790 resultados para signalisation cellulaire
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Le long bio-polymre d'ADN est condens lintrieur du noyau des cellules eukaryotes l'aide de petites protines appeles histones. En plus de leurs fonctions condensatrices,ces histones sont galement la cible de nombreuses modifications post-traductionnelles(MPT), particulirement au niveau de leur section N-terminale. Ces modifications rversibles font partie dun code dhistones pi-gntique transmissible qui orchestre et module dynamiquement certains vnements impliquant la chromatine, tels lactivation et la dsactivation de gnes ainsi que la duplication et la rparation dADN. Ces modifications sont impliques subsquemment dans la signalisation et la progression de cancers, tels que la leucmie. En consquence, l'lucidation des modifications dhistones est importante pour comprendre leurs fonctions biologiques. Une mthodologie analytique a t mise au point en laboratoire pour isoler, dtecter, et quantifier les MPT dhistones en utilisant une approche rapide deux volets laide doutils bioinformatiques spcialiss. La mthodologie dveloppe en laboratoire a t valide en utilisant des histones de souche sauvage ainsi que deux types dhistones mutants dficients en enzymes actyltransferase. Des trois sources dhistones utilises, la seule MPT qui a dmontr un changement significatif est lactylation de lhistone H3 lysine 56 (H3K56ac). Lexpression et la stoechiomtrie de cette MPT, issue de cellules de souche sauvage et de cellules mutantes, ont t dtermines avec prcision et compares. Les fonctions de balayage polyvalentes d'un instrument trappe ionique quadruple linaire hybride ont t utilises pour amliorer la dtection de protines intactes. Le mode de balayage enhanced multiply charged (EMC) a t modifi pour contenir et dtecter les ions de protines intactes situes dans la trappe ionique linaire. Ce mode de balayage nomm targeted EMC (tEMC) a permis de quadrupler le niveau de sensibilit (signal/interfrence), et quintupler la rsolution du mode de balayage conventionnel. De plus, la capacit de sparation des charges du tEMC a rduit de faon significative les effets de space charge dans la trappe ionique linaire. La rsolution suprieure du mode tEMC a permis de diffrencier plusieurs isoformes modifies, particulirement pour lhistone H3. Lanalyse des peptides dhistones trypsiques laide du mode de balayage MRM a permis le squenage et la quantification de MPT avec un haut degr de prcision. La seule MPT qui tait sous-exprime entre lhistone de souche sauvage et le mutant DOT1L fut la mthylation de lhistone H3 lysine 79(H3K79me1). Les effets de deux inhibiteurs denzymes HDAC (HDACi) sur lexpression de MPT dhistone ont t valus en utilisant la mthodologie analytique mentionne. Les histones extraites de cellules normales et cancreuses ont t exposes du Vorinostat(SAHA) ou du Entinostat (MS-275) pour une priode de 24 72 heures. Deux histones furent principalement affectes, soit H3 et H4. tonnamment, les mmes effets n'ont pas t dtects lorsque les cellules normales ont t traites avec le HDACi pour une priode de 48 72 heures. Une mthode absolue de quantification avec une courbe dtalonnage a t dveloppe pour le peptide H3K56ac. Contrairement certaines publications, nos rsultats dmontrent que cette MPT est prsente dans les cellules mammifres avec une stoechiomtrie trs basse (< 0,1%) et n'est pas surexprime de faon significative aprs le traitement au HDACi.
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Le cancer pithlial de lovaire (EOC) est le plus mortel des cancers gyncologiques. Cette maladie complexe progresse rapidement de faon difficilement dcelable aux stades prcoces. De plus, malgr une chirurgie cytorductive et des traitements de chimiothrapie le taux de survie des patientes diagnostiques aux stades avances demeurt faible. Dans le but dtudier lEOC dans un contexte ex vivo, lutilisation de modles cellulaires est indispensable. Les lignes cellulaires dEOC sont un outil pratique pour la recherche cependant, la faon dont l'expression des gnes est affecte en culture par comparaison la tumeur d'origine n'est pas encore bien lucide. Notre objectif tait donc de dvelopper et de caractriser de nouveaux modles de culture in vitro qui rflteront plus fidlement la maladie in vivo. Nous avons tout dabord utiliser des lignes cellulaires disponibles au laboratoire afin de mettre au point un modle 3D de culture in vitro dEOC. Des sphrodes ont t gnrs laide de la mthode des gouttelettes inverses, une mthode pionnire pour la culture des cellules tumorales. Nous avons ensuite procd une analyse des profils dexpression afin de comparer le modle sphrode au modle de culture en monocouche et le modle xnogreffe in vivo. Ainsi, nous avons identifi des gnes stratifiant les modles tridimensionnels, tant in vivo quin vitro, du modle 2D monocouche. Parmi les meilleurs candidats, nous avons slectionn S100A6 pour une caractrisation ultrieure. Lexpression de ce gne ft module afin dtudier limpact de son inhibition sur les paramtres de croissance des sphrodes. Linhibition de ce gne a comme effet de rduire la motilit cellulaire mais seulement au niveau du modle sphrode. Finalement, toujours dans loptique de dvelopper des modles dEOC les plus reprsentatifs de la maladie in vivo, nous avons russi dvelopper des lignes cellulaires uniques drives de patientes atteintes dEOC du type sreux, soit le plus commun des EOC. Jusque l, trs peu de lignes cellulaires provenant de ce type de cancer et de patientes nayant pas reu de chimiothrapie ont t produites. De plus, nous avons pour la premire fois caractrise des lignes dEOC de type sreux provenant la fois de lascite et de la tumeur solide de la mme patiente.
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Lacide rtinoque (AR) est le ligand des rcepteurs nuclaires RAR et RXR qui agissent comme facteurs de transcription ligand-inductibles et mdient ses effets biologiques. Il est connu que lAR a des proprits prodiffrenciatrices et antiprolifratives, notamment sur les cellules de lpithlium mammaire. Une perte de sensibilit de lAR a toutefois t mise en vidence dans plusieurs lignes cellulaires mammaires cancreuses, ce qui pourrait faciliter la croissance des tumeurs. Or jusquici cette perte de sensibilit avait t attribue des dfauts de la voie de signalisation de lAR, cause par la perte de lexpression des rcepteurs lAR dans la tumeur, bien que plusieurs lignes de cellules cancreuses y soient tout de mme trs sensibles. Peu dtudes se sont intresses au rle de la voie de synthse de lAR dans la transformation des cellules mammaires. En effet, lAR est synthtis partir de la vitamine A, ou rtinol, son prcurseur sanguin provenant de la dite. Les cellules de lpithlium mammaire normales ont la capacit de synthtiser lAR partir du rtinol. Nos rapportons pour la premire fois que lpithlium mammaire est probablement le sige de la synthse et de la signalisation de lAR. Cela est d, au moins en partie, lexpression dune enzyme de synthse de lAR, RALDH3, dans lpithlium mammaire normal. Dans cette tude, nous dmontrons que les cellules cancreuses de type luminal, qui ont sensibles lAR (et qui expriment le rcepteur des estrognes ER, catgorie qui regroupe 75 % des tumeurs diagnostiques) nont au contraire pas la capacit de sythtiser lAR, probablement en raison dune faible expression de RALDH3 dans les tumeurs, sous leffet des estrognes. Cela pourrait reprsenter un nouveau mcanisme favorisant la croissance des tumeurs luminales dont les cellules prolifrent en prsence du rtinol sanguin. RALDH1, une autre enzyme de la voie de synthse de lAR, et qui partage 70 % didentit de squence avec RALDH3, est un marqueur de tumeurs plus agressives et de la formation de mtastase. Nous montrons au contraire, que RALDH3 est un marqueur dune moindre probabilit de dvelopper des mtastases chez les patientes atteintes dune tumeur luminale. Cela suggre des rles different pour ces deux enzymes dans la glande mammaire. Nos rsultats indiquent que RALDH1 et 3 ont des proprits enzymatiques trs diffrentes, ce qui est en accord avec cette dernire hypothse. Nos donnes suggrent aussi que RALDH1 et 3 pourraient tre des marqueurs de populations distinctes de cellules dans la glande mammaire normale. Nous proposons dexploiter les diffrences entre RALDH1 et 3 afin de mettre au point des mthodes de sparation des diffrentes population de cellules de lpithlium mammaire ce qui pourrait aider comprendre le rle de la synthse dAR dans ce tissu.
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La technique de clonage par transfert nuclaire de cellules somatiques (SCNT) prsente une page importante dans les annales scientifiques, mais son application pratique demeure incertaine d son faible taux de succs. Les anomalies placentaires et de dveloppement ftal se traduisent par des pertes importantes de gestation et des mortalits nonatales. Dans un premier temps, la prsente tude a caractris les changements morphologiques des membranes ftales durant la gestation clone en les comparant des gestations contrles obtenues partir de linsmination artificielle. Les diffrentes anomalies morphologiques des placentomes telles que ldme chorioallantoique, la prsence de zones hyperchoiques et irrgulires dans la membrane amniotique et la prsence de cellules inflammatoires dgnres compromettent le dveloppement ftal normal de la gestation clone. Lexamen ultrasonographique reprsente une technique diagnostique importante pour faire le suivi dune gestation et de caractriser les changements placentaires dans le cadre dvaluation globale du bien-tre ftal. Le profil hormonal de trois strodes (progestrone (P4), estrone sulfate (E1S), et stradiol (E2)) et de la protine B spcifique de gestation (PSPB) dans le srum des vaches porteuses de clones SCNT a t dtermin et associ aux anomalies de gestations clones. Une diminution de la P4 srique au jour 80, une lvation du niveau de la concentration de la PSPB au jour 150, et une augmentation de la concentration dE2 srique durant le deuxime et troisime tiers de la gestation clone concident avec les anomalies de gestation dj reportes. Ces changements du profil hormonal associs aux anomalies phnotypiques du placenta compromettent le droulement normal de la gestation clone et gnent le dveloppement et le bien-tre ftal. Sur la base des observations faites sur le placenta de gestation clone, le mcanisme molculaire pouvant expliquer la disparition de lpithlium du placenta (linterface entre le tissue maternel et le placenta) a t tudi. Ltude a identifi des changements dans lexpression de deux protines dadhrence (E-cadhrin et -catenin) de cellules pithliales pouvant tre associes aux anomalies du placenta chez les gestations clones. Le tissu de cotyldons provenant de gestations clones et contrles a t analys par Western blot, RT-PCR quantitatif, et par immunohistochimie. Les rsultats prsentaient une diminution significative (p<0.05) de lexpression des dites protines dans les cellules trophoblastiques chez les gestations clones. Le RT-PCR quantitatif dmontrait que les gnes CCND1, CLDN1 et MSX1 cibls par la voie de signalisation de la Wnt/-catenin taient significativement sous exprims. La diminution de lexpression des protines E-cadherin et -catenin avec une rduction de lactivation de la protine -catenin durant le priode dattachement de lembryon peut potentiellement expliquer labsence totale ou partielle de lattachement des membranes ftales au tissu maternel et ventuellement, linsuffisance placentaire caractristique des gestations clones chez la vache. La caractrisation morphologique et fonctionnelle du placenta durant les gestations clones haut risque est essentielle pour valuer le statut de la gestation. Les rsultats de la prsente tude permettront de prdire le dveloppement et le bien-tre ftal de faon critique travers un protocole standardis et permettre des interventions mdicales pour amliorer le taux de succs des gestations clones chez les bovins.
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Les microARNs sont des petits ARNs non codants d'environ 22 nuclotides qui rgulent ngativement la traduction de l'ARN messager cible (ARNm) et ont donc des fonctions cellulaires. Le microARN-16 (miR-16) est connu pour ses effets antiprolifratifs. Nous avons observ que lexpression de miR-16 est diminue dans les cellules endothliales humaines snescentes et quiescentes en comparaison des cellules prolifratives. Une analyse informatique des sites potentiels de liaison de miR-16 prvoit que GLUT-4, un transporteur du glucose insulinodpendant, pourrait tre une cible potentielle du miR-16. Nous avons donc test l'hypothse que miR-16 rgule ngativement le mtabolisme du glucose cellulaire. Dans des HUVEC, l'inhibition de miR-16 endogne avec des anti-miRNA oligonuclotides (AMO) augmente les niveaux protiques de GLUT-4 de 1,7 0,4 fois (p=0,0037 ; n=9). Dans des souris nourries avec un rgime alimentaire normal ou riche en graisse et en sucre, lexpression de GLUT-4 dans le muscle squelettique a tendance corrler ngativement avec les niveaux de miR-16 (p=0,0998, r2=0,3866, n=4). Ces rsultats suggrent que miR-16 est un rgulateur ngatif de GLUT-4 et quil pourrait tre impliqu dans la rgulation du mtabolisme cellulaire du glucose.
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Lhypertrophie du ventricule gauche (HVG) est un processus adaptif et compensatoire qui se dveloppe consquemment lhypertension artrielle pour sopposer llvation chronique de la pression artrielle. LHVG est caractrise par une hypertrophie des cardiomyocytes suite laugmentation de la synthse dADN, une prolifration des fibroblastes, une augmentation du dpt de collagne et une altration de la matrice extracellulaire (MEC). Ces changements gnrent des troubles de relaxation et mnent au dysfonctionnement diastolique, ce qui diminue la performance cardiaque. La suractivit du systme nerveux sympathique (SNS) joue un rle essentiel dans le dveloppement de lhypertension artrielle et de lHVG cause de la libration excessive des catcholamines et de leurs effets sur la scrtion des cytokines pro-inflammatoires et sur les diffrentes voies de signalisation hypertrophiques et prolifratives. Le traitement antihypertenseur avec de la moxonidine, un compos sympatholytique daction centrale, permet une rgression de lHVG suite une rduction soutenue de la synthse d'ADN et dune stimulation transitoire de la fragmentation de l'ADN qui se produit au dbut du traitement. En raison de linteraction entre lHVG, les cytokines inflammatoires, le SNS et leurs effets sur les protines de signalisation hypertrophiques, lobjectif de cette tude est de dtecter dans un modle animal dhypertension artrielle et dHVG, les diffrentes voies de signalisation associes la rgression de lHVG et la performance cardiaque. Des rats spontanment hypertendus (SHR, 12 semaines) ont reu de la moxonidine 0, 100 et 400 g/kg/h, pour une priode de 1 et 4 semaines, via des mini-pompes osmotiques implantes dune faon sous-cutane. Aprs 4 semaines de traitement, la performance cardiaque a t mesure par cho-doppler. Les rats ont ensuite t euthanasis, le sang a t recueilli pour mesurer les concentrations des cytokines plasmatiques et les curs ont t prlevs pour la dtermination histologique du dpt de collagne et de l'expression des protines de signalisation dans le ventricule gauche. Le traitement de 4 semaines na eu aucun effet sur les paramtres systoliques mais a permis damliorer les paramtres diastoliques ainsi que la performance cardiaque globale. Par rapport au vhicule, la moxonidine (400 g/kg/h) a permis daugmenter transitoirement la concentration plasmatique de lIL-1 aprs une semaine et de rduire la masse ventriculaire gauche. De mme, on a observ une diminution du dpt de collagne et des concentrations plasmatiques des cytokines IL-6 et TNF-, ainsi quune diminution de la phosphorylation de p38 et dAkt dans le ventricule gauche aprs 1 et 4 semaines de traitement, et cela avec une rduction de la pression artrielle et de la frquence cardiaque. Fait intressant, les effets anti-hypertrophiques, anti-fibrotiques et anti-inflammatoires de la moxonidine ont pu tre observs avec la dose sous-hypotensive (100 g/kg/h). Ces rsultats suggrent des effets cardiovasculaires bnfiques de la moxonidine associs une amlioration de la performance cardiaque, une rgulation de l'inflammation en diminuant les niveaux plasmatiques des cytokines pro-inflammatoires ainsi quen inhibant la MAPK p38 et Akt, et nous permettent de suggrer que, outre l'inhibition du SNS, moxonidine peut agir sur des sites priphriques.
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Nous avons rcemment dmontr que les espces ractives oxygnes induisent une augmentation de lexpression des protines Gi dans les cellules du muscle lisse vasculaire (CMLV) provenant daortes de rats spontanment hypertendus (SHR, de langlais spontaneously hypertensive rats). La prsente tude a pour but dtudier les effets du peroxyde dhydrogne (H2O2), un oxydant qui induit le stress oxydatif, sur lexpression de Gi et sur lactivit de ladnylate cyclase, et dexplorer les voies de signalisation sous-jacentes responsables de cette rponse. Nos rsultats montrent que H2O2 induit une augmentation de lexpression des protines Gi-2 et Gi-3 de manire dose- et temps-dpendante avec une augmentation maximale de 40-50% 100 M aprs 1 heure, sans affecter lexpression de Gs. Lexpression des protines Gi a t maintenue au niveau normal en presence de AG 1478, AG1295, PD98059 et la wortmannine, des inhibiteurs dEGF-R (de langlais epidermal growth factor receptor), PDGFR- (de langlais platelet-derived growth factor receptor ), de la voie de signalisation ras-ERK1/2 (de langlais extracellular regulated kinase1/2), et de la voie de la PI3Kinase-AKT (de langlais phosphatidyl inositol-3 kinase), respectivement. En outre, le traitement des CMLV avec H2O2 a induit une augmentation du degr de phosphorylation dEGF-R, PDGF-R, ERK1/2 et AKT; et cette expression a t maintenue au niveau tmoin par leurs inhibiteurs respectifs. Les inhibiteurs dEGF-R et PDGF-R ont aussi induit une diminution du degr de phosphorylation de ERK1/2, et AKT/PKB. En outre, la transfection des cellules avec le siRNA (de langlais, small interfering ribonucleic acid) de EGF-R et PDGFR- a attnu la surexpression des protines Gi-2 et Gi-3 induite par le traitement au H2O2. La surexpression des protines Gi induite par H2O2 a t corrle avec une augmentation de la fonction de la protine Gi. Linhibition de lactivit de ladnylate cyclase par de faibles concentrations de GTPS aprs stimulation par la forskoline a augment de 20% dans les cellules traites au H2O2. En outre, le traitement des CMLV au H2O2 a aussi accru linhibition de lactivit de ladnylate cyclase par les hormones inhibitrices telles que langiotensine II, oxotrmorine et C-ANP4-23. Dautre part, la stimulation de ladnylate cyclase induite par GTPS, glucagon, isoprotrnol, forskoline, et le fluorure de sodium (NaF) a t attnue de faon significative dans les cellules traites au H2O2. Ces rsultats suggrent que H2O2 induit la surexpression des protines Gi-2 and Gi-3 via la transactivation des rcepteurs des facteurs de croissance EGF-R, PDGFR- et lactivation des voies de signalisation ras-ERK1/2 et PI3K-AKT Mot-cles: Protines Gi, peroxyde dhydrogne, stress oxydant, rcepteurs des facteurs de croissance, MAP kinases, adnylate cyclase, hypertension
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Le rcepteur B1 des kinines (RB1) joue un rle important dans l'inflammation et la nociception. Les sites de liaison du RB1 sont augments dans la moelle pinire et le ganglion de la racine dorsale (GRD) chez le rat aprs la ligature partielle du nerf sciatique (LPNS). Dans ce modle classique de douleur neuropathique, le traitement aigu avec des antagonistes slectifs du RB1 renverse l'hyperalgsie thermique mais non pas lallodynie. Cette tude vise dfinir dans ce modle de LPNS: 1- les effets de traitements aigu et chronique avec des antagonistes du RB1 sur lhyperalgsie thermique et les allodynies tactile et au froid; 2- la contribution du TRPV1 et du stress oxydatif dans la composante de la douleur neuropathique associe au RB1; 3- lexpression du RB1 au niveau de la moelle pinire lombaire, le GRD et le nerf sciatique par RT-PCR quantitatif (Reverse transcriptase-polymerase chain reaction); 4- la localisation cellulaire du RB1 dans la moelle pinire lombaire par microscopie confocale. Lhyperalgsie thermique et les allodynies tactile et au froid ont t mesures par le rflexe de retrait de la patte arrire aprs lapplication la surface plantaire dune source radiante de chaleur (mthode Hargreaves), de filaments de Von Frey et dune goutte dactone qui produit une sensation de froid par vaporation. Nous avons montr, dans un premier temps, que l'hyperalgsie thermique et les allodynies tactile et au froid sont renverses par un traitement chronique avec lantagoniste du RB1, SSR240612, administr par gavage raison de 10 mg /kg/jr entre le 15 e et le 20 e jour aprs la ligature du nerf sciatique et par un traitement antioxydant, la N-actyl-L-cystine, administre par gavage la dose de 1g/kg/jr, 4jours prcdant la ligature et pendant les 2 semaines aprs la ligature. Un traitement aigu avec le ii SSR240612 (10 mg/kg) ou avec un antagoniste du RB1 qui ne traverse pas la barrire hmato-encphalique, le R-954 (2mg/kg, s.c.), na bloqu que lhyperalgsie thermique. Dans un second temps, lantagoniste du TRPV1, le SB366791, administr raison de 1 mg/kg/jr par voie sous-cutane du j-1 au j-14 a renvers lallodynie tactile et lhyperalgsie thermique. De plus, nous avons not deux semaines aprs la LPNS, des augmentations significatives des niveaux d'ARNm du RB1 dans la moelle pinire lombaire, le nerf sciatique et le GRD du ct ipsilatral la ligature. Ces augmentations ont t renverses par le traitement avec la N-actyl-L-cystine et lantagoniste du TRPV1. Le RB1 a t localis au niveau des fibres de type C avec le marquage au CGRP (Calcitonin Gene-Related Peptide) et au niveau de la microglie utilisant le marquage au Iba-1 dans la moelle pinire lombaire des rats ayant subi une LPNS, 2 semaines plus tt. Au terme de cette tude, nous avons suggr que la surexpression du RB1 sur les fibres de type C contribuerait lhyperalgsie thermique alors que le RB1 sur la microglie dans la moelle pinire contribuerait aux allodynies tactile et au froid dans le modle LPNS chez le rat. Le stress oxydatif pourrait tre impliqu dans linduction du RB1. Bien que le rle du TRPV1 semble plutt limit la douleur thermique, il pourrait cependant agir via le RB1 sur les fibres de type C.
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La greffe de sang de cordon est de plus en plus utilise et a permis de traiter avec succs chez lenfant des dficits immunitaires ainsi que des hmopathies malignes comme les leucmies. Malgr dimportants avantages tels que labsence de risque pour le donneur ou la plus faible incidence de maladie du greffon contre lhte (GvHD), utiliser le sang de cordon comporte certains inconvnients. En effet, une reconstitution immunitaire retarde, des infections opportunistes en plus grand nombre et un risque de rechute sont des complications qui peuvent survenir et engendrer un risque pour le pronostic vital du patient. Par consquent, de nouvelles stratgies dimmunothrapies doivent tre envisages. Dans le cadre de ce travail, nous nous sommes particulirement intresss aux cellules dendritiques plasmacytoides (pDC) dont les fonctions sont importantes pour linitiation des rponses immunitaires inne et adaptative et particulirement pour leur capacit activer les cellules NK. Afin dlucider le rle et limpact de ces cellules dans les greffes de sang de cordon, le nombre et la fonction des pDC et des NK a t suivi longitudinalement chez des patients ayant subi une greffe de sang de cordon comparativement des patients transplants avec de la moelle osseuse. Nous avons ainsi dmontr que les pDC et les NK apparaissent prcocement suite une greffe de sang de cordon et que ces cellules sont fonctionnelles. Ces rsultats mettent donc en lumire que ces cellules pourraient tre de bons outils pour ltablissement dune immunothrapie aprs greffe de sang de cordon. De plus, la caractrisation fonctionnelle des pDC du greffon de sang de cordon a permis de rvler une plus faible production dIFN- par les pDC, comparativement aux pDC de sang dadulte. Cette diffrence pourrait jouer un rle dans la plus faible incidence de GvHD aprs les greffes de sang de cordon. Dans le but de prciser les mcanismes molculaires de rgulation ngative de la production dIFN- par les pDC de sang de cordon, nous avons tudi les protines de la voie de signalisation TLR9-IRF7. Lexpression similaire de lARN du TLR9, MyD88, IRAK1 et IRF7 contraste avec la plus faible expression des protines correspondantes. De plus, lexpression des MicroARNs miR-146a et miR-155 est plus lev dans les pDC de sang de cordon comparativement aux pDC de sang dadultes. Ensemble, ces donnes pointent une rgulation ngative post-transcriptionnelle de la voie TLR9-IRF7 qui pourrait expliquer la plus faible production dIFN- des pDC du sang de cordon. Lensemble des ces travaux suggre que les pDC pourraient reprsenter une cible de choix dans le dveloppement de nouvelles approches thrapeutiques dans les greffes de sang de cordon.
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Durant une infection pulmonaire, les porcs sont souvent infects par plus dun microorganisme. Actinobacillus pleuropneumoniae et le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP) sont des pathognes qui peuvent infecter de manire simultane les porcs. Lobjectif du prsent projet est dtudier linteraction entre ces pathognes. Les deux lignes cellulaires permissives au VSRRP utilises sont les cellules St-Jude porcine lung (SJPL) et MARC-145. Les cellules ont t pr-infectes avec le VSRRP, puis infectes avec A. pleuropneumoniae. Un dosage de la lactate dshydrognase a montr quune co-infection VSRRP-A. pleuropneumoniae compare une infection simple augmente significativement la cytotoxicit. Dans les mmes conditions exprimentales, une pr-infection virale ne semble pas affecter ladhrence dA. pleuropneumoniae aux cellules. laide de tests ELISA, il a t possible de dmontrer la production dIL-8 et dINF- lorsquil y a infection des cellules. Pour ce qui est du TNF-, dIL-6 et dIL-10, ces cytokines ne sont pas dtectes en prsence des pathognes tudis. Des expriences de pr-infection bactrienne suivie dinfection virale ont galement t ralises. Il a t dmontr que la pr-infection avec A. pleuropneumoniae diminuait la rplication du VSRRP chez la ligne cellulaire SJPL, mais cela nest pas observ avec la ligne cellulaire MARC-145. Les rsultats prliminaires ont dmontr que cette diminution de la rplication serait cause par une molcule de faible poids molculaire scrte dans le surnageant bactrien et celle-ci serait rsistante la chaleur. Les lignes cellulaires SJPL et MARC-145 reprsentent de bons modles pour ltude des infections mixtes des voies respiratoires du porc.
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Ladministration de fer dextran 10 mg/kg intramusculaire (IM) est un traitement empirique couramment recommand en mdecine aviaire lors dhmorragie ou danmie. Lobjectif principal de cette tude tait dvaluer les effets de ce traitement sur lanmie chez les oiseaux de proie. Deux types dindividus ont t utiliss : des crcerelles dAmrique (Falco sparverius) o une anmie par perte de sang externe aigu a t cre (deux phlbotomies de 20-40 % du volume sanguin total un intervalle de 6 h) et des oiseaux de proie sauvages de diffrentes espces souffrant danmies diverses. Lensemble des oiseaux a t subdivis alatoirement en groupe traitement (fer dextran 10 mg/kg IM) et contrle (NaCl 0,9% IM). Un suivi dans le temps a t ralis afin dtudier leur rcupration de lanmie, la prsence deffets secondaires au traitement et limpact dune administration de fer sur ces rserves. Aucune diffrence significative na t observe entre les deux groupes en ce qui concerne les signes cliniques, lhmatocrite, le pourcentage des polychromatophiles/rticulocytes, la densit cellulaire et le fer de la moelle osseuse, la cratine kinase et le fer plasmatique. La majorit des crcerelles ont prsent une myosite au site dinjection du fer. Nos rsultats suggrent quune administration de 10 mg/kg de fer dextran IM na pas deffet sur lrythropose des rapaces souffrant danmie par perte de sang externe aigu, quelle provoque une lgre inflammation au site dinjection et quelle ninfluence pas les rserves de fer. Le comptage des rticulocytes en anneau et des polychromatophiles semble tre deux mthodes quivalentes.
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La phagocytose est un processus cellulaire par lequel de larges particules sont internalises dans une vsicule, le phagosome. Lorsque form, le phagosome acquiert ses proprits fonctionnelles travers un processus complexe de maturation nomm la biognse du phagolysosome. Cette voie implique une srie dinteractions rapides avec les organelles de lappareil endocytaire permettant la transformation graduelle du phagosome nouvellement form en phagolysosome partir duquel la dgradation protolytique seffectue. Chez lamibe Dictyostelium discoideum, la phagocytose est employe pour ingrer les bactries de son environnement afin de se nourrir alors que les organismes multicellulaires utilisent la phagocytose dans un but immunitaire, o des cellules spcialises nommes phagocytes internalisent, tuent et dgradent les pathognes envahissant de lorganisme et constitue la base de limmunit inne. Chez les vertbrs mchoire cependant, la transformation des mcanismes molculaires du phagosome en une organelle perfectionne pour lapprtement et la prsentation de peptides antigniques place cette organelle au centre de limmunit inne et de limmunit acquise. Malgr le rle crucial auquel participe cette organelle dans la rponse immunitaire, il existe peu de dtails sur la composition protique et lorganisation fonctionnelles du phagosome. Afin dapprofondir notre comprhension des divers aspects qui relient limmunit inne et limmunit acquise, il devient essentiel dlargir nos connaissances sur les fonctions molculaire qui sont recrutes au phagosome. Le profilage par protomique haut dbit de phagosomes isols fut extrmement utile dans la dtermination de la composition molculaire de cette organelle. Des tudes provenant de notre laboratoire ont rvl les premires listes protiques identifies partir de phagosomes murins sans toutefois dterminer le ou les rle(s) de ces protines lors du processus de la phagocytose (Brunet et al, 2003; Garin et al, 2001). Au cours de la premire tude de cette thse (Stuart et al, 2007), nous avons entrepris la caractrisation fonctionnelle du protome entier du phagosome de la drosophile en combinant diverses techniques danalyses haut dbit (protomique, rseaux dintractions protique et ARN interfrent). En utilisant cette stratgie, nous avons identifi 617 protines phagosomales par spectromtrie de masse partir desquelles nous avons accru cette liste en construisant des rseaux dinteractions protine-protine. La contribution de chaque protine linternalisation de bactries fut ensuite teste et valide par ARN interfrent haut dbit et nous a amen identifier un nouveau rgulateur de la phagocytose, le complexe de lexocyst. En appliquant ce modle combinatoire de biologie systmique, nous dmontrons la puissance et lefficacit de cette approche dans ltude de processus cellulaire complexe tout en crant un cadre partir duquel il est possible dapprofondir nos connaissances sur les diffrents mcanismes de la phagocytose. Lors du 2e article de cette thse (Boulais et al, 2010), nous avons entrepris la caractrisation molculaire des tapes volutives ayant contribu au remodelage des proprits fonctionnelles de la phagocytose au cours de lvolution. Pour ce faire, nous avons isol des phagosomes partir de trois organismes distants (lamibe Dictyostelium discoideum, la mouche fruit Drosophila melanogaster et la souris Mus musculus) qui utilisent la phagocytose des fins diffrentes. En appliquant une approche protomique grande chelle pour identifier et comparer le protome et phosphoprotome des phagosomes de ces trois espces, nous avons identifi un cur protique commun partir duquel les fonctions immunitaires du phagosome se seraient dveloppes. Au cours de ce dveloppement fonctionnel, nos donnes indiquent que le protome du phagosome fut largement remodel lors de deux priodes de duplication de gnes concidant avec lmergence de limmunit inne et acquise. De plus, notre tude a aussi caractrise en dtail lacquisition de nouvelles protines ainsi que le remodelage significatif du phosphoprotome du phagosome au niveau des constituants du cur protique ancien de cette organelle. Nous prsentons donc la premire tude approfondie des changements qui ont engendr la transformation dun compartiment phagotrophe une organelle entirement apte pour la prsentation antignique.
Resumo:
La dihyrofolate rductase de type II R67 (DHFR R67) est une enzyme bactrienne encode par un plasmide donc aisment transmissible. Elle catalyse la raction de rduction du dihydrofolate (DHF) en ttrahydrofolate (THFA) essentiel pour la prolifration cellulaire. La DHFR R67 est une enzyme qui dpend du cofacteur NADPH. La DHFR R67 est diffrente, structurellement et gntiquement, de lenzyme DHFR chromosomale prsente chez tous les organismes et elle est rsistante au trimthoprime (TMP) qui est largement utilis dans les traitements antibactriens chez lHomme. Aucun inhibiteur slectif contre la DHFR R67 nest actuellement rpertori. Le but de cette tude a t didentifier des molcules qui pourront inhiber la DHFR R67 slectivement, sans affecter la DHFR humaine (DHFRh). La vrification de la qualit des essais enzymatiques en conditions dtermines pour le criblage dinhibiteurs sur plusieurs lectrices plaques a identifi des appareils appropris pour lanalyse. Ltude de lactivit enzymatique de la DHFR R67 et de la DHFRh en prsence des solvants organiques et liquides ioniques (LIs), comme des co-solvants pour le criblage rationnel dinhibiteurs, a montr que certains LIs peuvent servir de milieu alternatif pour les essais enzymatiques. Le criblage rationnel bas sur lapproche du design dun inhibiteur partir de petites molcules, a rvl des molcules primaires qui inhibent la DHFR R67 de faon faible, mais slective. Le test des composs biologiquement actifs qui comprennent des petits fragments, a montr laugmentation de laffinit entre la DHFR R67 et les composs tests. Trois composs ont t dtermins comme des inhibiteurs slectifs prometteurs pour la DHFR R67.
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La consultation de bases de donnes publiques en bio-informatique est essentielle pour quiconque a un intrt pour la biologie cellulaire, la gntique ou la biologie des systmes. Les notices de ces bases contiennent surtout des donnes spcialises: squences de nuclotides ou dacides amins, structures de protines en trois dimensions, ou encore composantes de sentiers biologiques. Cependant, il peut tre difficile de localiser linformation souhaite parmi les centaines de bases de donnes disponibles. La Bibliothque de la sant de lUniversit de Montral offre depuis janvier 2010 une activit de dcouverte des bases de donnes du National Center for Biotechnology Information; on y explore une vingtaine de bases et doutils laide dexercices pratiques. Les moyens utiliss pour raliser, publiciser et valuer cette nouvelle activit de formation seront prsents.
Resumo:
Plusieurs tudes ont montr que la perturbation des fonctions du systme cardiovasculaire constitue un risque majeur de dveloppement du trouble dpressif chez l'homme. De plus, suite un infarctus du myocarde, 15-30% de la population dveloppe la dpression majeure dans les 6 8 mois suivant cet vnement suggrant un lien entre les maladies cardiovasculaires et la dpression. Cette dpression est caractrise par une srie de troubles du sommeil. Approximativement 80% des patients hospitaliss et 70% des malades en consultation externe avec une dpression majeure rapportent des difficults dinitiation et de maintient du sommeil. Les travaux effectus dans les laboratoires de Roger Godbout et Guy Rousseau ont montr que suite un infarctus aigu du myocarde chez le rat, on observait de l'anhdonie, de la dtresse comportementale et de la mort cellulaire par apoptose dans le systme limbique. Cette apoptose suivait un dcours spatial et temporel et avait t prvenue par ladministration dantidpresseurs. De plus, le facteur de ncrose tumorale alpha (TNF-) serait un composant majeur dans lactivation de la voie extrinsque conduisant la mort cellulaire observe dans le systme limbique. Les rsultats de cette thse montrent que les rats ayant subi un infarctus du myocarde (IM) prsentaient la fois des troubles du sommeil, de l'anhdonie et de la dtresse comportementale comparables ceux des autres modles animaux de dpression. Les symptmes de dpression ont t prvenus par l'administration la fois d'un antidpresseur (escitalopram) et d'un inhibiteur de la synthse des cytokines proinflammatoires (pentoxifylline). Les troubles du sommeil et l'apoptose avaient aussi t prvenus par l'admistration respective de l'escitalopram et de la pentoxifylline. De plus, les animaux ayant subi un IM prsentaient une diminution du nombre de cellules cholinergiques dans le gnrateur du sommeil paradoxal expliquant en partie la rduction de la dure du sommeil paradoxal observe dans cette thse. Les animaux ayant subi un IM montraient une augmentation systmique du TNF-, l'interleukine-1 (IL-1), et la prostaglandine E2 (PGE2). Le traitement par l'escitalopram bloquait l'augmentation des niveaux plasmatiques du TNF-, de l'IL-1, et de la PGE2 sans affecter celui de la corticostrone et de l'IL-6. Finalement, pour la premire fois, nous avons mis vidence qu'un traitement autre qu'un antidpresseur (pentoxifylline) pouvait rduire le comportement dpressif dans la dpression post-infarctus du myocarde lorsqu'il est administr quelques minutes avant la priode ischmique. Il apparait donc important dintervenir rapidement chez les patients la suite d'un IM et ce ds les premiers jours et avant mme lapparition des premiers signes dinsomnie et de dpression. Une combinaison de traitements pharmacologique et comportemental serait une voie intressante considrer dans la prise en charge de ces patients.
