens préférentiels avec l’In.

Contamination des solutions d’hyper-alimentation intraveineuses (HAIV) néonatales, effet de l’ascorbylperoxyde au foie

Introduction : Chez les nouveau-nés prématurés, l’hyper-alimentation intraveineuse (HAIV) contribue à leur survie, mais elle est aussi une source importante de molécules oxydantes. L’absence d’une protection adéquate contre la lumière ambiante génère in vitro, via la photo-excitation de la riboflavine, du H2O2, des peroxydes organiques et un dérivé peroxydé de la vitamine C, l’ascorbylperoxyde (AscOOH). Plusieurs données du laboratoire associent l’infusion d’HAIV à des désordres lipidiques dans notre modèle animal. L’hypothèse est donc que l’AscOOH a un pouvoir oxydant et est responsable de certains des effets biologiques observés. Mes objectifs sont les suivants : 1) développer une méthode de dosage de l’AscOOH; 2) démontrer, à l’aide du modèle animal bien établi au laboratoire, des relations entre la concentration tissulaire de cette molécule et des paramètres métaboliques et l’état redox au foie et dans la circulation; et 3) confirmer l’effet physiologique de l’AscOOH dans un modèle cellulaire. Méthode : Différents étalons internes potentiels ont été testés pour le dosage de l’AscOOH par spectrométrie de masse après séparation sur HPLC (LC-MS). Les phases mobiles et conditions chromatographiques ont été optimisées. Pour l’objectif 2, des cobayes de 3 jours de vie (n=11) ont reçu par voie intraveineuse une dose d’AscOOH (entre 0 et 3,3mM). Les animaux ont été sacrifiés au 4e jour de traitement pour le prélèvement de tissus. Les concentrations tissulaires d’AscOOH ont été déterminées au LC-MS. La triglycéridémie et la cholestérolémie ont été mesurées à l’aide d’un kit commercial par spectrophotométrie. Le glutathion oxydé et réduit ont été mesurés par électrophorèse capillaire. Les relations linéaires obtenues sont exprimées par le ratio des carrés (r2), et traitées par ANOVA. Résultats : La validation du dosage de l’AscOOH par LC-MS a été réalisée. Chez les animaux, la concentration urinaire d’AscOOH par créatinine corrèle positivement avec la dose reçue, négativement avec la lipidémie, et négativement avec le redox sanguin et érythrocytaire, indiquant un milieu moins oxydé. Conclusion : La concentration urinaire d’AscOOH peut donc être un reflet de l’oxydation de l’HAIV en clinique. Nos données chez l’animal suggèrent une interaction de l’AscOOH avec le métabolisme hépatique produisant une chute de la concentration plasmatique de cholestérol et de triglycérides. Le modèle cellulaire n’a pas permis d’élucider le mécanisme moléculaire de l’action de l’AscOOH sur le métabolisme.

Portrait du journalisme à la pige à l’heure de la convergence

Cette recherche explore le journalisme indépendant dans le contexte contemporain de convergences socio-techno-médiatiques. Je questionne ici l’existence d’un lien entre les pratiques de pige et de convergence en journalisme et son apport dans le développement de l’univers journalistique. Il s’agit d’une étude exploratoire et empirique, consacrée aux expériences des journalistes indépendants et développée autour des concepts de tactique, résistance, liberté et gouvernance. J’ai constitué ainsi un cadre théorique à partir de l’articulation théorique de Michel Foucault relative au pouvoir. Je défends l’idée selon laquelle la pige et la convergence en journalisme sont chacun des mouvements libres qui coexistent et qui, ensemble, constituent une force motrice pour le dispositif de pouvoir que le journalisme représente dans un système démocratique avancé. La liberté de mouvement des journalistes indépendants leur permet de mener plus loin le journalisme dans le contexte actuel de convergences et d’augmenter l’horizon d’applicabilité de ce domaine de la communication de masse.

Modification d'acides biliaires à l'aide de polymères pour en moduler les propriétés d'agrégation

Les polymères amphiphiles sont largement utilisés pour les applications biomédicales et pharmaceutiques. Afin d’améliorer les chances de biocompatibilité des nouveaux polymères que nous voulons développer, nous avons utilisé des composés naturels, les acides biliaires, comme produits de départ dans la synthèse de ces polymères. De nouveaux polymères anioniques amphiphiles dérivés de l’acide cholique ont été préparés par polymérisation radicalaire par transfert d’atomes. Par un contrôle rigoureux des conditions de polymérisation, des bras de poly(acide acrylique) de différentes longueurs ont été greffés sur le squelette de l’acide cholique. L’architecture moléculaire des polymères a été étudiée par spectroscopie 1H RMN et par spectrométrie de masse. Ces polymères en étoile formés par l’acide biliaire modifié sont capables de s’agréger dans l’eau même si les groupements hydroxyles ont été remplacés par des segments plus volumineux. Il a été observé que les liaisons ester entre le polymère et le cœur d’acide cholique sont sensibles à l’hydrolyse en solution aqueuse. Pour remédier au problème de stabilité en solution aqueuse et pour avoir, en même temps, des bras hydrophiles non ioniques et biocompatibles, de l’oxyde d’éthylène a été polymérisé sur l’acide cholique par polymérisation anionique. Les liaisons éther formées entre le polymère et les groupements hydroxyles de l’acide biliaire sont plus stables que les liaisons ester sur le polymère de poly(acide acrylique). Les conditions de réaction de la polymérisation anionique ont été optimisées et ont donné des polymères aux architectures et aux masses molaires contrôlées. Les nouveaux polymères forment des agrégats sphériques tel qu’observé par microscopie électronique à transmission avec des échantillons préparés par la méthode de fracture à froid. Leur morphologie est différente de celle des agrégats cylindriques formés par les acides biliaires. Avec la méthode optimisée pour la polymérisation anionique, l’éther d’allyle et glycidyle a été polymérisé sur un dérivé d’acide cholique, suivi par une thiolation des liaisons doubles pour introduire l’amine ou l’acide sur la chaîne polymère. Cette addition radicalaire est efficace à plus de 90%. Les polymères qui en résultent sont solubles dans l’eau et s’agrègent à une certaine concentration critique. Il est particulièrement intéressant d’observer la thermosensibilité des polymères ayant des groupements amine, laquelle peut être modulée en acétylant partiellement les amines, donnant des points nuages entre 15 et 48°C.

« Tomorrow Belongs To Me » : représentations de la femme dans une ballade suprémaciste blanche

La version intégrale de ce mémoire est disponible uniquement pour consultation individuelle à la Bibliothèque de musique de l’Université de Montréal (www.bib.umontreal.ca/MU).

Analytical strategies for the comprehensive profiling of histone post translational modifications by mass spectrometry and implications for functional analyses

Le long bio-polymère d'ADN est condensé à l’intérieur du noyau des cellules eukaryotes à l'aide de petites protéines appelées histones. En plus de leurs fonctions condensatrices,ces histones sont également la cible de nombreuses modifications post-traductionnelles(MPT), particulièrement au niveau de leur section N-terminale. Ces modifications réversibles font partie d’un code d’histones épi-génétique transmissible qui orchestre et module dynamiquement certains événements impliquant la chromatine, tels l’activation et la désactivation de gènes ainsi que la duplication et la réparation d’ADN. Ces modifications sont impliquées subséquemment dans la signalisation et la progression de cancers, tels que la leucémie. En conséquence, l'élucidation des modifications d’histones est importante pour comprendre leurs fonctions biologiques. Une méthodologie analytique a été mise au point en laboratoire pour isoler, détecter, et quantifier les MPT d’histones en utilisant une approche rapide à deux volets à l’aide d’outils bioinformatiques spécialisés. La méthodologie développée en laboratoire a été validée en utilisant des histones de souche sauvage ainsi que deux types d’histones mutants déficients en enzymes acétyltransferase. Des trois sources d’histones utilisées, la seule MPT qui a démontré un changement significatif est l’acétylation de l’histone H3 à lysine 56 (H3K56ac). L’expression et la stoechiométrie de cette MPT, issue de cellules de souche sauvage et de cellules mutantes, ont été déterminées avec précision et comparées. Les fonctions de balayage polyvalentes d'un instrument à trappe ionique quadrupôle linéaire hybride ont été utilisées pour améliorer la détection de protéines intactes. Le mode de balayage « enhanced multiply charged » (EMC) a été modifié pour contenir et détecter les ions de protéines intactes situées dans la trappe ionique linéaire. Ce mode de balayage nommé « targeted EMC » (tEMC) a permis de quadrupler le niveau de sensibilité (signal/interférence), et quintupler la résolution du mode de balayage conventionnel. De plus, la capacité de séparation des charges du tEMC a réduit de façon significative les effets de « space charge » dans la trappe ionique linéaire. La résolution supérieure du mode tEMC a permis de différencier plusieurs isoformes modifiées, particulièrement pour l’histone H3. L’analyse des peptides d’histones trypsiques à l’aide du mode de balayage « MRM » a permis le séquençage et la quantification de MPT avec un haut degré de précision. La seule MPT qui était sous-exprimée entre l’histone de souche sauvage et le mutant DOT1L fut la méthylation de l’histone H3 lysine 79(H3K79me1). Les effets de deux inhibiteurs d’enzymes HDAC (HDACi) sur l’expression de MPT d’histone ont été évalués en utilisant la méthodologie analytique mentionnée. Les histones extraites de cellules normales et cancéreuses ont été exposées à du Vorinostat(SAHA) ou du Entinostat (MS-275) pour une période de 24 à 72 heures. Deux histones furent principalement affectées, soit H3 et H4. Étonnamment, les mêmes effets n'ont pas été détectés lorsque les cellules normales ont été traitées avec le HDACi pour une période de 48 à 72 heures. Une méthode absolue de quantification avec une courbe d’étalonnage a été développée pour le peptide H3K56ac. Contrairement à certaines publications, nos résultats démontrent que cette MPT est présente dans les cellules mammifères avec une stoechiométrie très basse (< 0,1%) et n'est pas surexprimée de façon significative après le traitement au HDACi.

Large scale identification of protein SUMOylation by mass spectrometry in HEK293 cells

Les fichiers qui accompagnent mon document sont des tableaux supplémentaires réalisés avec Excel (Microsoft Office), dans la version papier du mémoire ces fichiers sont sur un CD-ROM.

L'évolution du phagosome

La phagocytose est un processus cellulaire par lequel de larges particules sont internalisées dans une vésicule, le phagosome. Lorsque formé, le phagosome acquiert ses propriétés fonctionnelles à travers un processus complexe de maturation nommé la biogénèse du phagolysosome. Cette voie implique une série d’interactions rapides avec les organelles de l’appareil endocytaire permettant la transformation graduelle du phagosome nouvellement formé en phagolysosome à partir duquel la dégradation protéolytique s’effectue. Chez l’amibe Dictyostelium discoideum, la phagocytose est employée pour ingérer les bactéries de son environnement afin de se nourrir alors que les organismes multicellulaires utilisent la phagocytose dans un but immunitaire, où des cellules spécialisées nommées phagocytes internalisent, tuent et dégradent les pathogènes envahissant de l’organisme et constitue la base de l’immunité innée. Chez les vertébrés à mâchoire cependant, la transformation des mécanismes moléculaires du phagosome en une organelle perfectionnée pour l’apprêtement et la présentation de peptides antigéniques place cette organelle au centre de l’immunité innée et de l’immunité acquise. Malgré le rôle crucial auquel participe cette organelle dans la réponse immunitaire, il existe peu de détails sur la composition protéique et l’organisation fonctionnelles du phagosome. Afin d’approfondir notre compréhension des divers aspects qui relient l’immunité innée et l’immunité acquise, il devient essentiel d’élargir nos connaissances sur les fonctions moléculaire qui sont recrutées au phagosome. Le profilage par protéomique à haut débit de phagosomes isolés fut extrêmement utile dans la détermination de la composition moléculaire de cette organelle. Des études provenant de notre laboratoire ont révélé les premières listes protéiques identifiées à partir de phagosomes murins sans toutefois déterminer le ou les rôle(s) de ces protéines lors du processus de la phagocytose (Brunet et al, 2003; Garin et al, 2001). Au cours de la première étude de cette thèse (Stuart et al, 2007), nous avons entrepris la caractérisation fonctionnelle du protéome entier du phagosome de la drosophile en combinant diverses techniques d’analyses à haut débit (protéomique, réseaux d’intéractions protéique et ARN interférent). En utilisant cette stratégie, nous avons identifié 617 protéines phagosomales par spectrométrie de masse à partir desquelles nous avons accru cette liste en construisant des réseaux d’interactions protéine-protéine. La contribution de chaque protéine à l’internalisation de bactéries fut ensuite testée et validée par ARN interférent à haut débit et nous a amené à identifier un nouveau régulateur de la phagocytose, le complexe de l’exocyst. En appliquant ce modèle combinatoire de biologie systémique, nous démontrons la puissance et l’efficacité de cette approche dans l’étude de processus cellulaire complexe tout en créant un cadre à partir duquel il est possible d’approfondir nos connaissances sur les différents mécanismes de la phagocytose. Lors du 2e article de cette thèse (Boulais et al, 2010), nous avons entrepris la caractérisation moléculaire des étapes évolutives ayant contribué au remodelage des propriétés fonctionnelles de la phagocytose au cours de l’évolution. Pour ce faire, nous avons isolé des phagosomes à partir de trois organismes distants (l’amibe Dictyostelium discoideum, la mouche à fruit Drosophila melanogaster et la souris Mus musculus) qui utilisent la phagocytose à des fins différentes. En appliquant une approche protéomique à grande échelle pour identifier et comparer le protéome et phosphoprotéome des phagosomes de ces trois espèces, nous avons identifié un cœur protéique commun à partir duquel les fonctions immunitaires du phagosome se seraient développées. Au cours de ce développement fonctionnel, nos données indiquent que le protéome du phagosome fut largement remodelé lors de deux périodes de duplication de gènes coïncidant avec l’émergence de l’immunité innée et acquise. De plus, notre étude a aussi caractérisée en détail l’acquisition de nouvelles protéines ainsi que le remodelage significatif du phosphoprotéome du phagosome au niveau des constituants du cœur protéique ancien de cette organelle. Nous présentons donc la première étude approfondie des changements qui ont engendré la transformation d’un compartiment phagotrophe à une organelle entièrement apte pour la présentation antigénique.