Impact d’un épisode asphyxique périnatal associé à des convulsions sur le développement des interneurones corticaux : rôle de l’adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK)

L’encéphalopathie hypoxique-­‐ischémique cause des milliers de victimes à travers le monde chaque année. Les enfants survivants à un épisode hypoxique-­‐ischémique sont à risque de développer des problèmes neurologiques incapacitants comme une paralysie cérébrale, un retard mental, une épilepsie ou des troubles d’ordre comportemental. Les modèles animaux ont amélioré nos connaissances sur les mécanismes sous-­‐jacents aux dommages cérébraux, mais elles sont encore trop incomplètes pour être capables de prévenir les problèmes neurologiques. Ce projet vise à comprendre l’impact d’un épisode asphyxique périnatale associé à des convulsions ainsi que l’activation de l’adenosine monophosphate-­‐activated protein kinase (AMPK) sur les circuits GABAergiques inhibiteurs en développement chez la souris. Dans le but d’investiguer le sort des neurones inhibiteurs, appelés interneurones, suite à un épisode asphyxique périnatal associé à des convulsions avec des animaux transgéniques, nous avons pris avantage d’un nouveau modèle d’hypoxie permettant d’induire des convulsions chez la souris. Deux populations d’interneurones représentant ensemble environ 60% de tous les interneurones corticaux ont été étudiées, soit les cellules exprimant la parvalbumine (PV) et les cellules exprimant la somatostatine (SOM). L’étude stéréologique n’a montré aucune mort neuronale de ces deux populations d’interneurones dans l’hippocampe chez les souris hypoxique d’âge adulte. Par contre, le cortex des souris hypoxiques présentait des zones complètement ou fortement dépourvues de cellules PV alors que les cellules SOM n’étaient pas affectées. L’utilisation d’une lignée de souris transgénique exprimant une protéine verte fluorescente (GFP) dans les cellules PV nous a permis de comprendre que les trous PV sont le reflet de deux choses : 1) une diminution des cellules PV et 2) une immaturité des cellules PV restantes. Puisque les cellules PV sont spécifiquement affectées dans la première partie de notre étude, nous avons voulu étudier les mécanismes moléculaires sous-­‐jacents à cette vulnérabilité. L’AMPK est un senseur d’énergie qui orchestre le rétablissement des i niveaux d’énergie cellulaire dans le cas d’une déplétion énergétique en modulant des voies de signalisation impliquant la synthèse de protéines et l’excitabilité membranaire. Il est possible que l’activation d’AMPK suite à un épisode asphyxique périnatal associé à des convulsions soit néfaste à long-­‐terme pour le circuit GABAergique en développement et modifie l’établissement de l’innervation périsomatique d’une cellule PV sur les cellules pyramidales. Nous avons étudié cette hypothèse dans un modèle de culture organotypique en surexprimant la forme wild-­‐type (WT) de la sous-­‐unité α2 d’AMPK, ainsi qu’une forme mutée dominante négative (DN), dans des cellules PV individuelles. Nous avons montré que pendant la phase de formation synaptique (jours post-­‐natals équivalents EP 10-­‐18), la surexpression de la forme WT désorganise la stabilisation des synapses. De plus, l’abolition de l’activité d’AMPK semble augmenter le nombre de synapses périsomatiques faits par la cellule PV sur les cellules pyramidales pendant la phase de formation et semble avoir l’effet inverse pendant la phase de maturation (EP 16-­‐24). La neurotransmission GABAergique joue plusieurs rôles dans le cerveau, depuis la naissance jusqu’à l’âge adulte des interneurones, et une dysfonction des interneurones a été associée à plusieurs troubles neurologiques, comme la schizophrénie, l’autisme et l’épilepsie. La maturation des circuits GABAergiques se fait majoritairement pendant la période post-­‐natale et est hautement dépendante de l’activité neuronale et de l’expérience sensorielle. Nos résultats révèlent que le lourd fardeau en demande énergétique d’un épisode asphyxique périnatal peut causer une mort neuronale sélective des cellules PV et compromettre l’intégrité de leur maturation. Un des mécanismes sous-­‐ jacents possible à cette immaturité des cellules PV suite à l’épisode hypoxique est l’activation d’AMPK, en désorganisant leur profil d’innervation sur les cellules pyramidales. Nous pensons que ces changements dans le réseau GABAergique pourrait contribuer aux problèmes neurologiques associés à une insulte hypoxique.

La collaboration entre l'oncogène E2A-PBX1 et Hoxa9 lors de l'induction de B-ALL implique l'activation de Flt3

La protéine de fusion E2A-PBX1 induit une leucémie lymphoblastique aigüe des cellules B pédiatrique chez l’humain. E2A-PBX1 possède de puissantes propriétés de trans-activation et peut se lier à l’ADN ainsi qu’aux protéines homéotiques (HOX) via des domaines conservés dans sa portion PBX1, ce qui suggère qu’une dérégulation des gènes cibles de HOX/PBX1 contribue à la leucémogénèse. Précédemment, Bijl et al. (2008) ont démontré que certains gènes Hox collaborent de manière oncogénique avec E2A-PBX1, et que ces interactions sont cellules-spécifiques et varient en fonction du gène Hox impliqué. Une mutagénèse d’insertion provirale suggère et supporte la collaboration des gènes Hoxa et E2A-PBX1 lors de la leucémogénèse des cellules B. La présence de ces interactions dans les cellules B et leur implication dans l’induction des B-ALL est pertinente pour la compréhension de la maladie humaine, et reste encore mal comprise. Notre étude démontre qu’Hoxa9 confère un avantage prolifératif aux cellules B E2A-PBX1. Des expériences de transplantation à l’aide de cellules B E2A-PBX1/Hoxa9 positives isolées de chimères de moelle osseuse démontrent qu’Hoxa9 collabore avec E2A-PBX1 en contribuant à la transformation oncogénique des cellules, et qu’Hoxa9 seul n’induit aucune transformation. Une analyse par Q-RT-PCR nous a permis de démontrer une forte inhibition de gènes spécifiques aux cellules B dans les leucémies co-exprimant Hoxa9 et E2A-PBX1, en plus d’une activation de Flt3, suggérant une inhibition de la différenciation des cellules B accompagnée d’une augmentation de la prolifération. De plus, la surexpression de Hoxa9 dans des cellules leucémiques de souris transgéniques E2A-PBX1, confère aussi un avantage prolifératif aux cellules in vitro, qui semblent être influencé par une augmentation de l’expression de Flt3 et Pdgfδ. En conclusion, nous démontrons pour la première fois à l’aide d’un modèle murin qu’Hoxa9 collabore avec E2A-PBX1 lors de la transformation oncogénique des cellules B et que la signalisation via Flt3 est impliquée, ce qui est potentiellement pertinent pour la maladie humaine.

Caractérisation phénotypique et génotypique de Campylobacter jejuni et évaluation d’une stratégie de contrôle de la colonisation du poulet de chair par ce pathogène alimentaire

Campylobacter jejuni est l’agent causal de la campylobactériose, infection bactérienne importante en santé publique. Un des vecteurs de transmission de C. jejuni pour l’humain est le poulet via la chaîne alimentaire. Les mécanismes impliqués dans colonisation caecale commensale des oiseaux par C. jejuni sont toujours peu caractérisés, bien qu’une meilleure compréhension de ces mécanismes puisse apporter des solutions pour le contrôle du pathogène à la ferme. Cette étude avait pour buts de caractériser les propriétés phénotypiques et les facteurs génétiques impliqués dans la colonisation du poulet par C. jejuni et d’identifier de nouveaux mécanismes impliqués dans cette association. Des souches, issues d’élevages conventionnels échantillonnés en 2003 et en 2008 ainsi que d’élevages biologiques, ont été caractérisées afin d’obtenir leur profil de résistance aux antibiotiques, leur autoagglutination et leur chimiotactisme. Les souches des élevages conventionnels ont de plus été caractérisées pour leur capacité à adhérer et envahir une culture primaire de cellules caecales de poulet. Une puce à ADN a été développée pour détecter la présence de 254 gènes et variants associés à la colonisation des poulets ainsi qu’à la résistance aux antibiotiques chez les souches issues d’élevages conventionnels. Les propriétés phénotypiques et la présence de certains gènes chez les souches ont par la suite été comparées. Finalement, des souches ayant des caractéristiques différentes ont été utilisées dans un modèle de colonisation du poulet pour évaluer l’efficacité d’un nouvel additif alimentaire à base d’acides organiques et d’huiles essentielles sur le contrôle de C. jejuni. Les propriétés phénotypiques des souches étaient très variées et n’étaient pas corrélées entre elles, à l’exception de l’adhésion et de l’invasion. L’analyse génétique a révélé que le contenu en gènes des souches était variable, notamment au niveau des gènes de l’enveloppe bactérienne, au flagelle, aux récepteurs du chimiotactisme et à la résistance à l’arsenic. Les souches de 2003 et de 2008 étaient semblables lorsque leur contenu en gènes ainsi que leurs propriétés phénotypiques étaient comparés. Des gènes possiblement associés à un fort ou un faible potentiel de colonisation ont été identifiés. L’additif alimentaire a diminué la contamination des carcasses bien qu’une augmentation de la colonisation intestinale ait été observée pour certaines souches. La moitié des lots de poulets d’origine biologique étaient positifs pour C. jejuni. Les souches issues de ce type d’élevage étaient peu résistantes aux antibiotiques et possédaient des phénotypes variés. Cette étude a permis de mieux définir les caractéristiques importantes de C. jejuni qui sont associées à la colonisation intestinale du poulet. Elle a établi pour la première fois au Canada la présence du pathogène dans les élevages de poulets biologiques. Cette étude fait partie des quelques études qui décrivent la présence des gènes de colonisation et de résistance aux antibiotiques dans une collection de souches issues uniquement du poulet. Elle a également remis en doute l’importance de certains gènes dans la colonisation. La caractérisation exhaustive des souches a également permis d’identifier de nouveaux gènes possiblement associés à la colonisation de poulet par C. jejuni. Finalement, elle a indiqué que l’utilisation d’un mélange d’huiles essentielles et d’acide organique encapsulés pouvait être efficace pour réduire la contamination des carcasses de poulet par C. jejuni et que son effet était souche-dépendant.

Études de type structure fonction des mutations causant l’ataxie épisodique de type I sur les canaux potassiques dépendants du voltage

Les ataxies épisodiques (EA) d’origine génétique sont un groupe de maladies possédant un phénotype et génotype hétérogènes, mais ont en commun la caractéristique d’un dysfonctionnement cérébelleux intermittent. Les EA de type 1 et 2 sont les plus largement reconnues des ataxies épisodiques autosomiques dominantes et sont causées par un dysfonctionnement des canaux ioniques voltage-dépendants dans les neurones. La présente étude se concentrera sur les mutations causant l'EA-1, retrouvées dans le senseur de voltage (VSD) de Kv1.1, un canal très proche de la famille des canaux Shaker. Nous avons caractérisé les propriétés électrophysiologiques de six mutations différentes à la position F244 et partiellement celles des mutations T284 A/M, R297 K/Q/A/H, I320T, L375F, L399I et S412 C/I dans la séquence du Shaker grâce à la technique du ‘’cut open voltage clamp’’ (COVC). Les mutations de la position F244 situées sur le S1 du canal Shaker sont caractérisées par un décalement des courbes QV et GV vers des potentiels dépolarisants et modifient le couplage fonctionnel entre le domaine VSD et le pore. Un courant de fuite est observé durant la phase d'activation des courants transitoires et peut être éliminé par l'application du 4-AP (4-aminopyridine) ou la réinsertion de l'inactivation de type N mais pas par le TEA (tétraéthylamonium). Dans le but de mieux comprendre les mécanismes moléculaires responsables de la stabilisation d’un état intermédiaire, nous avons étudié séparément la neutralisation des trois premières charges positives du S4 (R1Q, R2Q et R3Q). Il en est ressorti l’existence d’une interaction entre R2 et F244. Une seconde interface entre S1 et le pore proche de la surface extracellulaire agissant comme un second point d'ancrage et responsable des courants de fuite a été mis en lumière. Les résultats suggèrent une anomalie du fonctionnement du VSD empêchant la repolarisation normale de la membrane des cellules nerveuses affectées à la suite d'un potentiel d'action.

Impact du stress hyperoxique en période néonatale sur la structure vasculaire : implication des phénomènes de sénescence et rôle possible dans la programmation développementale de l'hypertension artérielle

Réalisé en cotutelle avec l'Université de Lorraine (France)

Étude de la variation de phase des fimbriae F1651, Pap et CS31A et de l'impact des régulateurs homologues de PapI

Les Escherichia coli pathogènes extra-intestinaux (ExPEC) sont responsables d’une grande variété de maladies. Plus particulièrement, certaines souches ExPEC, du sous-groupe d’E. coli uropathogènes, sont porteuses de fimbriae de type P. Cette famille d’adhésines est soumise à une régulation transcriptionnelle appelée variation de phase; un mécanisme du tout ou rien. Il s’agit d’une compétition entre deux protéines régulatrices : la Dam méthylase et la nucléoprotéine Lrp. Ce mécanisme est aussi soumis à l’influence des régulateurs locaux PapB et PapI, deux régulateurs essentiels. Afin d’étudier PapI et ses homologues ainsi que leur impact sur la variation de phase des fimbriae F1651, Pap et CS31A. Grâce à une fusion chromosomique entre la région régulatrice de clp et les gènes lacZYA, nous avons étudié l’effet, en trans, de PapI et FooI qui ont pu restaurer la variation de phase avec une forte tendance pour la phase OFF. Pour étudier l’action de ces protéines sur foo et pap, nous avons utilisé un système utilisant gfp comme gène rapporteur de l’activité des promoteurs des opérons pap et foo. Cela a permis d’observer la variation de phase au niveau cellulaire par cytométrie en flux et en temps réel par microscopie à fluorescence. Ces expériences ont confirmé que la population de cellules F1651 positives a un phénotype d’expression de F1651 partielle alors que les cellules Pap sont en majorité en phase OFF. PapI et FooI n’ont pas la même influence sur la variation de phase, puisque FooI favorise une plus grande fréquence de variation de phase.

Caractérisation du système d’acquisition de fer codé par le locus iro chez Salmonella enterica sérovar Typhi

Le fer est un élément essentiel pour les bactéries. Puisqu’elles ne peuvent le synthétiser elles-mêmes, elles utilisent un ou plusieurs systèmes d’acquisition de fer afin de se le procurer dans l’environnement, ou chez l’hôte pour leurs propres métabolismes. Différentes stratégies coexistent chez les bactéries pathogènes dues à la faible concentration de cet élément, autant chez l’hôte que dans l’environnement. Salmonella enterica sérovar Typhi (S. Typhi) est une entérobactérie Gram négative causant une maladie systémique, soit la fièvre typhoïde, qui est spécifique à l’homme. Les mécanismes de pathogènese de ce sérovar sont peu connus jusqu’à ce jour, puisque son tropisme pour l’humain empêche l’utilisation d’un modèle animal adéquat. L’objectif de cette recherche est de caractériser le système d’acquisition de fer chez S. Typhi encodé par le locus iro. Les gènes du locus, iroBCDEN ont fait l’objet de plusieurs recherches chez différents pathogènes, notamment E. coli et Salmonella Typhimurium. Bien qu’un rôle dans la virulence ait été établi pour ce locus chez ces bactéries, très peu d’informations sont disponibles quant au rôle chez S. Typhi, qui emprunte plutôt la voie systémique d’infection. Nous avons évalué le rôle de la synthèse, de l’exportation et de l’importation du sidérophore salmochéline, codé par les gènes iroBCDEN. En inactivant le locus puis par la suite les gènes de façon indépendante par échange allélique, il a été possible d’observer leurs implications in vitro lors d’infections de cellules humaines. Le rôle dans l’adhésion et l’invasion des cellules épithéliales ainsi que le rôle dans la phagocytose et la survie dans les macrophages ont donc été déterminés. De plus, le mécanisme de sécrétion par lequel la salmochéline peut traverser la membrane externe est inconnu à ce jour. La pompe à efflux TolC est responsable de la sécrétion de plusieurs molécules, y compris l’entérobactine, un sidérophore analogue à la salmochéline. Par mutagénèse, nous avons effectué un mutant de délétion tolC afin de vérifier son implication dans l’interaction avec les cellules épithéliales et les macrophages. Afin de caractériser in vitro les mutants, nous avons effectué des courbes de croissance dans différents milieux. La sensibilité au peroxyde d’hydrogène a été vérifiée par la suite, puis dû aux résultats d’infections, la mobilité de la souche ΔtolC a été évaluée. Ces différents tests nous ont permis de mieux comprendre l’implication du locus iro, de ses composantes et de la pompe à efflux TolC lors de l’interaction avec les cellules cibles d’une infection systémique causée par Salmonella Typhi.

Study of the subcellular localization of cell cycle regulator Cks1 and its impact on cancer

La progression dans le cycle cellulaire est contrôlée par de vagues oscillantes de cyclines et des kinases cycline-dépendantes (Cdk). Ces kinases sont régulées positivement par l’association des sous-unités cyclines régulatrices et négativement en se liant aux inhibiteurs de Cdk. Parmi ces derniers, p27 inhibe tous les complexes cycline-Cdk quelle que soit la phase cellulaire et agit en tant que régulateur négatif principal de la prolifération cellulaire dans une variété de cellules et de tissus. Intrinsèquement, p27 phosphorylé est ubiquitiné et dégradé par le complexe SCFSkp2-Cks1. Des études génétiques de la souris, ainsi que des examens cliniques chez l’homme, ont montré que p27 est un important suppresseur de tumeur. Le gène est rarement muté. Cependant, p27 est fréquemment réprimé dans les cancers humains en raison d’une augmentation de l’expression de Skp2 et de Cks1 dans le noyau, ce qui est généralement associée à un mauvais pronostic. La localisation subcellulaire de Cks1 est donc d'une importance primordiale dans le contrôle de la prolifération cellulaire. Les résultats récents de notre laboratoire ont montré une interaction entre Cks1 et les protéines de transport nucléaire importine α1 et β3. Aussi, l’analyse de la séquence primaire de Cks1 a également révélé un signal de localisation nucléaire classique (NLS) à son extrémité C-terminale. Des mutations ont été effectuées sur le NLS suspect pour déterminer si oui ou non l'import nucléaire de Cks1 était contrôlé par cette séquence. Un inhibiteur synthétique de l’importine β a également été utilisé pour étudier l’import de Cks1 dans le noyau. Les résultats indiquent que l’extrémité C-terminale de Cks1 est en effet un NLS puisque les mutations de Cks1 et l'inhibition de l’importine β conduisent, tous deux, à l'accumulation de Cks1 dans le cytoplasme. Ces résultats ont été utiles pour mieux comprendre le mécanisme régulant la localisation de Cks1. Toutefois, des travaux futurs sont nécessaires pour mieux comprendre l'impact de la séquestration cytoplasmique de Cks1 sur le cancer et ainsi espérer aboutir à l'identification de nouvelles cibles pharmacologiques impliqués dans la prolifération cellulaire.

Study of histone H3 lysine 56 deacetylation in saccharomyces cerevisiae

Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, l'acétylation de l'histone H3 sur la lysine 56 (H3K56ac) est présente sur les histones néo-synthétisées déposées derrière les fourches de réplication et est essentielle pour préserver la viabilité cellulaire en réponse au dommage à l'ADN. La désacétylation d'H3K56 sur l'ensemble du génome catalysée par Hst3 et Hst4 et a lieu en phase G2 ou M. H3K56ac est une lame à double tranchant. L'absence d'H3K56ac rend les cellules sensibles aux dommages à l'ADN. En revanche, un excès d'acétylation d'H3K56 dans un mutant hst3Δ hst4Δ a des conséquences encore plus sévères tels que la thermo-sensibilité, l'hypersensibilité aux agents génotoxiques, l'instabilité génomique ainsi qu'une courte durée de vie réplicative. Les désacétylases Hst3 et Hst4 sont étroitement régulées au cours du cycle cellulaire afin de permettre à l'H3K56ac d'exercer son rôle en réponse aux dommages à l'ADN tout en évitant les conséquences néfastes de l'hyperacétylation d'H3K56. Dans cette thèse, nous avons identifié la machinerie moléculaire responsable de la dégradation de Hst3. De plus, nous avons exploré les raisons pour lesquelles l'absence de désacétylation donne lieu aux phénotypes du mutant hst3Δ hst4Δ. Au chapitre 2, nous démontrons que la dégradation d'Hst3 peut être complétée avant l'anaphase. Ceci suggère que la désacétylation de H3K56 a lieu durant une courte fenêtre du cycle cellulaire se situant entre la complétion de la phase S et la métaphase. De plus, nous avons identifié deux sites de phosphorylation d'Hst3 par la kinase cycline-dépendante 1 (Cdk1) et démontré que ces évènements de phosphorylation conduisent à la dégradation d'Hst3 in vivo. Nous avons aussi démontré que l'ubiquityltransférase Cdc34 et l'ubiquitine ligase SCFCdc4 sont requises pour la dégradation d'Hst3. Finalement, nous avons montré que la phosphorylation d'Hst3 par la kinase mitotique Clb2-Cdk1 peut directement entraîner l'ubiquitylation d'Hst3 par SCFCdc4 in vitro. Au chapitre 3, nous avons étudié les mécanismes moléculaires sous-jacents à la sensibilité extrême du mutant hst3Δ hst4Δ aux agents qui endommagent l'ADN. Nous avons établi qu'en raison de la présence anormale d'H3K56ac devant les fourches de réplication, le mutant hst3Δ hst4Δ exhibe une forte perte de viabilité lorsqu'exposé au méthyl méthanesulfonate (MMS) durant un seul passage à travers la phase S. Nous avons aussi découvert que, malgré le fait que le point de contrôle de réponse aux dommages à l'ADN est activé normalement dans le mutant hst3Δ hst4Δ, ce mutant est incapable de compléter la réplication de l'ADN et d'inactiver le point de contrôle pour une longue période de temps après exposition transitoire au MMS. L'ensemble de nos résultats suggère que les lésions à l'ADN induites par le MMS dans le mutant hst3Δ hst4Δ causent une forte perte de viabilité parce que ce mutant est incapable de compléter la réplication de l'ADN après une exposition transitoire au MMS. Dans la deuxième section du chapitre 3, nous avons employé une approche génétique afin d'identifier de nouveaux mécanismes de suppression de deux phénotypes prononcés du mutant hst3Δ hst4Δ. Nous avons découvert que la délétion de plusieurs gènes impliqués dans la formation de frontières entre l'hétérochromatine et de l'euchromatine atténue les phénotypes du mutant hst3Δ hst4Δ sans réduire l'hyperacétylation d'H3K56. Nos résultats indiquent aussi que l'abondante acétylation de l'histone H4 sur la lysine 16 (H4K16ac) est néfaste au mutant hst3Δ hst4Δ. Ce résultat suggère un lien génétique intriguant entre l'acétylation d'H3K56 et celle d'H4K16. L'existence de ce lien était jusqu'à présent inconnu. Nous avons identifié un groupe de suppresseurs spontanés où H3K56ac est indétectable, mais la majorité de nos suppresseurs ne montrent aucune réduction flagrante d'H3K56ac ou d'H4 K16ac par rapport aux niveaux observés dans le mutant hst3Δ hst4Δ. Une étude plus approfondie de ce groupe de suppresseurs est susceptible de mener à la découverte de nouveaux mécanismes génétiques ou épigénétiques permettant d'éviter les conséquences catastrophiques de l'hyperacétylation d'H3K56 chez le mutant hst3Δ hst4Δ. En résumé, cette thèse identifie la machinerie moléculaire responsable de la dégradation d'Hst3 (une désacétylase d'H3K56) durant une fenêtre de temps situées entre la fin de la phase S et la métaphase. Nos résultats permettent aussi d'expliquer pourquoi la dégradation d'Hst3 précède le début de la phase S durant laquelle l'acétylation d'H3K56 s'accumule derrière les fourches de réplication afin d'exercer son rôle de mécanisme de défense contre le dommage à l'ADN. De plus, nous avons identifié plusieurs suppresseurs qui permettent de contourner le rôle important d'Hst3 et Hst4 en réponse au dommage à l'ADN. Plusieurs suppresseurs révèlent un lien génétique inattendu entre deux formes abondantes d'acétylation des histones chez Saccharomyces cerevisiae, soit H3K56ac et H4K16ac.

Immunothérapie cellulaire de la leucémie aiguë lymphoblastique de l'enfant à partir de sang de cordon dans un modèle murin xénogénique

La leucémie aigüe lymphoblastique de précurseurs des cellules B (pré-B LAL) est le cancer le plus fréquent chez l’enfant. La transplantation de cellules souches hématopoïétiques (TCSH) est nécessaire dans environ 20 à 30 % des enfants ayant une pré-B LAL. Les rechutes après TCSH sont habituellement réfractaires aux thérapies actuelles, et par conséquent, il est important de développer et d’optimiser de nouvelles stratégies thérapeutiques. Dans cette étude, nous nous sommes intéressés aux cellules « cytokine-induced killer » (CIK). En effet, ces cellules ont été montrées comme hautement cytotoxique contre beaucoup de types de cancers. Cependant, leur activité cytotoxique contre les pré-B LAL n’est pas vraiment efficace. Par conséquent, nous avons étudié la possibilité de combiner l’immunothérapie des cellules CIK avec l’interféron alpha (IFN-α) afin d’optimiser l’activité lytique de ces cellules contre les cellules pré-B LAL. De plus, vu qu’il a été démontré que l’activité cytotoxique des cellules CIK provient de la fraction CD56+, plus particulièrement les cellules CD3+CD56+, nous avons décidé d’utiliser la fraction CD56+ (cellules CD56+) dans l’ensemble de nos expériences. Nous avons observé in vitro que les cellules CD56+ lysent mieux les lignées cellulaires pré-B LAL comparativement aux cellules CIK non purifiées. Aussi, leur activité cytotoxique peut être augmentée par le traitement avec l’IFN-α. Par ailleurs, nous avons démontré l’efficacité des cellules CD56+ traitées par l’IFN-α contre les lignées cellulaires pré- B LAL in vivo, dans le modèle de souris NOD/SCID/gamma c- (NSG). La survie des souris est significativement prolongée lorsqu’elles reçoivent les cellules pré-B LAL avec les cellules CD56+ traitées par l’IFN-α. Nous avons par la suite étudié le mécanisme d’action des cellules CD56+ contre les lignées cellulaires pré-B LAL. Nous avons observé que les cellules CD56+ provenant de sang de cordon sont plus efficaces que les cellules CD56+ provenant de sang I périphérique pour tuer les lignées cellulaires pré-B LAL. Nous avons également montré que les cellules CD56+ utilisent seulement la voie NKG2D ou bien les voies NKG2D et TRAIL selon la lignée cellulaire pré-B LAL cible et selon la provenance de la source des cellules CD56+. Par ailleurs, nous avons remarqué que les cellules CIK sont sensibles à l’apoptose par Fas, et que cette sensibilité influence leur activité cytotoxique contre les cellules tumorales. En conclusion, les cellules CD56+ sont cytotoxiques contre les lignées cellulaires pré-B LAL, et leur effet lytique est augmenté par l’IFN-α aussi bien in vitro qu’in vivo dans le modèle de souris NSG. Ces données précliniques sont encourageantes pour tester cette nouvelle approche d’immunothérapie dans le traitement contre la pré-B LAL.

Étude de la dynamique des interactions des constituants du complexe de biosynthèse et d’insertion de la sélénocystéine dans la traduction des sélénoprotéines in vivo

Les sélénoprotéines sont des protéines auxquelles des sélénocystéines, soit le 21e acide aminé, sont incorporées durant leur traduction. Plus précisément, la sélénocystéine (Sec) est un dérivé métabolique de la sérine, mais structurellement équivalent à une cystéine dont on a remplacé l'atome de soufre par du sélénium. Elle se distingue des autres acides aminés puisqu’elle possède sa propre synthétase qui sert à convertir la sérine en Sec alors que le résidu est déjà fixé à l’ARNt. La position d’une Sec sur l’ARNm est indiquée par le codon UGA étant habituellement un signal STOP introduisant le concept de recoding. Grâce à une machinerie métabolique spécifique à l'ARNtSec et à la présence d’un SecIS (Selenocystein Insertion Sequence) sur l’ARNm, ce codon permet la présence d'une Sec dans la protéine. Il est connu que la synthèse débute avec l’acétylation de l’ARNt[Ser]Sec par la seryl-ARNt synthétase (SerRS) afin de donner la seryl-ARNt[Ser]Sec. Cette dernière est subséquemment phosphorylée par l’O-phosphoséryl-ARNt[Ser]Sec kinase (PSTK) qui donnera l’O-phosphoséryl-ARNt[Ser]Sec. Par la suite, un complexe de plusieurs protéines et cofacteurs, agissant comme machinerie pour l’incorporation des Sec durant la traduction, s’associe avec l’ARNt[Ser]Sec puis l’ARNm et, finalement, les composantes du ribosome. Parmi ces protéines, SepSecS catalyse l’étape finale de la synthèse des Sec en convertissant le O-phosphoseryl-ARNt[Ser]Sec en selenocysteinyl-ARNt[Ser]Sec utilisant le sélénophosphate comme source de sélénium. Des études récentes montrent que l’association avec SECp43 serait nécessaire pour que SepSecS joue son rôle et soit ségrégée au noyau pour s’associer à la machinerie de biosynthèse des sélénoprotéines, soit le complexe moléculaire qui reconnaît le codon UGA. Parmi les protéines de la machinerie de biosynthèse des sélénoprotéines que nous avons analysées, il y a eEFSec, RPL30, SPS2, SPS1, SBP2 et NSEP1. Nos résultats d’analyse de la dynamique de l’interaction entre les constituants de la machinerie de biosynthèse et d’incorporation des Sec, confirment plusieurs données de la littérature, mais remettent en question le modèle jusqu’à maintenant établi. Une meilleure compréhension de la dynamique des interactions entre ses constituants et la régulation de cette dynamique permet d’émettre des hypothèses quant au rôle de la machinerie de biosynthèse des sélénoprotéines et de l’importance de sa complexité. Nous avons analysé les interactions in vivo dans des cellules HEK293T au moyen de la technique de Protein-Fragment Complementation Assay (PCA) en couplant, par un clonage moléculaire, les gènes de chacune des protéines d’intérêt avec des fragments des gènes de la protéine luciférase (hRluc). Nous avons ainsi réalisé une fusion en N-terminal et en C-terminal des fragments de luciférase pour chacune des protéines d’intérêt. Puis, nous avons analysé la dynamique des interactions avec les composantes de la machinerie de biosynthèse des Sec. D’autres travaux seront essentiels afin de bâtir sur les résultats présentés dans cette recherche.

Transcriptional regulation of effector CD8+ T cell differentiation and molecular dysfunction during HIV-1 infection

Les cellules T CD8+ jouent un rôle primordial dans le contrôle des infections virales en limitant la dissémination des cellules infectées. Lors de l’infection chronique par le virus HIV, les cellules T CD8+ HIV-spécifiques ne se différencient pas en cellules effectrices fonctionnelles capables de tuer les cellules infectées par le virus ; ces cellules ne sont plus capables de proliférer ou de produire l’ IL-2. Ces cellules expriment PD-1 et l’engagement de PD-1, par son ligand, aboutit a plusieurs de ces déficits fonctionnels des cellules T . Le rôle de PD-1 dans la régulation d'évènements transcriptionnels contrôlant la différentiation et l'obtention des fonction effectrices des cellules T CD8+ reste à démontrer. Id2 joue un rôle central dans la différenciation des cellules T CD8+ effectrices. Nous avons émis l’hypothèse que le défaut de maturation observé chez les cellules T CD8+ PD-1 high HIV-spécifiques (CD8+PD-1hi) au cours de l’infection chronique par le virus HIV pouvait être lié à la diminution d’expression du régulateur Id2. Nous avons ainsi démontré que l'engagement de PD-1 contribuait à une diminution d'expression de Id2 et de ses cibles transcriptionnelles. La surexpression de Id2 de ces cellules a permis de restaurer l'expression de marqueurs tels que Granzyme B et Bcl-2 et diminuir l’expression du marqueur de maturation de CD27. La famille des cytokines à chaine gamma joue un rôle clef dans la survie et l’homéostasie des cellules T. Dans ce travail, nous avons démontré que l’IL-15 était unique grâce à ses capacités de stimulation de l’expression d’Id2 et ses propriétés favorisant la survie ainsi que la différenciation des cellules T CD8+ effectrices. l’IL-15 induit la prolifération de toutes les populations de cellules T mémoires provenant de donneurs sains. L’addition de cette cytokine aux sous-populations cellulaires Ttm et Tem a permis leur différenciation en cellules effectrices capables de produire Granzyme B alors que la stimulation par l’IL-15 des cellules Tcm ne favorise pas leur différenciation. Un test de cytotoxicitié par cytométrie en flux nous a permis de confirmer que la stimulation de cellules T CD8+ HIV spécifiques par l’IL-15 favorisait l’expression de Id2 et restaurait les fonctions cytotoxiques des cellules T CD8+ HIV spécifiques. En conclusion, nous avons pour la première fois dans cette thèse défini les mécanismes moléculaires impliqués dans la modulation de l’expression du régulateur transcriptionnel Id2 par l’IL-15. Nous avons également révélé comment l’engagement de PD-1 conduisait a une altération de l’expression et de la fonction d’Id2 et favorisait la diminution des fonctions effectrices des cellules T CD8-HIV spécifiques. Une perspective de traitement avec des agents tels que l’IL-15 ou le bloquage de PD-1, en combinaison avec les traitements conventionnels, pourrait contribuer à une meilleure stimulation des réponses immunes favorisant ainsi la réactivation des cellules T CD8+ et permettant la destruction de cellules T CD4+ infectées de manière latente.

Rôle des suppresseurs de tumeur PML et CHES1 dans la régulation de la sénescence et de la prolifération cellulaire

La sénescence est un mécanisme de défense antiprolifératif dont la cellule est munie afin de prévenir l’accumulation de mutations pouvant mener à sa transformation et l’éventuel développement d’une tumeur. Ce programme consiste en un arrêt permanent du cycle cellulaire. Il peut être activé par de nombreux stimuli tels que le raccourcissement des télomères, le stress oxydatif, ou l’expression d’un oncogène constitutivement actif. Sa régulation requiert l’activation de protéines appelées des suppresseurs de tumeur dont les plus importants sont p53 et RB. De manière plus spécifique, les sénescences induites par l’expression des oncogène RASV12 ou STAT5A(1*6) sont respectivement caractérisées par l’augmentation de l’expression des protéines PML et CHES1/FOXN3. Le but de cette thèse est, dans un premier temps, de mettre en évidence le mécanisme de régulation de la sénescence par PML. PML est un suppresseur de tumeur dont l’expression dans des cellules diploïdes normales est suffisante pour induire la sénescence. Cette protéine forme des corps nucléaires sphériques au sein desquels est recruté, parmi d’autres molécules, la protéine du rétinoblastome RB. RB est un régulateur négatif du cycle cellulaire capable de lier et inhiber les facteurs de transcription E2F dont les gènes cibles sont nécessaires à la prolifération. Nos travaux démontrent que le mécanisme d’induction de la sénescence par PML implique le recrutement du complexe RB/E2F aux corps de PML afin de renforcer l’inhibition de l’activité des E2F par RB. Également, les E2F sont recrutés aux corps de PML en compagnie de leurs promoteurs ce qui favorise la formation d’hétérochromatine au niveau de ces gènes, aidant à leur répression et donc à l’établissement de la sénescence. D’autre part, cette thèse a pour but de caractériser le rôle de CHES1/FOXN3 dans la régulation du cycle cellulaire. CHES1 est un facteur de transcription de la famille des Forkheads. Son expression dans des cellules cancéreuses provoque un ralentissement de leur prolifération. Afin de comprendre son mécanisme de fonctionnement, une analyse sur micropuce d’ADN de l’expression des gènes de cellules cancéreuses exprimant CHES1 a été réalisée. Cette analyse a montré que, dans la cellule, CHES1 joue un rôle de répresseur transcriptionnel. Plus précisément, CHES1 réprime, entre autres, l’expression de gènes nécessaires à la synthèse des protéines tels que PIM2 et DYRK3. De manière intéressante, la réexpression de PIM2 dans des cellules cancéreuses exprimant CHES1 permet de rétablir partiellement la prolifération cellulaire. Également, l’analyse sur micropuce a révélé que CHES1 régule l’expression de nombreux gènes impliqués dans la formation des cilia dont l’une des fonctions semble être de moduler la synthèse protéique. Pris ensemble, ces résultats suggèrent que le mécanisme antitumoral de CHES1 consiste en une inhibition de la synthèse de protéines.

Caractérisation de l'anatomie et de la fonction du système endocannabinoïde dans la rétine adulte

Au cours des dernières années, un intérêt grandissant concernant les rôles physiologiques des endocannabinoïdes (eCBs) a été observé. Le système eCB est une cible attrayante pour la modulation du système immunitaire et de la douleur périphérique. Bien que le récepteur CB1 soit distribué dans le système nerveux, le récepteur CB2 est traditionnellement associé au système immunitaire. Ce dogme fait maintenant l’objet d’un débat depuis la découverte de l’expression du récepteur CB2 dans certains neurones. La rétine est un modèle important pour l’étude de processus neuronaux. La présence du récepteur CB1 y a été démontrée. Des études fonctionnelles rapportent que l’activation des récepteurs cannabinoïdes affecte le fonctionnement de plusieurs cellules rétiniennes. À ce jour, aucune étude ne s’est intéressée au rôle global des récepteurs CB1 et CB2 dans la rétine. Nous avons investigué les conséquences de l’élimination du récepteur CB1 (cnr1-/-) ou du récepteur CB2 (cnr2-/-) sur la fonction rétinienne mesurée par électrorétinographie. Nous avons également caractérisé la distribution du récepteur CB2 dans la rétine. Pour ce faire, nous avons comparé la spécificité de plusieurs anticorps dirigés contre le récepteur CB2. Seulement l’un des anticorps testés a montré une spécificité satisfaisante. Il a permis de détecter la présence du récepteur CB2 dans les cônes, les bâtonnets, les cellules horizontales, amacrines, bipolaires et ganglionnaires. Nos résultats d’électrorétinographie indiquent que seules les souris cnr2-/- présentent une amplitude accrue de l’onde a des ERG, en conditions scotopiques. En conditions photopiques, l’amplitude de l’onde b des souris cnr2-/- montre un schéma d’adaptation à la lumière différent des autres groupes. Aucun effet significatif n’a été observé chez les animaux cnr1-/-. Ces résultats permettent de conclure que les récepteurs CB1 et CB2 jouent des rôles différents dans le traitement visuel et que le récepteur CB2 semble être impliqué dans l’établissement des réponses rétiniennes.

Angiopoietine-like 2 : un facteur circulant pro-oxydant et pro-inflammatoire qui contribue au développement de l’athérosclérose

L’athérosclérose est une maladie vasculaire inflammatoire chronique qui se développe progressivement au cours de la vie. Les mécanismes impliqués sont complexes et la recherche de nouveaux candidats impliqués dans l'athérogénèse est toujours d'actualité. L’Angiopoietine-like 2 (Angptl2) est une protéine relativement peu connue, aux propriétés pro-angiogéniques et pro-inflammatoires, qui appartient par homologie à la grande famille des angiopoietines, mais dont le récepteur n'est pas encore clairement identifié. Les situations pathologiques dans lesquelles l’Angptl2 jouerait un rôle crucial sont diverses, mais sa contribution moléculaire dans le développement de l’athérosclérose est inconnue. Par differential display, nous avons initialement identifié l'Angptl2 comme étant surexprimée dans des cellules endothéliales sénescentes, isolées et cultivées à partir d'artères mammaires internes de patients athérosclérotiques ayant subi un pontage coronarien. Cette découverte a été la à base de mon projet, et mes objectifs ont été 1) de déterminer l'implication de l’Angptl2 vasculaire en présence de facteurs de risques tels que le tabagisme et la dyslipidémie, 2) de produire et de purifier une protéine recombinante fonctionnelle de l’Angptl2 afin d'identifier in vitro de nouvelles propriétés cellulaires de l'Angptl2 et 3) d'étudier in vivo le potentiel pro-athérogénique de l'Angptl2 recombinante dans un modèle murin de dyslipidémie sévère. Nous avons montré que l’Angptl2 est sécrétée préférentiellement dans des conditions pro-oxydantes et pro-inflammatoires, avec une augmentation de son expression endothéliale de l’ordre de 6 fois chez des patients coronariens fumeurs atteints de maladie pulmonaire obstructive chronique. Suite à ces résultats, nous avons émis l’hypothèse que l’Angptl2, en plus de ses fonctions pro-inflammatoires connues, possède des propriétés pro-oxydantes. Nous avons démontré que l’Angptl2 recombinante stimule en effet la production de radicaux libres dans des HUVEC en culture, via l’inhibition partielle de la voie cytoprotectrice antioxydante Nrf2/HO-1 et potentiellement via l'activation de kinase intracellulaire de type p38. A l'aide de souris dyslipidémiques LDLr-/-; hApoB-100+/+, nous avons démontré que le niveau d’Angptl2 plasmatique, vasculaire et dans les plaques athéromateuses, augmente parallèlement avec le développement de l’athérosclérose. De plus, une stimulation avec l’Angptl2 recombinante engendre chez ces souris une réponse inflammatoire évaluée par l’expression endothéliale de cytokines et de molécules d'adhésion et par l’infiltration de leucocytes sur l’endothélium vasculaire. Finalement, l’administration intraveineuse de la protéine recombinante d’Angptl2 pendant quatre semaines à des souris LDLr-/-; hApoB-100+/+ augmente de 10 fois l'expansion de la plaque athérosclérotique et double leur taux de cholestérol circulant. Nous avons aussi montré que chez des patients athérosclérotiques, l'Angptl2 plasmatique est 6 fois plus élevée que chez des sujets sains du même âge. Nos études semblent donc définir l’Angptl2 comme un facteur contribuant directement au développement de l'athérosclérose en favorisant la sénescence, l’inflammation et l’oxydation des cellules endothéliales. Ces propriétés pourraient globalement définir l'Angptl2, non seulement comme un nouveau biomarqueur circulant de l’athérosclérose, mais également comme l'un de ses promoteurs.