Rôle de protéines épididymaires humaines et murines dans les fonctions spermatiques

L’infertilité affecte jusqu’à 15-20% des couples en âge de se reproduire. C’est pourquoi, mieux comprendre les mécanismes à la base de la fécondation est essentiel pour l’identification de nouvelles causes d’infertilité et l’optimisation des techniques de reproduction assistée. La capacitation est une étape de la maturation des spermatozoïdes qui se déroule dans le tractus génital femelle. Elle est requise pour la fécondation d’un ovocyte. Notre laboratoire a démontré que des protéines du plasma séminal bovin, appelées protéines Binder of SPerm (BSP), se lient aux phospholipides portant des groupements choline à la surface de la membrane des spermatozoïdes lors de l’éjaculation et promeuvent la capacitation. Ces protéines exprimées par les vésicules séminales sont ubiquitaires chez les mammifères et ont été étudiées chez plusieurs espèces dont l’étalon, le porc, le bouc et le bélier. Récemment, l’expression de gènes homologues aux BSP a été découverte dans les épididymes d’humains (BSPH1) et de souris (Bsph1 et Bsph2). Notre hypothèse est que les BSP chez ces deux espèces sont ajoutées aux spermatozoïdes lors de la maturation épididymaire et ont des rôles dans les fonctions spermatiques, similaires à ceux des protéines BSP bovines. Les protéines BSP humaines et murines représentent une faible fraction des protéines totales du plasma séminal. Pour cette raison, afin d’étudier leurs caractéristiques biochimiques et fonctionnelles, des protéines recombinantes ont été produites. Les protéines recombinantes ont été exprimées dans des cellules Escherichia coli origami B(DE3)pLysS en utilisant un vecteur d’expression pET32a. Suivant la lyse cellulaire, les protéines ont été dénaturées avec de l’urée et purifiées par chromatographie d’affinité sur ions métalliques immobilisés. Une fois liées à la colonne, les protéines ont été repliées à l’aide d’un gradient d’urée décroissant avant d’être éluées. Cette méthode a mené à la production de trois protéines recombinantes (rec-BSPH1 humaine, rec-BSPH1 murine et rec-BSPH2 murine) pures et fonctionnelles. Des expériences de chromatographie d’affinité et de co-sédimentation nous ont permis de démontrer que les trois protéines peuvent se lier à des ligands connus des protéines BSP comme la gélatine et l’héparine en plus de pouvoir se lier aux spermatozoïdes. Nos études ont également révélées que les deux protéines rec-BSPH1 peuvent se lier aux liposomes de phosphatidylcholine (PC) et sont capable de promouvoir la capacitation des spermatozoïdes. À l’opposé, rec-BSPH2 ne peut ni se lier aux liposomes de PC, ni stimuler la capacitation. Finalement, les protéines recombinantes n’ont aucun effet sur la réaction acrosomique ou sur la motilité des spermatozoïdes. Chez les bovins, les protéines BSP induisent la capacitation grâce des interactions avec les lipoprotéines de haute densité (HDL) et les glycosaminoglycanes. Puisque le HDL est également un joueur important de la capacitation chez la souris, le rôle de la protéine native BSPH1 murine au niveau de la capacitation induite par le HDL a été étudié. Les résultats obtenus suggèrent que, in vivo, la protéine BSPH1 de souris serait impliquée dans la capacitation via une interaction directe avec le HDL. Comme les protéines BSPH1 humaines et murines sont orthologues, ces résultats pourraient aussi s’appliquer à la fertilité humaine. Les résultats présentés dans cette thèse pourraient mener à une meilleure compréhension de la fertilité masculine et aider à améliorer les techniques de reproduction assistée. Ils pourraient également mener au développement de nouveaux tests diagnostiques ou de contraceptifs masculins.

Le rôle du stress oxydant dans les changements épigénétiques contribuant aux complications du syndrome métabolique.

La méthylation de l'ADN est l'une des modifications épigénétiques au niveau des îlots CpG. Cette modification épigénétique catalysée par les ADN méthyltransférases (DNMTs) consiste en la méthylation du carbone 5' d’une cytosine ce qui aboutit à la formation de 5-méthylcytosine. La méthylation de l'ADN est clairement impliquée dans l'inactivation des gènes et dans l'empreinte génétique. Elle est modulée par la nutrition, en particulier par les donneurs de méthyle et par une restriction protéique. Ces modifications épigénétiques persistent plus tard dans la vie et conduisent au développement de nombreuses pathologies telles que le syndrome métabolique et le diabète de type 2. En fait, de nombreux gènes clés subissent une modification de leur état de méthylation en présence des composants du syndrome métabolique. Cela montre que la méthylation de l'ADN est un processus important dans l'étiologie du syndrome métabolique. Le premier travail de ce doctorat a porté sur la rédaction d’un article de revue qui a examiné le cadre central du syndrome métabolique et analyser le rôle des modifications épigénétiques susceptibles d'influer sur l'apparition du stress oxydant et des complications cardiométaboliques. D’autre part, les cellules intestinales Caco-2/15, qui ont la capacité de se différencier et d’acquérir les caractéristiques physiologiques de l'intestin grêle, ont été utilisées et traitées avec du Fer-Ascorbate pour induire un stress oxydant. Le Fer-Ascorbate a induit une augmentation significative de l’inflammation et de la peroxydation des lipides (malondialdehyde) ainsi que des altérations de de la défense antioxydante (SOD2 et GPx) accompagnées de modifications épigénétiques. De plus, la pré-incubation des cellules avec de la 5-aza-2'-désoxycytidine, un agent de déméthylation et/ou l’antioxydant Trolox a normalisé la défense antioxydante, réduit la peroxydation des lipides et prévenu l'inflammation. Ce premier travail a démontré que les modifications du redox et l’inflammation induites par le Fer-Ascorbate peuvent impliquer des changements épigénétiques, plus particulièrement des changements dans la méthylation de l’ADN. Pour mieux définir l’impact du stress oxydant au niveau nutritionnel, des cochons d’Inde âgés de trois jours ont été séparés en trois groupes : 1) Témoins: alimentation régulière; 2) Nutrition parentérale (NP) 3) H2O2 : Témoins + 350 uM H2O2. Après quatre jours, pour un groupe, les perfusions ont été stoppées et les animaux sacrifiés pour la collecte des foies. Pour l’autre groupe d’animaux, les perfusions ont été arrêtées et les animaux ont eu un accès libre à une alimentation régulière jusqu'à la fin de l’étude, huit semaines plus tard où ils ont été sacrifiés pour la collecte des foies. Ceci a démontré qu’à une semaine de vie, l'activité DNMT et les niveaux de 5'-méthyl-2'-désoxycytidine étaient inférieurs pour les groupes NP et H2O2 par rapport aux témoins. A neuf semaines de vie, l’activité DNMT est restée basse pour le groupe NP alors que les niveaux de 5'-méthyl-2'-désoxycytidine étaient plus faibles pour les groupes NP et H2O2 par rapport aux témoins. Ce travail a démontré que l'administration de NP ou de H2O2, tôt dans la vie, induit une hypométhylation de l'ADN persistante en raison d'une inhibition de l'activité DNMT. Finalement, des souris ayant reçu une diète riche en gras et en sucre (HFHS) ont été utilisées comme modèle in vivo de syndrome métabolique. Les souris ont été nourris soit avec un régime standard chow (témoins), soit avec une diète riche en gras et en sucre (HFHS) ou avec une diète HFHS en combinaison avec du GFT505 (30 mg/kg), un double agoniste de PPARα et de PPARδ, pendant 12 semaines. La diète HFHS était efficace à induire un syndrome métabolique étant donnée l’augmentation du poids corporel, du poids hépatique, des adiposités viscérales et sous-cutanées, de l’insensibilité à l’insuline, des lipides plasmatiques et hépatiques, du stress oxydant et de l’inflammation au niveau du foie. Ces perturbations étaient accompagnées d’une déficience dans l’expression des gènes hépatiques PPARα et PPARγ concomitant avec une hyperméthylation de leurs promoteurs respectifs. L’ajout de GFT505 à la diète HFHS a empêché la plupart des effets cardiométaboliques induits par la diète HFHS via la modulation négative de l’hyperméthylation des promoteurs, résultant en l’augmentation de l’expression des gènes hépatiques PPARα et PPARγ. En conclusion, GFT505 exerce des effets métaboliques positifs en améliorant le syndrome métabolique induit par l'alimentation HFHS via des modifications épigénétiques des gènes PPARs. Ensemble, les travaux de cette thèse ont démontré que le stress oxydant provenant de la nutrition induit d’importants changements épigénétiques pouvant conduire au développement du syndrome métabolique. La nutrition apparait donc comme un facteur crucial dans la prévention de la reprogrammation fœtale et du développement du syndrome métabolique. Puisque les mécanismes suggèrent que le stress oxydant agit principalement sur les métabolites du cycle de la méthionine pour altérer l’épigénétique, une supplémentation en ces molécules ainsi qu’en antioxydants permettrait de restaurer l’équilibre redox et épigénétique.

Vulnérabilité à la chaleur dans le contexte des changements climatiques.

Thèse réalisée en cotutelle avec Université Paris 11 (Ecole Doctorale 420)

Études génétiques moléculaires des gènes de la polarité planaire cellulaire dans les anomalies du tube neural chez l’Homme

Les anomalies du tube neural (ATN) sont des malformations congénitales parmi les plus fréquentes chez l’humain en touchant 1-2 nouveau-nés par 1000 naissances. Elles résultent d’un défaut de fermeture du tube neural pendant l’embryogenèse. Les formes les plus courantes d'ATN chez l'homme sont l'anencéphalie et le spina-bifida. Leur étiologie est complexe impliquant à la fois des facteurs environnementaux et des facteurs génétiques. Un dérèglement dans la signalisation Wnt, incluant la signalisation canonique Wnt/β-caténine et non-canonique de la polarité planaire cellulaire (PCP), peut causer respectivement le cancer ou les anomalies du tube neural (ATN). Les deux voies semblent s’antagoniser mutuellement. Dans cette étude, nous investiguons les rôles de Lrp6 et deANKRD6, entant qu’interrupteurs moléculaires entre les deux voies de signalisation Wnt, et CELSR1, en tant que membre de la PCP, chez la souris mutante Skax26m1Jus, générée par l’agent mutagène N-Ethyl-N-Nitrosuera, et dans une cohorte de patients humains ATN. Pour Lrp6, nous avons démontré que Skax26m1Jus représente un allèle hypermorphe de Lrp6 avec une augmentation de l’activité de la signalisation Wnt/canonique et une diminution de l’activité JNK induite par la voie PCP. Nous avons également montré que Lrp6Skax26m1Jus interagit génétiquement avec un mutant PCP (Vangl2Lp) où les doubles hétérozygotes ont montré une fréquence élevée d’ATN et des défauts dans la polarité des cellules ciliées de la cochlée. Particulièrement, notre étude démontre l'association des nouvelles et rares mutations faux-sens dans LRP6 avec les ATN humaines. Nous montrons que trois mutations de LRP6 causent une activité canonique réduite et non-canonique élevée. Pour ANKRD6, nous avons identifié quatre nouvelles et rares mutations faux-sens chez 0,8% des patients ATN et deux chez 1,3% des contrôles. Notamment, seulement deux, des six mutations validées (p.Pro548Leu et p.Arg632His) ont démontré un effet significatif sur l’activité de ANKRD6 selon un mode hypomorphique. Pour CELSR1, nous avons identifié une mutation non-sens dans l'exon 1 qui supprime la majeure partie de la protéine et une délétionde 12 pb. Cette perte de nucléotides ne change pas le cadre de lecture et élimine un motif putatif de phosphorylation par la PKC " SSR ". Nous avons également détecté un total de 13 nouveaux et rares variants faux-sens qui avaient été prédits comme étant pathogènes in silico. Nos données confirment le rôle inhibiteur de Lrp6 dans la signalisation PCP pendant la neurulation et indiquent aussi que les mutations faux-sens identifiées chez LRP6 et ANKRD6 pourraient affecter un équilibre réciproque et un antagonisme très sensible à un dosage précis entre les deux voies Wnt. Ces variants peuvent aussi agir comme facteurs prédisposants aux ATN. En outre, nos résultats impliquent aussi CELSR1 comme un facteur de risque pour les anomalies du tube neural ou l’agénésie caudale. Nos résultats fournissent des preuves supplémentaires que la voie de signalisation PCP a un rôle pathogène dans ces malformations congénitales et un outil important pour mieux comprendre leurs mécanismes moléculaires.

Etude d'un anticoagulant oral (le rivaroxaban) sur les paramètres hémostatiques de chiens en santé

Chez le chien, les thromboses représentent une complication majeure de nombreuses conditions qui sont revues dans ce manuscrit. L’arsenal thérapeutique actuel présente certaines limites: des effets anticoagulants variables d’un patient à l’autre, des hémorragies et une administration par voie sous-cutanée pour l’héparine. Le rivaroxaban est un nouvel anticoagulant oral approuvé pour la prévention et le traitement des thromboses chez l’humain. C’est un inhibiteur direct du facteur Xa. La présente étude a pour objectif d’évaluer les effets hémostatiques du rivaroxaban chez des chiens en santé, en utilisant les tests de coagulation suivants: temps de prothrombine (PT), temps partiel de thromboplastine (aPTT), activité anti-facteur X, génération de thrombine (GT) et thromboélastographie (TEG®). Tout d’abord, l’effet anticoagulant du rivaroxaban a été évalué in vitro : le plasma citraté pauvre en plaquettes provenant de 20 Beagle en santé a été aliquoté et enrichi avec des solutions de rivaroxaban à des concentrations de 0 à 1000 mg/L d’anticoagulant. Une prolongation concentration-dépendante de tous les tests de coagulation a été notée. Les concentrations de 0.024 et 0.053 mg/L diminuent respectivement de 50% la vitesse de propagation de la GT et la densité optique de l’activité anti-facteur X. Ces derniers tests sont les plus sensibles et précis pour détecter l’effet anticoagulant du rivaroxaban. Ensuite, 24 Beagle en santé ont été répartis aléatoirement en 3 groupes (n=8). Chaque groupe a reçu par voie orale un placebo, ou 20 mg de rivaroxaban une ou deux fois à 8h d’intervalle. Quinze échantillons sanguins ont été prélevés pour chaque chien sur 30 heures. Pour tous les tests de coagulation excepté la TEG®, une différence significative a été notée dans les résultats entre les groupes traités et le groupe placebo (p<0.0001). La durée de l’effet anticoagulant du rivaroxaban était de 7.9-18.7h dans le groupe traité une fois; et de 17.5-26.8h dans le groupe traité deux fois. Le pic d’action de l’effet anticoagulant était d’environ 2h. Seul le paramètre R de la TEG® était significativement affecté dans les groupes traités. En conclusion, le rivaroxaban exerce un effet anticoagulant chez le chien à la dose de 2 mg/kg. Une administration biquotidienne semble appropriée pour un effet de 24h.

Éclaircissement de l’association entre la relation enseignant-élève, le partenariat mère-enfant, et l’adaptation scolaire auprès d’une clientèle à risque.

Résumé L'association entre la relation mère-enfant, la relation enseignant-élève et l'adaptation scolaire (compétences cognitives et sociaux) a reçu ultérieurement une attention considérable dans la littérature scientifique. En dépit de la quantité de recherches effectuées, il subsiste un besoin afin de mieux connaître les processus sous-jacent qui jouent un rôle dans cette relation. L’objectif de la recherche actuelle consiste en l’éclaircissement de l’association entre la relation enseignant-élève, le partenariat mère-enfant, et l’adaptation scolaire. Les différentes hypothèses de recherche étaient : la qualité de la relation enseignant-élève servira de facteur de protection à l’adaptation scolaire (ou à une des composantes) chez les enfants nés de mères adolescentes dont le partenariat mère-enfant est de moindre qualité; la deuxième hypothèse était que le partenariat mère-enfant prédirait la qualité de la relation enseignant-élève, qui prédirait par la suite l’adaptation à la maternelle des enfants nés de mères adolescentes. Finalement, la troisième hypothèse de recherche est que les deux relations (partenariat mère-enfant et relation enseignant-élève) contribuent de façon unique à l’adaptation scolaire. Ainsi, trois modèles d’association possibles ont été testé (modération, médiation et contributions uniques et additives) auprès d’une population à risque, soit les enfants de 5 ans nés d’une mère adolescente. L’échantillon provient d’un projet longitudinal prospectif, la «Mère-Veille,» et est composé de 30 dyades mère-enfant (N=30). La qualité du partenariat mère-enfant, évalué en laboratoire lorsque les enfants avaient 4 ans, a été mesurée à l’aide des récits narratifs co-construits. La qualité de la relation enseignant-élève a été mesurée via l’adaptation française du student teacher relationship scale à 5 ans. Finalement, la mesure de l’adaptation scolaire (comme variable dépendante) comprenant les compétences en numération et les dimensions comportementales (comportements intériorisés, extériorisés et compétences sociales) ont été évalué respectivement par l’entremise de l’adaptation française du number knowledge test et du profil socioaffectif. Une série de régressions linéaires (avec et sans variables contrôles) ont été effectuées pour estimer les trois modèles. La réponse aux hypothèses varie en fonction des différentes composantes de l’adaptation scolaire. Sommes toutes, nos résultats ne suggèrent aucune relation significative ni processus intermédiaires.

Understanding the transcriptional control of EIF4E and its dysregulation in acute myeloid leukemia: role of NF-κB

EIF4E, le facteur d’initiation de la traduction chez les eucaryotes est un oncogène puissant et qui se trouve induit dans plusieurs types de cancers, parmi lesquels les sous-types M4 et M5 de la leucémie aiguë myéloblastique (LAM). EIF4E est régulé à plusieurs niveaux cependant, la régulation transcriptionnelle de ce gène est peu connue. Mes résultats montrent que EIF4E est une cible transcriptionnelle directe du facteur nucléaire « kappa-light- chain- enhancer of activated B cells » (NF-κB).Dans les cellules hématopoïétiques primaires et les lignées cellulaires, les niveaux de EIF4E sont induits par des inducteurs de NF-κB. En effet, l’inactivation pharmaceutique ou génétique de NF-κB réprime l’activation de EIF4E. En effet, suite à l’activation de NF-κB chez l’humain, le promoteur endogène de EIF4E recrute p65 (RelA) et c-Rel aux sites évolutionnaires conservés κB in vitro et in vivo en même temps que p300 ainsi que la forme phosphorylée de Pol II. De plus, p65 est sélectivement associé au promoteur de EIF4E dans les sous-types LAM M4/M5 mais non pas dans les autres sous-types LAM ou dans les cellules hématopoïétiques primaires normales. Ceci indique que ce processus représente un facteur essentiel qui détermine l’expression différentielle de EIF4E dans la LAM. Les analyses de données d’expressions par séquençage de l’ARN provenant du « Cancer Genome Atlas » (TCGA) suggèrent que les niveaux d’ARNm de EIF4E et RELA se trouvent augmentés dans les cas LAM à pronostic intermédiaire ou faible mais non pas dans les groupes cytogénétiquement favorables. De plus, des niveaux élevés d’ARNm de EIF4E et RELA sont significativement associés avec un taux de survie relativement bas chez les patients. En effet, les sites uniques κB se trouvant dans le promoteur de EIF4E recrutent le régulateur de transcription NF-κB p65 dans 47 nouvelles cibles prévues. Finalement, 6 nouveaux facteurs de transcription potentiellement impliqués dans la régulation du gène EIF4E ont été prédits par des analyses de données ChIP-Seq provenant de l’encyclopédie des éléments d’ADN (ENCODE). Collectivement, ces résultats fournissent de nouveaux aperçus sur le control transcriptionnel de EIF4E et offrent une nouvelle base moléculaire pour sa dérégulation dans au moins un sous-groupe de spécimens de LAM. L’étude et la compréhension de ce niveau de régulation dans le contexte de spécimens de patients s’avère important pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant l’expression du gène EIF4E moyennant des inhibiteurs de NF-κB en combinaison avec la ribavirine.

Problèmes de commande optimale stochastique généralisés

Cette thèse est divisée en deux grands chapitres, dont le premier porte sur des problèmes de commande optimale en dimension un et le deuxième sur des problèmes en dimension deux ou plus. Notons bien que, dans cette thèse, nous avons supposé que le facteur temps n'intervient pas. Dans le premier chapitre, nous calculons, au début, l'équation de programmation dynamique pour la valeur minimale F de l'espérance mathématique de la fonction de coût considérée. Ensuite, nous utilisons le théorème de Whittle qui est applicable seulement si une condition entre le bruit blanc v et les termes b et q associés à la commande est satisfaite. Sinon, nous procédons autrement. En effet, un changement de variable transforme notre équation en une équation de Riccati en G= F', mais sans conditions initiales. Dans certains cas, à partir de la symétrie des paramètres infinitésimaux et de q, nous pouvons en déduire le point x' où G(x')=0. Si ce n'est pas le cas, nous nous limitons à des bonnes approximations. Cette même démarche est toujours possible si nous sommes dans des situations particulières, par exemple, lorsque nous avons une seule barrière. Dans le deuxième chapitre, nous traitons les problèmes en dimension deux ou plus. Puisque la condition de Whittle est difficile à satisfaire dans ce cas, nous essayons de généraliser les résultats du premier chapitre. Nous utilisons alors dans quelques exemples la méthode des similitudes, qui permet de transformer le problème en dimension un. Ensuite, nous proposons une nouvelle méthode de résolution. Cette dernière linéarise l'équation de programmation dynamique qui est une équation aux dérivées partielles non linéaire. Il reste à la fin à trouver les conditions initiales pour la nouvelle fonction et aussi à vérifier que les n expressions obtenues pour F sont équivalentes.

Trajectoires socioprofessionnelles des immigrants africains subsahariens de Montréal accédant à des fonctions socioéconomiques valorisées

Les immigrants à Montréal (Québec, Canada) connaissent des difficultés d’insertion en emploi. Parmi eux, ceux originaires de l’Afrique subsaharienne constituent des «groupes racisés» et, à ce titre, sont susceptibles d’éprouver davantage de discriminations et de difficultés que les autres (Hadiri, 2008; Nikuze, 2011). Grâce à une sociologie des "trajectoires de réussites" et grâce à des questions mobilisant l'apport de plusieurs disciplines dans une perspective de résolution de problèmes pratiques, cette thèse a pour but de proposer de possibles solutions aux différents problèmes de ces immigrants montréalais. La recherche de terrain, basée sur des entretiens compréhensifs au sens où l’entend Kaufmann (1996, 2008), propose une sociologie qualitative des "trajectoires de réussites", soit des expériences socioprofessionnelles vécues comme « valorisantes » ou « valorisées. » L’échantillon a été formé d’immigrants africains vivant de telles expériences. À travers leurs différentes trajectoires, la recherche a reposé sur cet objectif appliqué premier : partir du questionnement central sur les facteurs de réussite, rechercher des solutions et des instruments d'intervention destinés à une meilleure intégration socioéconomique des nouveaux immigrants, ou même des anciens immigrants qui connaissent encore des difficultés d’insertion en emploi. Les résultats laissent entrevoir trois catégories de facteurs contributifs à la base de la «réussite socioprofessionnelle», tous rangés au titre de « valeurs », ou façons de voir le monde capables de contribuer à cette « réussite » en s’harmonisant mieux au contexte québécois : il s’agit de valeurs personnelles, d’apports socioculturels africains ou encore de ressources socioculturelles de type québécois. Si les valeurs personnelles relèvent des caractéristiques propres à chacun, les ressources socioculturelles africaines et québécoises résulteraient plutôt de traditions ou de mœurs inhérentes aux cultures des pays concernés. L’analyse et l’interprétation de ces facteurs propices à l’intégration socioprofessionnelle des immigrants ont révélé plusieurs pistes capables de faciliter l’insertion en emploi des immigrants et cette thèse en fait état. Il demeure certain, face à des résultats qui mettent en évidence surtout le facteur individuel, que la « réussite » et l’insertion « réussie » ou vécue comme telle demeurent aussi fonction des actes des autorités publiques : quelles que soient les valeurs et les dispositions individuelles des immigrants, ces facteurs positifs demeurent sans effets si lois et politiques du domaine de l’immigration font obstacle de quelque façon.

Mémoire concernant les effets néfastes de l’exposition au bruit chez les travailleurs au Québec

1) personne contact parmi le groupe julie-emilie.huot-marchand@umontreal.ca 2) adresse URL : https://www.facebook.com/bruitsantee

Feedback regulation of Gab2-dependent signaling by the Ras/MAPK pathway

La voie de signalisation des Récepteurs Tyrosine Kinase (RTK) occupe un rôle central dans la régulation de la croissance cellulaire, la prolifération, la différentiation et la motilité. Une régulation anormale des RTKs mène à plusieurs maladies humaines telles que le cancer du sein, la seconde cause de mortalité chez les femmes à cause de l’amplification et la mutation fréquente de la protéine tyrosine kinase HER2 (ERBB2). Grb2-associated binder (Gab) 2 est une protéine adaptatrice qui agit en aval de plusieurs RTKs, y compris HER2, pour réguler de multiples voies de signalisation. En réponse à la stimulation par de nombreux facteurs de croissances et cytokines, Gab2 est recruté à la membrane plasmique où il potentialise l’activation des voies de signalisation Ras/mitogen-activated protein kinase (MAPK) et PI3K (phosphatidylinositol-3-kinase)/Akt (protein kinase B). En plus d’occuper un rôle essentiel durant le développement du système hématopoïétique, Gab2 est souvent amplifié dans les cancers, notamment le cancer du sein et les mélanomes. Cependant, les mécanismes moléculaires qui régulent le fonctionnement de Gab2 sont peu connus. Il est établi que lors de l’activation des RTKs, Gab2 est phosphorylé au niveau de plusieurs résidus Tyrosine, menant à l’association de différentes protéines comme p85 et Shp2. En plus de la phosphorylation en Tyrosine, notre laboratoire ainsi que d’autres groupes de recherche avons identifié que Gab2 est aussi phosphorylé au niveau de résidus Ser/Thr suite à l’activation de la voie de signalisation MAPK. Cependant, la régulation des fonctions de Gab2 par ces modifications post-traductionnelles est encore peu connue. Dans le but de comprendre comment Gab2 est régulé par la voie de signalisation MAPK, nous avons utilisé différentes approches. Dans la première partie de ma thèse, nous avons déterminé un nouveau mécanisme démontrant que la voie de signalisation Ras/MAPK, par le biais des protéines kinases RSK (p90 ribosomal S6 kinase), phosphoryle Gab2. Ce phénomène se produit à la fois in vivo et in vitro au niveau de trois résidus Ser/Thr conservés. Des mutations au niveau de ces sites de phosphorylation entrainent le recrutement de Shp2 menant à l’augmentation de la motilité cellulaire, ce qui suggère que les protéines RSK restreignent les fonctions dépendantes de Gab2. Ce phénomène est le résultat de la participation de RSK dans la boucle de rétroaction négative de la voie de signalisation MAPK. Dans la seconde partie de ma thèse, nous avons démontré que les protéines ERK1/2 phosphorylent Gab2 au niveau de plusieurs résidus pS/T-P à la fois in vitro et in vivo, entrainant l’inhibition du recrutement de p85. De plus, nous avons établi pour la première fois que Gab2 interagit physiquement avec ERK1/2 dans des cellules lors de l’activation de la voie de signalisation MAPK. Par ailleurs, nous avons montré un nouveau domaine d’attache du module ERK1/2 sur Gab2. Des mutations sur les résidus essentiels de ce domaine d’attache n’entrainent pas seulement la dissociation de ERK1/2 avec Gab2, mais diminuent également la phosphorylation dépendante de ERK1/2 sur Gab2. Ainsi, nos données montrent que la voie de signalisation MAPK régule les fonctions de la protéine Gab2 par le biais des kinases RSK et ERK1/2. Cette thèse élabore par ailleurs un schéma complet des fonctions de Gab2 dépendantes de la voie de signalisation MAPK dans le développement de nombreux cancers.

Identification de déterminants impliqués dans la différenciation des cellules souches embryonnaires

Les cellules souches ont attiré l’attention du public ces dernières années, grâce non-seulement à leur utilisation comme thérapies visant à s’attaquer à certains types de cancers, mais aussi en relation avec leur potentiel dans le domaine de la médecine regénérative. Il est établi que le destin cellulaire des cellules souches embryonnaires (ESC) est régulé de façon intensive par un groupe de facteur clés agissant sur leur pluripotence. Il est néanmoins envisageable que certains déterminants influençant l’auto-renouvellement et la différenciation de ces cellules soient toujours inconnus. Afin de tester cette hypothèse, nous avons généré, en utilisant une méthode par infections virales, une collection de ESC contenant des délétions chromosomales chevauchantes que nous avons baptisée DelES (Deletion in ES cells). Cette librairie contient plus de 1000 clones indépendants dont les régions délétées couvrent environ 25% du génome murin. À l’aide de cette ressource, nous avons conduit un criblage de formation de corps embryoïdes (EB), démontrant que plusieurs clones délétés avaient un phénotype de différenciation anormal. Nos études de complémentation sur un groupe de clones ont par la suite permis l’identification de Rps14 - un gène codant pour une protéine ribosomale (RP) comme étant haploinsuffisant pour la formation de EB. Dans un deuxième temps, l’analyse approfondie des résultats de notre crible a permis d’identifier un groupe de gènes codants pour des RP qui semblent essentiels pour la différenciation des ESC, mais dispensables pour leur auto-renouvellement. De manière intéressante, les phénotypes anormaux de formation en EB les plus marqués sont associés à des délétions de RP qui se retrouvent au site de sortie des ARN messagers (ARNm) du ribosome, soit Rps5, Rps14 et Rps28. Étonnament, alors qu’un débalancement des RP conduit généralement à une réponse de type p53, l’haploinsuffisance de ces trois gènes ne peut être renversée par une simple réduction des niveaux d’expression de ce gène suppresseur de tumeurs. Finalement, nos études de profilage polysomal et de séquençage à haut-débit montrent une signature spécifique de gènes liés au mésoderme chez un clone hétérozygote pour Rps5, suggérant ainsi une explication au phénotype de différenciation p53-indépendant identifié chez ces ESC. Nos travaux rapportent donc la création d’une ressource intéressante de génomique fonctionnelle qui a permis de mettre à jour le rôle essentiel que jouent les RP dans le processus de formation de EB. Nos résultats permettent aussi de documenter une réponse p53-indépendante suite à un débalancement de RP dans un contexte opposant l’auto-renouvellement et la différenciation des ESC.

Représentation et identité collective dans la collaboration interorganisationnelle : le cas de la Table québécoise de la sécurité routière

Les collaborations interorganisationnelles apparaissent de plus en plus incontournables pour s’attaquer concrètement, et avec quelques chances de résultats, à nos problèmes et défis collectifs les plus importants, que ce soit dans les domaines de l’environnement, de la santé ou de la sécurité publique. Ces initiatives de gouvernance collaborative surpassent chacune des organisations individuelles pour décider et intervenir collectivement. Dans cette visée, cette recherche contribue à mieux comprendre le processus de concertation et les interactions entre les acteurs et les organisations qui participent à des initiatives de collaboration interorganisationnelle où de nombreuses parties prenantes sont interpellées. Plus précisément, cette étude porte sur la problématique des réseaux d’acteurs et de la gouvernance en sécurité routière au Québec. Nous nous sommes penchés sur l’expérience de la Table québécoise de la sécurité routière (TQSR) afin de comprendre les enjeux actuels de représentation et de concertation en matière d’action gouvernementale. Cette recherche examine le rôle de l’identité des acteurs et de leurs interactions dans les processus de construction de consensus et de prise de décision, de même que les divers enjeux de communication inhérents à ce genre d’exercice collectif. Nous démontrons également qu’un facteur de succès d’une collaboration interorganisationnelle repose sur la capacité des acteurs à construire une identité collective malgré leurs intérêts divergents et parfois opposés. Cette thèse améliore donc notre compréhension des mécanismes et des processus à la base des collaborations interorganisationnelles comme pratique de gouvernance collaborative, un mode de gestion de plus en plus utilisé dans l’administration de nos sociétés contemporaines. Cette thèse contribue également à montrer la manière dont les organisations se construisent et se maintiennent localement par l’entremise de la communication et de ses modalités.

Pathogenèse de l’oedème cérébral dans l’encéphalopathie hépatique minimale : rôles du stress oxydatif et du lactate

L’encéphalopathie hépatique (EH) est un syndrome neuropsychiatrique découlant des complications de l'insuffisance hépatique. Les patients souffrant d'une insuffisance hépatique chronique (IHC) présentent fréquemment une EH minimale (EHM) caractérisée par des dysfonctions cognitives subtiles qui affectent leur qualité de vie. L'insuffisance hépatique entraîne une hyperammoniémie, le facteur central dans la pathogenèse de l'EH. Pourtant, les taux d'ammoniaque sérique ne sont pas corrélés avec la sévérité de l'EH lors d'une IHC, suggérant que d'autres facteurs y contribuent. L'oedème cérébral est une caractéristique neuropathologique décrite chez les patients souffrant d'une EHM et plusieurs facteurs dont le stress oxydatif, les altérations du métabolisme énergétique et l'augmentation de la glutamine cérébrale pourraient contribuer à la pathogenèse de l'oedème cérébral lors d'une EHM induite par une IHC. Les mécanismes sous-jacents exacts ainsi que les relations entre ces facteurs et l'ammoniaque ne sont pas connus. Présentement, le seul traitement efficace de l'IHC est la transplantation hépatique, une option thérapeutique très limitée. Le but de cette thèse est de contribuer à l'avancement des connaissances sur les mécanismes sous-jacents liés au rôle du stress oxydatif, de la glutamine et du lactate dans la pathogenèse de l'oedème cérébral lors d'une EHM induite par une IHC afin d'envisager de nouvelles options thérapeutiques. Les objectifs précis étaient: 1. Établir le rôle de l’ammoniaque et sa relation avec le stress oxydatif dans la pathogenèse de l'oedème cérébral lors d'une EHM induite par une IHC. 2. Établir le rôle du stress oxydatif dans la pathogenèse de l'oedème cérébral, sa relation avec l'ammoniaque et l'effet du traitement avec des antioxydants. 3. Confirmer l'effet synergique entre l'ammoniaque et le stress oxydatif dans la pathogenèse de l'oedème cérébral. 4. Établir le rôle du lactate et de la glutamine dans la pathogenèse de l'oedème cérébral et leur relation avec l’ammoniaque. Pour atteindre ces objectifs, 2 modèles animaux d'EHM obtenus par microchirurgie chez le rat ont été utilisés: 1) la ligature de voie biliaire, un modèle d'IHC et 2) l'anastomose porto-cave, un modèle d'hyperammoniémie induite par la dérivation portosystémique. Nos résultats démontrent que l'ammoniaque et le stress oxydatif indépendamment n'induisent pas l'oedème cérébral lors d'une EHM. Pourtant, lorsque les 2 facteurs agissent ensemble ils présentent ii un effet synergique qui entraîne le développement de l'oedème cérébral, le stress oxydatif étant une première insulte, qui est suivie par l'hyperammoniémie comme deuxième insulte. En plus, le stress oxydatif a été mis en évidence seulement au niveau systémique, et non au niveau central dans notre modèle d'IHC en association avec l'oedème cérébral, suggérant que le stress oxydatif systémique est une conséquence de la dysfonction hépatique et que l'hyperammoniémie n’induit pas le stress oxydatif ni systémique ni central. Nous avons démontré qu’une augmentation du lactate cérébral est une conséquence directe de l'hyperammoniémie et joue un rôle important dans la pathogenèse de l'oedème cérébral lors d'une EHM induite par une IHC, tandis qu’une augmentation de la glutamine au niveau cérébral n'est pas un facteur clé. La compréhension de ces mécanismes a entraîné la proposition de 3 nouvelles stratégies thérapeutiques potentielles pour l'EHM. Elles ciblent la diminution de l'ammoniaque sérique, la réduction du stress oxydatif et l'inhibition de la synthèse du lactate.

Mécanismes moléculaires régulant la pathologie dendritique dans la rétine adulte lésée in vivo

Les dendrites sont essentielles pour la réception et l’intégration des stimuli afférents dans les neurones. De plus en plus d’évidences d’une détérioration dendritique sont associées à une axonopathie dans les maladies neurodégénératives. Le glaucome dont la physiopathologie est caractérisée par une détérioration progressive et irréversible des cellules ganglionnaires de la rétine (CGRs) est la première cause de cécité irréversible dans le monde. Son évolution est associée à un amincissement graduel des axones et à l’atrophie des somas des CGRs. La majorité des études de neuroprotection des neuropathies rétiniennes visent la survie et la protection des somas et des axones. Des études récentes ont démontré des changements dendritiques associés à cette pathologie, toutefois les mécanismes moléculaires les régulant sont méconnus. L’hypothèse principale de ma thèse stipule qu’une lésion axonale entraîne des altérations précoces des structures dendritiques. L’identification de voies de signalisation régulant ces changements permettrait d’élaborer des stratégies de neuroprotection et de rétablir la fonction de ces neurones. Dans la première étude, nous avons examiné l’effet précoce d’une lésion axonale aigüe sur la morphologie dendritique des CGRs in vivo. En utilisant des souris transgéniques exprimant la protéine fluorescente jaune (YFP) soumises à une axotomie, nous avons démontré un rétrécissement de l’arbre dendritique des CGRs et une diminution sélective de l’activité de mTOR avant le début de la mort des CGRs lésées. Aussi nous avons démontré une augmentation de l’expression de la protéine Regulated in development and DNA damage response 2 (REDD2), un régulateur négatif en amont de la protéine mTOR en réponse à la lésion du nerf optique in vivo. Nous avons démontré que la réactivation de mTOR par l’inhibition de l’expression de REDD2 préserve les arbres dendritiques des CGRs adultes. En effet, l’injection de petits ARN d’interférence contre la REDD2 (siREDD2) stimule l’activité de mTOR dans les CGRs lésées et augmente significativement la longueur et la surface dendritique totale. De plus, la rapamycine, un inhibiteur de mTOR, inhibe complètement l’effet du siREDD2 sur la croissance et l’élaboration des dendrites. L’analyse électrophysiologique des CGRs démontre une augmentation de l’excitabilité des CGRs lésées qui est restaurée en présence du siREDD2. Par ailleurs, des données récentes ont mis en évidence l’implication de la neuro-inflammation dans le glaucome, caractérisée par une augmentation de cytokines pro-inflammatoires dont principalement le facteur de nécrose tumorale (TNFα). Ainsi dans la deuxième étude nous avons examiné l’effet du TNF exogène sur la morphologie de l’arbre dendritique des CGRs et commencé l’étude des mécanismes moléculaires sous-jacents à ces changements. Nos résultats démontrent que l’injection de TNF recombinante dans le vitrée induit une rétraction dendritique précoce qui corrèle à une réduction de phospho-S6 suggérant l’implication de mTOR dans ces CGRs lésées. Ainsi, les études présentées dans cette thèse mettent en évidence un nouveau rôle de mTOR dans la stabilité et le maintien des dendrites de neurones rétiniennes adultes. Ces études ont aussi démontré l’effet précoce de stress direct ou indirect, c’est-à-dire l’axotomie et le TNFα respectivement sur la pathologie dendritique et sur leur effet sur la fonction neuronale.