Isolation, culture et caractérisation phénotypique de cellules musculaires lisses endobronchiques équines.

Le muscle lisse endobronchique est l’un des acteurs principaux de l’asthme. La description de ces caractéristiques phénotypiques reste cependant très elliptique, notamment à cause de la difficulté inhérente à l’échantillonnage. Le cheval offre un large champ d’investigation en raison de sa taille et un modèle d’asthme pertinent en regard de la similitude entre asthme et souffle. La technique de culture et de caractérisation du muscle lisse a été mise au point à partir de muscle lisse trachéal. Ce modèle a ensuite été transposé et réalisé à partir de biopsies endobronchiques chez le cheval. Les cellules du muscle lisse ont été isolées, mises en culture puis caractérisées par immunofluorescence, cytométrie de flux et immunobuvardage. Le maintien du phénotype contractile en culture restant un défi dans l’établissement d’un modèle d’asthme réaliste. Suite à l’isolement des cellules musculaires lisses à partir de muscle lisse trachéal équin et leur mise en culture en présence de 10% de FBS pendant 7 passages, 96.4% des cellules expriment l’α-smooth muscle-actine (α-sm-actine), tandis que 83.8% et 77% expriment la desmine et la myosine respectivement. Les cellules musculaires lisses issues de biopsies endobronchiques expriment après 7 passages à 84% l’α-sm-actine, à 57% la desmine et 69% la myosine. Ces résultats ont été obtenus par immunofluorescence et immunobuvardage. Le pourcentage de cellules exprimant les protéines d’intérêt, tout comme l’intensité moyenne de fluorescence ne présentent pas de variation significative ni entre le 4ième et le 7ième passage, ni avec la caractérisation initiale, lors du premier passage. Cette étude suggère qu’il est possible de maintenir le phénotype contractile en culture sur plastique en présence de 10% de FBS, et que les biopsies endobronchiques sont un support d’étude valable pour de futures investigations concernant le rôle du muscle lisse et ses caractéristiques.

Implication des cellules Nestin+ dans le remodelage vasculaire en conditions pathologiques

La protéine de filament intermédiaire Nestin, marqueur de cellules souches neurales, est exprimée dans les cellules vasculaires. Il a été démontré que les cellules de la crosse aortique dérivent de la crête neurale pendant le développement. Des cellules endothéliales exprimant Nestin sont retrouvées dans les capillaires durant l’embryogénèse ainsi que durant la vascularisation de tumeurs cancéreuses. Cette protéine est impliquée dans les mécanismes de prolifération cellulaire. Récemment des cellules Nestin+ ont été identifiées au niveau des cellules du muscle lisse de l’aorte. La régulation de Nestin dans ces cellules, pendant le développement et en conditions pathologiques, est inconnue. Cette thèse porte sur l’analyse de la protéine Nestin dans le remodelage vasculaire en situation diabétique et d’hypertension au niveau des artères carotide et aortique. Nos travaux examinent l’hypothèse que l’expression vasculaire de Nestine joue un rôle dans l’homéostasie durant le vieillissement physiologique et participe au remodelage suite à des stimuli pathologiques. La protéine Nestin est fortement exprimée dans les aortes de rats néonataux et cette expression diminue rapidement avec le développement. Au niveau de l’aorte l’expression de la protéine Nestin est retrouvée dans une sous-population de cellules du muscle lisse et au niveau des cellules endothéliales. L’expression de la protéine Nestin est corrélée avec sa proximité au cœur, une plus grande expression est observée dans l’arche aortique et une faible expression est détectée dans la partie thoracique. Nous avons déterminé qu’en présence de diabète de type I, il y a une perte de l’expression de la protéine Nestin dans la média de l’aorte et de la carotide. Cette perte d’expression représente un évènement précoce dans la pathologie diabétique et précède la dysfonction endothéliale. La diminution de l’expression de la protéine Nestin est également concomitante avec la perte de la capacité proliférative des cellules du muscle lisse. Dans les rats souffrant de diabète de type 1, une réduction significative de la densité des cellules du muscle lisse exprimant la protéine phosphorylée phosphohistone 3, une protéine impliquée dans un cycle cellulaire actif, est observée. De plus, cette réduction est corrélée avec la perte de l’expression de la protéine Nestin. Nous avons également démontré in vitro qu’un traitement hyperglycémique réduit l’expression de Nestin ainsi que la prolifération des cellules du muscle lisse. Enfin, l’utilisation d’un shARN dirigé contre Nestin nous a permis de déterminer l’implication de cette protéine dans la prolifération des cellules du muscle lisse en condition basale caractérisée par la diminution de l’incorporation de [3H] thymidine. Dans le modèle d’hypertension induite par une constriction aortique abdominale surrénale, l’augmentation de la pression sanguine est associée avec l’augmentation de l’expression de la protéine Nestin dans l’artère carotidienne. Une corrélation positive a été observée entre l’expression de la protéine Nestin dans la carotide et la pression artérielle moyenne à laquelle la paroi de la carotide est soumise. De plus, les facteurs de croissance impliqués dans le remodelage vasculaire secondaire à l’hypertension augmentent l’expression de Nestin dans les cellules du muscle lisse isolées des carotides. Puis, la réduction de l’expression de la protéine Nestin via un shARN atténue l’incorporation de [3H] thymidine, associée à la prolifération cellulaire, stimulée par ces facteurs de croissance alors que l’incorporation de [3H] leucine, associée à la synthèse protéique, demeure inchangée. Ces résultats suggèrent que l’augmentation de l’expression de la protéine Nestin, secondaire à l’hypertension, pourrait représenter une réponse adaptative où il y a une augmentation de la croissance des cellules du muscle lisse afin de permettre à la paroi vasculaire de s’ajuster à l’augmentation de la pression sanguine.

Implications physiopathologiques de la Nestine lors du remodelage pulmonaire et cardiaque à la suite de l’infarctus du myocarde, du diabète et de l’hypertension pulmonaire

Il est reconnu que la protéine filamenteuse intermédiaire Nestine est exprimée lors du processus de cicatrisation et du remodelage fibrotique. De plus, nous avons identifié l’expression de la Nestine au sein de deux populations distinctes qui sont directement impliquées dans les réponses de fibroses réparative et réactive. Ainsi, une population de cellules souches neurales progénitrices résidentes du coeur de rat adulte exprime la Nestine et a été identifiée à titre de substrat de l’angiogenèse et de la neurogenèse cardiaque. Également, la Nestine est exprimée par les myofibroblastes cicatriciels cardiaques et il a été établi que la protéine filamenteuse intermédiaire joue un rôle dans la prolifération de ces cellules. Ainsi, l’objectif général de cette thèse était de mieux comprendre les évènements cellulaires impliqués dans la réponse neurogénique des cellules souches neurales progénitrices résidentes cardiaques Nestine(+) (CSNPRCN(+)) lors de la fibrose réparative cardiaque et d’explorer si l’apparition de fibroblastes Nestine(+) est associée avec la réponse de fibrose réactive secondaire du remodelage pulmonaire. Une première publication nous a permis d’établir qu’il existe une régulation à la hausse de l’expression de la GAP43 (growth associated protein 43) et que cet événement transitoire précède l’acquisition d’un phénotype neuronal par les CSNPRCN(+) lors du processus de cicatrisation cardiaque chez le rat ayant subi un infarctus du myocarde. De plus, la surimposition de la condition diabétique de type 1, via l’injection unique de Streptozotocine chez le rat, abolit la réponse neurogénique des CSNPRCN(+), qui est normalement induite à la suite de l’ischémie cardiaque ou de l’administration de 6-hydroxydopamine. Le second article a démontré que le développement aigu de la fibrose pulmonaire secondaire de l’infarctus du myocarde chez le rat est associé avec une augmentation de l’expression protéique de la Nestine et de l’apparition de myofibroblastes pulmonaires Nestine(+). Également, le traitement de fibroblastes pulmonaires avec des facteurs de croissances peptidiques pro-fibrotiques a augmenté l’expression de la Nestine par ces cellules. Enfin, le développement initial de la condition diabétique de type 1 chez le rat est associé avec une absence de fibrose réactive pulmonaire et à une réduction significative des niveaux protéiques et d’ARN messager de la Nestine pulmonaire. Finalement, la troisième étude représentait quant à elle un prolongement de la deuxième étude et a alors examiné le remodelage pulmonaire chronique chez un modèle établi d’hypertension pulmonaire. Ainsi, les poumons de rats adultes mâles soumis à l’hypoxie hypobarique durant 3 semaines présentent un remodelage vasculaire, une fibrose réactive et une augmentation des niveaux d’ARN messager et de la protéine Nestine. De plus, nos résultats ont démontré que la Nestine, plutôt que l’alpha-actine du muscle lisse, est un marqueur plus approprié des diverses populations de fibroblastes pulmonaires activés. Également, nos données suggèrent que les fibroblastes pulmonaires activés proviendraient en partie de fibroblastes résidents, ainsi que des processus de transition épithélio-mésenchymateuse et de transition endothélio-mésenchymateuse. Collectivement, ces études ont démontré que des populations distinctes de cellules Nestine(+) jouent un rôle majeur dans la fibrose réparative cardiaque et la fibrose réactive pulmonaire.

Importance pathophysiologique de l'hyperendothélinémie sur la réactivité vasculaire pulmonaire

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Études des mécanismes régulateurs des canaux C1 ̄activés par le calcium des myocytes vasculaires

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Rôles et mécanismes moléculaires de l'apoptose cardiovasculaire en réponse à des antihypertenseurs

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Modulation de l'expression des protéines Gi et de la signalisation de l'adénylate cyclase par le monoxyde d'azote : implication dans la régulation de la pression sanguine

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Eph kinases and their ligands ephrins act in concert with sex hormones in regulating blood pressure

Les Erythropoietin-producing hepatocyte (EPH) sont la plus grande famille de récepteurs tyrosine kinase. Leurs ligands, les éphrines (EFNs), sont aussi des molécules exprimées à la surface cellulaire. Les EPH/EFNs sont impliqués dans de nombreux processus biologiques. L'hypertension artérielle (PA) est une maladie chronique qui, aujourd'hui, est devenue un problème médical critique dans le monde entier et un enjeu de santé publique. La découverte de nouvelles thérapeutiques de l'hypertension sont d'une grande importance pour la santé publique. Jusqu’à tout récemment, il existe seulement quelques études concernant le rôle de l’axe EPH/EFNs sur la fonction des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV). Dans nos études précédentes, nous avons montré qu'EPHB6 et EFNB1, de concert avec les hormones sexuelles, régulent la PA. Dans la présente étude, nous avons constaté que les différents membres de la famille EPH/EFN peuvent réguler soit positivement, soit négativement, la contractilité des CMLV et la PA: tandis que EPHB4 et EFNB2 appartiennent à la première catégorie, EFNB1, EFNB3 et EPHB6 appartiennent à la deuxième. In vivo, des souris males, mais non pas des femelles, porteuses d’une mutation EPHB4 (KO) spécifique du muscle lisse présentent une PA diminuée, comparée aux souris témoins (WT). Les CMLV de souris EPHB4 KO, en présence de testostérone, ont montré une contractilité réduite lors de la stimulation par la phényléphrine (PE). Au niveau moléculaire, la phosphorylation de la protéine kinase II dépendante de Ca2+/calmoduline et de la kinase de la chaine légère de la myosine (CLM) est augmentée, tandis que la phosphorylation de la kinase de la CLM est réduite dans les CMLV KO lors de la stimulation par PE, par rapport au WT CMLV. Cela fournit une base moléculaire à la réduction de la PA et de la contractilité des CMLV chez les souris EPHB4 KO. EFNB2 est le ligand majeur de l’EPHB4. Comme attendu, les souris EFNB2 KO spécifique du muscle lisse avaient un phénotype de PA semblable, quoique non identique, aux souris EPHB4 KO. Les souris mâles EFNB2 KO, mais pas femelles, sous régime régulier ou riche en sel, présentent une PA réduite, par rapport à leurs homologues WT. Au niveau cellulaire, les CMLV des souris KO ont montré une contractilité réduite lors de la stimulation par PE par rapport aux témoins WT. Une région de l’acide aminé (aa) 313 à l’aa 331 dans la partie intracellulaire d’EFNB2 est essentielle pour la signalisation inverse qui régule la contractilité des CMLV, selon des études de mutation-délétion. Dans une étude de génétique humaine, nous avons identifié, dans le gène EFNB2, six SNP qui étaient associées significativement au risque d'hypertension artérielle, de façon dépendante du sexe, ce qui corrobore nos résultats chez les souris. En revanche, la délétion du gène EFNB3 (KO) chez les souris femelles aboutit à une PA élevée et à une augmentation des résistances des petites artères in vivo, améliore la contractilité des petites artères ex-vivo et augmente la contractilité des CMLV in vitro. Les souris mâles KO ont une PA normale, mais la castration conduit à une augmentation significative de la PA dans les souris KO, mais pas dans les souris WT. Les CMLV des souris KO femelles ont montré une phosphorylation accrue de la CLM et une phosphorylation réduite de la kinase de la CLM, ce qui fournit à nouveau une base moléculaire aux phénotypes de PA et de contractilité des CMLV observés. Ce changement de signalisation est attribuable à une protéine adaptatrice Grip1. En effet, dans une étude d'association pan génomique par le Consortium International pour la Pression Sanguine, un SNP dans le gène GRIP1 a approché le seuil de significativité de la valeur p pour son association avec la pression diastolique. Nos recherches, pour la première fois, ont révélé que EPH/EFNs sont de nouveaux composants dans le système de régulation de la PA. Les membres de la famille EPH/EFN peuvent agir comme des forces Yin et Yang pour régler finement le tonus des vaisseaux pour assurer l'homéostasie de la PA et de sa régulation. Ces effets de EPH/EFNs dépendent du sexe et des niveaux d’hormones sexuelles. À partir de ces nouvelles connaissances, nous pourrions développer une nouvelle thérapie personnalisée pour l’hypertension artérielle, utilisant des antagonistes d'hormones sexuelles ou des thérapies de remplacement d'hormones sexuelles, selon les niveaux d'hormones sexuelles des patients et les mutations dans les gènes de l'EPH/EFN.

Régulations homéostatiques cardiovasculaires suite à une transfusion par échange avec du sang hyperagrégeant chez le rat

Dans le but de vérifier l’impact d’un changement soudain dans l’agrégation érythrocytaire sur certains paramètres cardiovasculaires, une transfusion par échange sanguin du tiers du volume a été effectuée avec du sang hyperagrégeant chez le rat de souche Brown Norway. La pression caudale, le volume cardiaque systolique, la fraction d’éjection, le débit cardiaque, le rythme cardiaque et la résistance périphérique à l’écoulement sanguin ont été observés non-intrusivement sur 19 jours suite à la transfusion. Les rats ont été sacrifiés plus d’un mois suivant la transfusion et une étude ex vivo de la réponse à deux agents dilatateurs (l’acétylcholine et le nitroprussiate de sodium) a été menée sur les artérioles mésentériques. Des variations des paramètres cardiovasculaires, soit le débit, le volume systolique et la résistance périphérique, ont été remarquées dans les trois premiers jours posttransfusion. Une résistance du muscle vasculaire lisse au monoxyde d’azote a été notée chez les rats transfusés au sang hyperagrégeant alors qu’aucune dysfonction endothéliale n’était apparente en réponse à l’acétylcholine.

Modulation of Endothelin-1 and Insulin-like Growth Factor Type 1-induced Signaling by Curcumin in A-10 Vascular Smooth Muscle Cells

Les maladies cardio-vasculaires (MCV), telles que l’hypertension et l’athérosclérose, s’accompagnent de modifications structurales et fonctionnelles au niveau vasculaire. Un fonctionnement aberrant de la migration, l’hypertrophie et la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) sont des évènements cellulaires à l’origine de ces changements. L’endothéline-1 (ET-1) contribue à la pathogénèse des anomalies vasculaires, notamment via l’activation des protéines MAPK et PI3-K/PKB, des composantes clés impliquées dans les voies prolifératives et de croissance cellulaires. Il a été suggéré que le stress oxydant jouerait un rôle intermédiaire dans les effets pathophysiologiques vasculaires de l’ET-1. En conséquence, une modulation de la signalisation induite par l’ET-1 peut servir comme éventuelle stratégie thérapeutique contre le développement des MCV. Il apparaît de nos jours un regain d’intérêt dans l’utilisation des agents phyto-chimiques pour traiter plusieurs maladies. La curcumine, constituant essentiel de l’épice curcuma, est dotée de plusieurs propriétés biologiques parmi lesquelles des propriétés anti-oxydantes, anti-prolifératrices et cardio-protectrices. Cependant, les mécanismes moléculaires de son effet cardio-protecteur demeurent obscurs. Dans cette optique, l’objectif de cette étude a été d’examiner l’efficacité de la curcumine à inhiber la signalisation induite par l’ET-1 dans les CMLV. La curcumine a inhibé la phosphorylation des protéines IGF-1R, PKB, c-Raf et ERK1/2, induite par l’ET-1 et l’IGF-1. De plus, la curcumine a inhibé l’expression du facteur de transcription Egr-1 induite par l’ET-1 et l’IGF-1, dans les CMLV. Ces résultats suggèrent que la capacité de la curcumine à atténuer ces voies de signalisation serait un mécanisme d’action potentiel de ses effets protecteurs au niveau cardiovasculaire.

Assessing the Activity of Agonistic Autoantibodies in Systemic Sclerosis and their Effects on Cultured Vascular Smooth Muscle Cells

La sclérose systémique (ScS) est une maladie auto-immune dévastatrice d'étiologie inconnue. Le dysfonctionnement immunitaire, la fibrose et la vasculopathie sont les trois principales caractéristiques de cette maladie. Une récente étude a révélé un nouveau lien entre l'auto-immunité et la fibrose, par la présence d'auto-anticorps stimulant le récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFR) des fibroblastes. Ces auto-anticorps sont capables de stimuler les espèces réactives de l'oxygène et d’activer la kinase régulée par un signal extracellulaire (ERK1/2). L’hypothèse que nous formulons est que les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMCs) exprimant conjointement les PDGFR, répondront elles aussi aux autoanticorps anti-PDGF-R. Le travail présenté ici vise à valider la présence d'auto-anticorps PDGFR dans les sérums de patients ScS, et à caractériser ensuite la réponse de VSMCs exposées à de l'immunoglobuline G (IgG) de ces sérums, en mesurant l’activation des cascades de signalisation spécifiques, ainsi que l'induction des gènes impliqués dans la réponse fibrotique. Nos résultats démontrent la présence d'une fraction IgG stimulant une réponse phénotypique dans les cultures de VSMCs. Notamment, d’importantes régulations positive et négative des gènes pro-fibrotiques tgfb1 et tgfb2 respectivement, ont été observées dans les VSMCs exposées à des fractions de ScS-IgG. Les fractions de IgG positives pour l'activation de ERK étaient présentes dans la plupart, mais pas dans tous les échantillons de SSc (68%, 19/28), et moins présentes dans les contrôles 27% (11/3). Bien que, les fractions de SSc-IgG ont pu considérablement immunoprécipiter le PDGFR, l'utilisation d'un inhibiteur spécifique des récepteurs au PDGF (AG1296), n'a pas inhibé l'activation de ERK médiée par les fractions de SSc-IgG. Globalement, nos résultats indiquent la présence d'autoanticorps stimulants avec activité pro-fibrotique dans les sérums des patients ScS. Des travaux sont en cours pour identifier l'entité moléculaire responsable de la réponse d’IgG observée dans les cultures de VSMCs.

Développement d'un promoteur efficace et muscle spécifique pour la thérapie génique de la dystrophie musculaire de Duchenne

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Rhythmic Masticatory Muscle Activity during Sleep: Etiology and Clinical Perspectives

L’activité rythmique des muscles masticateurs (ARMM) pendant le sommeil se retrouve chez environ 60% de la population générale adulte. L'étiologie de ce mouvement n'est pas encore complètement élucidée. Il est cependant démontré que l’augmentation de la fréquence des ARMM peut avoir des conséquences négatives sur le système masticatoire. Dans ce cas, l'ARMM est considérée en tant que manifestation d'un trouble moteur du sommeil connue sous le nom de bruxisme. Selon la Classification Internationale des Troubles du Sommeil, le bruxisme est décrit comme le serrement et grincement des dents pendant le sommeil. La survenue des épisodes d’ARMM est associée à une augmentation du tonus du système nerveux sympathique, du rythme cardiaque, de la pression artérielle et elle est souvent en association avec une amplitude respiratoire accrue. Tous ces événements peuvent être décrits dans le contexte d’un micro-éveil du sommeil. Cette thèse comprend quatre articles de recherche visant à étudier i) l'étiologie de l’ARMM pendant le sommeil en relation aux micro-éveils, et à évaluer ii) les aspects cliniques du bruxisme du sommeil, du point de vue diagnostique et thérapeutique. Pour approfondir l'étiologie de l’ARMM et son association avec la fluctuation des micro-éveils, nous avons analysé le patron cyclique alternant (ou cyclic alternating pattern (CAP) en anglais), qui est une méthode d’analyse qui permet d’évaluer l'instabilité du sommeil et de décrire la puissance des micro-éveils. Le CAP a été étudié chez des sujets bruxeurs et des sujets contrôles qui ont participé à deux protocoles expérimentaux, dans lesquels la structure et la stabilité du sommeil ont été modifiées par l'administration d'un médicament (la clonidine), ou avec l'application de stimulations sensorielles (de type vibratoire/auditif) pendant le sommeil. Dans ces deux conditions expérimentales caractérisées par une instabilité accrue du sommeil, nous étions en mesure de démontrer que les micro-éveils ne sont pas la cause ou le déclencheur de l’ARMM, mais ils représentent plutôt la «fenêtre permissive» qui facilite l'apparition de ces mouvements rythmiques au cours du sommeil. Pour évaluer la pertinence clinique du bruxisme, la prévalence et les facteurs de risque, nous avons effectué une étude épidémiologique dans une population pédiatrique (7-17 ans) qui était vue en consultation en orthodontie. Nous avons constaté que le bruxisme est un trouble du sommeil très fréquent chez les enfants (avec une prévalence de 15%), et il est un facteur de risque pour l'usure des dents (risque relatif rapproché, RRR 8,8), la fatigue des muscles masticateurs (RRR 10,5), les maux de tête fréquents (RRR 4,3), la respiration bruyante pendant le sommeil (RRR 3,1), et divers symptômes liés au sommeil, tels que la somnolence diurne (RRR 7,4). Ces résultats nous ont amenés à développer une étude expérimentale pour évaluer l'efficacité d'un appareil d'avancement mandibulaire (AAM) chez un groupe d'adolescents qui présentaient à la fois du bruxisme, du ronflement et des maux de tête fréquents. L'hypothèse est que dans la pathogenèse de ces comorbidités, il y a un mécanisme commun, probablement lié à la respiration pendant le sommeil, et que l'utilisation d'un AAM peut donc agir sur plusieurs aspects liés. À court terme, le traitement avec un AAM semble diminuer l'ARMM (jusqu'à 60% de diminution), et améliorer le ronflement et les maux de tête chez les adolescents. Cependant, le mécanisme d'action exact des AAM demeure incertain; leur efficacité peut être liée à l'amélioration de la respiration pendant le sommeil, mais aussi à l'influence que ces appareils pourraient avoir sur le système masticatoire. Les interactions entre le bruxisme du sommeil, la respiration et les maux de tête, ainsi que l'efficacité et la sécurité à long terme des AAM chez les adolescents, nécessitent des études plus approfondies.

Le fragment LG3 du perlécan : un nouveau régulateur de remodelage vasculaire en transplantation

L’apoptose endothéliale initie le processus menant au remodelage vasculaire et au développement de la néointima dans la vasculopathie du greffon. La formation de néointima résulte de l’accumulation de leucocytes, de matrice extracellulaire et de cellules positives pour l’actine musculaire lisse alpha (αSMA+) dans l’intima des artères, artérioles et capillaires du greffon. Les cellules αSMA+ dans la néointima sont des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) dérivées du donneur ainsi que des cellules souches dérivées du receveur, dont des cellules souches mésenchymateuses (CSM). L’acquisition d’un phénotype anti-apoptotique chez ces cellules est déterminante pour le développement de la néointima. Le laboratoire de Dre Hébert a démontré que les cellules endothéliales (CE) apoptotiques libèrent des médiateurs induisant une résistance à l’apoptose chez les CMLV et les fibroblastes. Notamment, les CE apoptotiques relâchent la cathepsine L qui clive le perlécan et ainsi libère un fragment C-terminal correspondant au troisième motif laminine G du domaine V du perlécan (LG3). Le LG3 est anti-apoptotique pour les fibroblastes. Nous avons donc émis l’hypothèse que le LG3 est un des médiateurs clés libéré par les CE apoptotiques favorisant le développement de la néointima via l’induction d’un phénotype anti-apoptotique chez les cellules néointimales αSMA+. Nous avons démontré que les médiateurs libérés par les CE apoptotiques induisent un phénotype anti-apoptotique chez les CSM dépendant de l’activation de la voie ERK1/2. De plus, le LG3 active la voie ERK1/2 via son interaction avec les intégrines beta 1 et induit une réponse anti-apoptotique chez ces cellules. Cependant l’activation de ERK1/2 par le LG3 est plus faible en comparaison de son activation par le milieu conditionné par des CE apoptotiques. Nos résultats suggèrent que les CE apoptotiques libèrent aussi de l’EGF qui agit de façon paracrine sur les CSM en coopération avec le LG3 pour induire un phénotype anti-apoptotique chez les CSM. Nous avons poursuivi l’étude de l’effet du LG3 in vivo sur le remodelage vasculaire en transplantation. Nous avons pour cela développé un modèle murin de rejet vasculaire qui consiste en une transplantation aortique entre des souris alloincompatibles. Nous avons ensuite injecté du LG3 chez les souris receveuses en post-transplantation. Nous avons observé dans ce modèle que des niveaux augmentés de LG3 sérique augmentent la formation de néointima, favorisent l’accumulation de cellules néointimales αSMA+ et diminuent le nombre de cellules CD31+ au niveau du greffon aortique. Parallèlement nous avons vérifié que le LG3 induit aussi un phénotype anti-apoptotique chez les CMLV et nous avons démontré un nouvel effet du LG3, soit une activité pro-migratoire, qui dépend de l’activation de la voie ERK1/2 chez les CMLV. Nous avons complété cette étude par l’analyse des niveaux de LG3 sérique dans une cohorte de patients receveurs d’allogreffe rénale. Nous avons observé chez ces patients, une association entre des niveaux élevés de LG3 sérique et un rejet vasculaire. Le LG3 contribue à la formation de néointima par son activité pro-migratoire et pro-survie chez les cellules néointimales et aussi de par son activité angiostatique. Nos résultats suggèrent que le LG3 est un nouveau médiateur important dans le remodelage vasculaire en transplantation

Effect of portacaval anastomosis on glutamine synthetase protein and gene expression in brain, liver and skeletal muscle.

The effects of chronic liver insufficiency resulting from end-to-side portacaval anastomosis (PCA) on glutamine synthetase (GS) activities, protein and gene expression were studied in brain, liver and skeletal muscle of male adult rats. Four weeks following PCA, activities of GS in cerebral cortex and cerebellum were reduced by 32\% and 37\% (p<0.05) respectively whereas GS activities in muscle were increased by 52\% (p<0.05). GS activities in liver were decreased by up to 90\% (p<0.01), a finding which undoubtedly reflects the loss of GS-rich perivenous hepatocytes following portal-systemic shunting. Immunoblotting techniques revealed no change in GS protein content of brain regions or muscle but a significant loss in liver of PCA rats. GS mRNA determined by semi-quantitative RT-PCR was also significantly decreased in the livers of PCA rats compared to sham-operated controls. These findings demonstrate that PCA results in a loss of GS gene expression in the liver and that brain does not show a compensatory induction of enzyme activity, rendering it particularly sensitive to increases in ammonia in chronic liver failure. The finding of a post-translational increase of GS in muscle following portacaval shunting suggests that, in chronic liver failure, muscle becomes the major organ responsible for the removal of excess blood-borne ammonia.