32 resultados para DNA damage response
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Problmatique: Le virus du papillome humain (VPH) est prsent dans prs de 50% des cancers de loropharynx. Le potentiel oncognique du VPH est encod dans les oncoprotines E6 et E7, qui agissent en modulant diffrents gnes, dont les gnes suppresseurs de tumeur p53 et pRb. Les cellules VPH positives dmontrent une altration au niveau de la signalisation de la rponse aux dommages lADN (RDA), un mcanisme de contrle dans larrt de la croissance des cellules ayant subit des dommages au niveau de leur ADN. Hypothse et objectifs : Nous croyons que les dfauts au niveau de la RDA des cancers VPH positifs peuvent tre exploits afin de sensibiliser prfrentiellement les cellules cancreuses aux traitements de radiothrapie. Cette stratgie de recherche ncessite llaboration dun modle cellulaire de carcinogense isognique pour le cancer de loropharynx que nous proposons de dvelopper et de caractriser. Ltude vise driver des lignes isogniques partir de kratinocytes primaires et cellules pithliales de loropharynx pour ensuite valider la carcinogense de notre modle in vitro & in vivo Mthodologie : Des lignes cellulaires de kratinocytes primaires et de cellules pithliales de loropharynx ont t successivement modifies par transduction afin de prsenter les mutations associes aux cancers de loropharynx induits par le VPH. Les cellules ont t modifies avec des lentivirus codants pour la tlomrase (hTERT), les oncognes E6, E7 et RasV12. Afin de valider la cancrogense in vitro de notre modle, des tudes dinvasion en matrigel et de croissance sans ancrage en agar mou ont t ralises. Les populations cellulaires transformes ont t ensuite introduites dans des souris immunodficientes afin dvaluer leur tumorognicit in vivo. Rsultats : partir des plasmides recombins construits par mthodes de clonage traditionnelle et de recombinaison Gateway , nous avons produit des lentivirus codants pour la tlomrase humaine (hTERT), les oncognes viraux E6 et E7 et loncogne Ras. Les kratinocytes primaires et cellules pithliales de loropharynx ont t infects successivement par transduction et slectionns. Nous avons valid lexpression de nos transgnes par mthode dimmunofluorescence, de Western Blot et de raction de polymrisation en chane quantitative en temps rel (qRT-PCR). Nous avons tabli trois lignes des cellules pithliales de loropharynx (HNOE) partir dchantillons tissulaires prlevs lors damygdalectomie (HNOE42, HNO45, HNOE46). Les cellules transduites avec le lentivirus exprimant le promoteur fort CMV/TO de loncogne RasV12 ont prsent un changement morphologique compatible avec une snescence prmature induite par loncogne Ras. En exprimant des quantits plus faibles du RasV12 mutant, la ligne cellulaire HEKn hTERT-E6-E7 PGK RasV12 a russi chapper la snescence induite par loncogne Ras. La population cellulaire exprimant HEKn hTERT-E6-E7-PGK RasV12 a prsent un phnotype malin en culture et ltude d'invasion, mais na pas dmontr de rsultats positifs ltude de croissance sans ancrage en agar mou ni en xnogreffe en souris immunodficientes. Conclusion : Nos rsultats dmontrent quen prsence des oncognes viraux E6 et E7, il y a un troisime mcanisme suppresseur de tumeur qui mdie la snescence induite par loncogne Ras. Nous avons identifi que la prsence de E6 seule ne suffit pas immortaliser les kratinocytes primaires humains (HEKn). Nous navons pas russi crer un modle in vitro de carcinogense pour les cancers de loropharynx induits par le VPH.
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La voie de signalisation Ras/MAPK (Ras/mitogen-activated protein kinase) rgule une varit de protines intracellulaires qui jouent un rle important dans la croissance et la prolifration cellulaire. La rgulation inapproprie de cette voie de signalisation conduit au dveloppement de nombreux cancers comme le mlanome, qui est caractris par des mutations activatrices au niveau des gnes NRAS et BRAF. La protine kinase RSK (p90 ribosomal S6 kinase) est un composant central de la voie Ras/MAPK, mais son rle dans la croissance et la prolifration cellulaire nest pas bien compris. RSK a t montre pour participer la rsistance des mlanomes aux chimiothrapies, mais le mcanisme molculaire reste encore lucider. Nous montrons laide dun anticorps phospho-spcifique que MDM2 est phosphoryle en rponse des agonistes et des mutations oncogniques activant spcifiquement la voie Ras/MAPK. En utilisant des mthodes in vitro et in vivo, nous avons constat que RSK phosphoryle directement MDM2 sur les Srines 166 et 186, ce qui suggre que MDM2 est un substrat de RSK. La mutagnse dirige envers ces sites nous indique que ces rsidus rgulent lubiquitination de MDM2, suggrant que RSK rgule la stabilit de MDM2 et de p53. De plus, nous avons observ que linhibition de RSK conduit une augmentation du niveau protique de p53 aprs un dommage lADN dans les cellules de mlanomes. En conclusion, nos travaux suggrent un rle important de la protine kinase RSK dans la rgulation de MDM2 et de sa cible, p53. Ltude de ces mcanismes molculaires aidera mieux dfinir le rle de RSK dans la croissance tumorale, mais galement dans la rsistance aux agents chimiothrapeutiques.
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Introduction Les lsions induites par les rayons UV peuvent causer des blocages dans la rplication de l'ADN. Ces dommages sont limins par le processus molculaire trs conserv de rparation par excision de nuclotides (NER). Nous avons prcdemment dmontr que la protine ATR, une kinase majeure implique dans le stress rplicatif, est requise pour une NER efficace, et ce exclusivement durant la phase S. Des rsultats subsquents ont suggr que ce prrequis ntait pas li la rponse induite par ATR, mais plutt dune consquence globale cause par la prsence de stress rplicatif. En ce sens, nous mettons lemphase quaprs irradiation UV, le complexe RPA joue un rle crucial dans l'activation des mcanismes de NER ainsi que dans le redmarrage des fourches de rplication bloques. Hypothses: En gnral, les mutations qui confrent une augmentation du stress rplicatif engendrent une squestration excessive du facteur RPA aux fourches de rplication bloques ce qui rduit son accessibilit pour le NER. Mthodes et rsultats: Le modle de la levure a t choisi pour vrifier cette hypothse. Nous avons dvelopp un essai de NER spcifique chacune des phases du cycle cellulaire pour dmontrer que les cellules dficientes en Mec1, lhomologue dATR, sont dfectives dans la rparation par excision de nuclotides spcifiquement en phase S. De plus, plusieurs autres mutants de levure, caractriss par un niveau de dommages spontans lev, ont aussi exhib un dfaut similaire. Ces mutants ont dmontr une frquence et une intensit de formation de foyers de RPA plus leve. Finalement, une diminution partielle de RPA dans les levures a induit un dfaut significatif dans le NER spcifiquement durant la phase S. Conclusion: Nos rsultats supportent la notion que la squestration de RPA aux fourches de rplication endommages durant la phase S prvient son utilisation pour la rparation par excision de nuclotides ce qui inhibe fortement l'efficacit de rparation. Cette tude chez la levure facilite llucidation du phnomne analogue chez lhumain et, ultimement, comprend des implications majeures dans la comprhension du mcanisme de dveloppement des cancers UV-dpendants.
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Les sites apuriniques/apyrimidinique (AP) reprsentent une forme de dommage lADN hautement mutagne et ce type de dommage peut survenir spontanment ou tre induit par une varit dagents. Afin de prserver la stabilit gnomique, deux familles dendonuclases de type AP, endo-IV et exo-III, sont ncessaires pour contrecarrer les effets mutagnes des sites AP. Malgr lidentification de membres des deux familles dans plusieurs organismes unicellulaire tels que E.coli et S. cerevisiae, aucun membre de la famille endo-IV na t identifi chez les organismes multicellulaires lexception de C. elegans et de C. briggsae. Nous avons donc dcid dinvestiguer limportance biologique de APN-1 chez C. elegans par lutilisation dune approche de knockdown du gne. Dans notre tude, nous avons montr que le knockdown du gne apn-1 chez C. elegans, en utilisant des ARN dinterfrence (ARNi), cause une accumulation de mutations spontanes et induites par des drogues rsultant en un dlai de lclosion des ufs ainsi que par une diminution de la survie et de la longvit des vers adultes. De plus, nous avons montr que cette accumulation de mutations mne un dlai dans la progression du cycle cellulaire durant lembryognse, reprsentant possiblement une explication du dlai dans lclosion des ufs. Nous avons montr quil y avait une augmentation du niveau de mutations dans la gorge des vers, sans toutefois pouvoir confirmer la distribution de APN-1 qui possde une tiquette GFP. Les animaux transgniques APN-1-GFP nexprimaient pas suffisamment de la protine de fusion pour permettre une visualisation laide dun microscope fluorescence, mais la protine a t dtecte par immunobuvardage de type western. Les animaux transgniques APN-1-GFP taient instables et avaient des phnotypes concordants avec les dfauts gntiques. En conclusion, il semble que C. elegans aie volu afin de retenir un niveau de base de APN-1 jouant ainsi un rle versatile afin de maintenir lintgrit gntique dautant plus que cet organisme semble manquer plusieurs enzymes de la voie de rparation par excision de base.
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La rparation par excision de nuclotides (NER) est une voie critique chez l'homme pour enlever des lsions qui dforment lhlice d'ADN et qui bloquent la fois la rplication et la transcription. Parmi ces lsions, il y a les dimres cyclobutyliques de pyrimidines (CPDs) et les adduits pyrimidine (6-4) pyrimidone (6-4PPs) induient par les rayons ultraviolets. L'importance physiologique de la NER est mise en vidence par lexistence de la maladie Xeroderma pigmentosum (XP), cause par des mutations affectant des gnes impliqus dans cette voie de rparation. Les personnes atteintes sont caractrises par une photosensibilit extrme et une forte prdisposition dvelopper des tumeurs cutanes (plus de 1000 fois). Les patients atteints du type variant de la maladie Xeroderma pigmentosum (XPV), apparemment comptents en rparation, portent plutt des mutations dans le gne codant pour l'ADN polymrase (pol). Pol est une ADN polymrase translsionnelle capable de contourner avec une grande fidlit certaines lsions telles que les CPDs, qui autrement bloquent les polymrases rplicatives. Ainsi, la pol prvient la formation de mutations et permet la reprise de la synthse d'ADN. L'objectif principal de cette thse est d'valuer le rle potentiel de voies de signalisation majeures dans la rgulation de la NER, dont celles rgules par la kinase ATR (Ataxia Tlangiectasia and Rad3-related kinase). Suite l'irradiation UV, ATR est rapidement active et phosphoryle des centaines de protines qui rgulent les points de contrle du cycle cellulaire et joue un rle notoire dans le maintient de la stabilit gnomique. Nous avons postul quATR puisse rguler la NER de manire dpendante du cycle cellulaire. Cependant, tester cette hypothse reprsente un grand dfi car, pour des raisons techniques, les mthodes conventionnelles nont pas ce jour t adaptes pour l'valuation de la cintique de rparation au cours des diffrentes phases du cycle cellulaire. Nous avons donc dvelopp une mthode novatrice base sur la cytomtrie en flux permettant de quantifier avec grande prcision la cintique de rparation des 6-4PPs et CPDs dans chacune des phases G0/G1, S et G2/M. Avec cette nouvelle mthode, nous avons pu dmontrer que l'inhibition d'ATR ou pol rsulte en une trs forte inhibition de la NER exclusivement durant la phase S du cycle cellulaire. Ces tudes ont rvl, pour la premire fois, une fonction critique pour ces protines dans le retrait des lsions qui bloquent la rplication. En outre, nous avons dmontr que la synthse d'ADN est indispensable pour linhibition de la rparation en phase-S, refltant un lien potentiel entre la NER et la rplication. Curieusement, nous avons galement montr que parmi six lignes cellulaires tumorales choisies alatoirement, trois prsentent une abrogation totale de la NER uniquement pendant la phase S, ce qui indique que de nombreux cancers humains pourraient tre caractriss par un tel dfaut. Nos observations pourraient avoir d'importantes implications pour le traitement du cancer. En effet, le statut de la NER semble constituer un dterminant majeur dans la rponse clinique aux mdicaments chimiothrapeutiques tels que le cisplatine, qui inhibent la croissance des cellules cancreuses via l'induction de lsions lADN.
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Les sites apuriniques/apyrimidiniques (AP) sont des sites de lADN hautement mutagne. Les dommages au niveau de ces sites peuvent survenir spontanment ou tre induits par une varit dagents. Chez lhumain, les sites AP sont rpars principalement par APE1, une enzyme de rparation de lADN qui fait partie de la voie de rparation par excision de base (BER). APE1 est une enzyme multifonctionnelle; cest une AP endonuclase, 3-diestrase et un facteur redox impliqu dans lactivation des facteurs de transcription. Rcemment, il a t dmontr quAPE1 interagit avec lenzyme glycolytique GAPDH. Cette interaction induit lactivation dAPE1 par rduction. En outre, la dltion du gne GAPDH sensibilise les cellules aux agents endommageant lADN, induit une augmentation de formation spontane des sites AP et rduit la prolifration cellulaire. A partir de toutes ces donnes, il tait donc intressant dtudier leffet de la dltion de GAPDH sur la progression du cycle cellulaire, sur la distribution cellulaire dAPE1 et didentifier la cystine(s) dAPE1 cible(s) de la rduction par GAPDH. Nos travaux de recherche ont montr que la dficience en GAPDH cause un arrt du cycle cellulaire en phase G1. Cet arrt est probablement d laccumulation des dommages engendrant un retard au cours duquel la cellule pourra rparer son ADN. De plus, nous avons observ des foci nuclaires dans les cellules dficientes en GAPDH qui peuvent reprsenter des agrgats dAPE1 sous sa forme oxyde ou bien des focis de la protine inactive au niveau des lsions dADN. Nous avons utilis la mutagnse dirige pour crer des mutants (Cys en Ala) des sept cystines dAPE1 qui ont t clon dans un vecteur dexpression dans les cellules de mammifres. Nous mettons lhypothse quau moins un mutant ou plus va tre rsistant linactivation par oxydation puisque lalanine ne peut pas sengager dans la formation des ponts disulfures. Par consquent, on anticipe que lexpression de ce mutant dans les cellules dficientes en GAPDH pourrait restaurer une distribution cellulaire normale de APE1, librerait les cellules de larrt en phase G1 et diminuerait la sensibilit aux agents endommageant lADN. En conclusion, il semble que GAPDH, en prservant lactivit dAPE1, joue un nouveau rle pour maintenir lintgrit gnomique des cellules aussi bien dans les conditions normales quen rponse au stress oxydatif.
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L'assemblage des nuclosomes est troitement couple la synthse des histones ainsi qu la rplication et la rparation de lADN durant la phase S. Ce processus implique un mcanisme de contrle qui contribue soigneusement et de manire rgule lassemblage de lADN en chromatine. L'assemblage des nuclosomes durant la synthse de lADN est crucial et contribue ainsi au maintien de la stabilit gnomique. Cette thse dcrit la caractrisation par spectromtrie de masse(SM) des protines jouant un rle critique dans lassemblage et le maintien de la structure chromatinienne. Plus prcisment, la phosphorylation de deux facteurs dassemblage des nuclosome, le facteur CAF-1, une chaperone dhistone qui participe l'assemblage de la chromatine spcifiquement couple la rplication de l'ADN, ainsi que le complexe protique Hir, jouant de plus un rle important dans la rgulation transcriptionelle des gnes dhistones lors de la progression normale du cycle cellulaire et en rponse aux dommages de l'ADN, a t examin. La caractrisation des sites de phosphorylation par SM ncssite la sparation des protines par lctrophorse suivi dune coloration a largent. Dans le chapitre 2, nous demontrons que la coloration largent induit un artfact de sulfatation. Plus prcisment, cet artfact est caus par un ractif spcifiquement utilis lors de la coloration. La sulfatation prsente de fortes similitudes avec la phosphorylation. Ainsi, lincrment de masse observ sur les peptides sulfats et phosphoryls (+80 Da) ncssite des instruments offrant une haute rsolution et haute prcision de masse pour diffrencier ces deux modifications. Dans les chapitres 3 et 4, nous avons dabord dmontr par SM que Cac1, la plus grande sous-unit du facteur CAF-1, est cible de plusieurs sites de phosphorylation. Fait intrssant, certains de ces sites contiennent des squences consensus pour les kinases Cdc7-Dbf4 et CDKs. Ainsi, ces rsultats fournissent les premires vidences que CAF-1 est potentiellement rgul par ces deux kinases in vivo. La fonction de tous les sites de phosphorylation identifis a ensuite t value. Nous avons dmontr que la phosphorylation de la Ser-503, un site consensus de la DDK, est essentielle la rprssion transcriptionelle des gnes au niveau des tlomres. Cependant, cette phosphorylation ne semble pas tre ncssaire pour dautres fonctions connues de CAF-1, indiquant que le blocage de la phsophorylation de Cac1 Ser-503 affecte spcifiquement la fonction de CAF-1 aux structures htrochromatiques des tlomres. Ensuite, nous avons identifis une intraction physique entre CAF-1 et Cdc7-Dbf4. Des tudes in vitro ont galement demontr que cette kinase phosphoryle spcifiquement Cac1 Ser-503, suggrant un rle potential pour la kinase Cdc7-Dbf4 dans lassemblage et la stabilit de la structure htrochromatique aux tlomres. Finalement, les analyses par SM nous ont galement permi de montrer que la sous-unit Hpc2 du complexe Hir est phosphoryle sur plusieurs sites consensus des CDKs et de Cdc7-Dbf4. De plus, la quantification par SM dun site spcifique de phosphorylation de Hpc2, la Ser-330, sest rvle tre fortement induite suite lactivation du point de contrle de rplication (le checkpoint) suite au dommage a lADN. Nous montrons que la Ser-330 de Hpc2 est phopshoryle par les kinases de point de contrle de manire Mec1/Tel1- et Rad53-dpendante. Nos donnes prliminaires suggrent ainsi que la capacit du complex Hir de rguler la rprssion transcriptionelle des gnes d'histones lors de la progression du cycle cellulaire normal et en rponse au dommage de l'ADN est mdie par la phosphorylation de Hpc2 par ces deux kinases. Enfin, ces deux tudes mettent en vidence l'importance de la spectromtrie de masse dans la caractrisation des sites de phosphorylation des protines, nous permettant ainsi de comprendre plus prcisement les mcanismes de rgulation de l'assemblage de la chromatine et de la synthse des histones.
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Le benzo-a-pyrne (BaP) est un hydrocarbure aromatique polycyclique (HAP) cancrogne pour lhomme, qui contamine toutes les sphres de notre environnement. Son mtabolite, le BaP-7,8-diol-9,10-poxyde (BPDE) est considr comme son cancrogne ultime. Le BPDE se lie lADN, formant des adduits qui doivent tre rpars et qui seraient responsables des dommages lADN et de la cancrogense induite par le BaP. Les adduits BPDE-ADN et les dommages lADN (bris simple-brin [BSB] lADN, aberrations chromosomiques [AC], changes entre chromatides-surs [CS] et micronoyaux [MN]) ont t mesurs dans les lymphocytes humains exposs de faibles concentrations de BaP, provenant de jeunes volontaires non-fumeurs et en sant. Suite lexposition au BaP, le niveau dadduits BPDE-ADN et la frquence des AC et des MN augmentent significativement, puis diminuent aux concentrations les plus leves de BaP testes, suggrant une induction du mtabolisme de phase II du BaP. Lors de la mesure des CS, nous obtenons une courbe dose-rponse linaire, indiquant la production dun autre type de lsions devant tre rpares par le systme de rparation par recombinaison homologue. Ces lsions pourraient tre des bris lADN ou des bases oxydes (8-OH-dG), ce qui est suggr par lanalyse des corrlations existant entre nos biomarqueurs. Par ailleurs, la comparaison de la courbe dose-rponse des hommes et des femmes montre que des diffrences existent entre les sexes. Ainsi, les CS, les AC et les MN sont significativement augments chez les hommes la plus faible concentration de BaP, alors que chez les femmes cette augmentation, quoique prsente, est non significative. Des diffrences interindividuelles sont galement observes et sont plus importantes pour les adduits BPDE-ADN, les MN et les AC, alors que pour les CS elles sont minimes. Les analyses statistiques effectues ont permis dtablir que quatre facteurs (niveau dexposition au BaP, adduits BPDE-ADN, frquence des AC et nombre de MN par cellule micronucle) expliquent jusqu 59 % de la variabilit observe dans le test des CS, alors quaucun facteur significatif na pu tre identifi dans le test des AC et des MN. Lanalyse du mcanisme de formation de nos biomarqueurs prcoces permet de suggrer que les bris lADN et les bases oxydes devraient tre classes comme biomarqueurs de dose biologique efficace, au sein des biomarqueurs dexposition, dans le continuum exposition-maladie du BaP, tant donn quils causent la formation des biomarqueurs de gnotoxicit (CS, AC et MN). Par ailleurs, le test des AC et des MN ont permis de confirmer laction clastognique du BaP en plus de mettre en vidence des effets aneugnes affectant surtout la sgrgation des chromosomes lors de la division cellulaire. Ces effets aneugnes, relis ltape de progression dans la cancrogense, pourraient tre particulirement importants puisque lexposition au BaP et aux HAP est chronique et dure plusieurs annes, voire des dcennies. La comprhension des mcanismes rgissant la formation des biomarqueurs tudis dans cette tude, ainsi que des relations existant entre eux, peut tre applique de nombreux contaminants connus et mergents de notre environnement et contribuer en valuer le mode daction.
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Les modifications post-transcriptionnelles de lARN messager (ARNm), comme lpissage alternatif, jouent un rle important dans la rgulation du dveloppement embryonnaire, de la fonction cellulaire et de limmunit. De nouvelles vidences rvlent que lpissage alternatif serait galement impliqu dans la rgulation de la maturation et de lactivation des cellules du systme hmatopotique. Le facteur hnRNP L a t identifi comme tant le principal rgulateur de lpissage alternatif du gne codant pour le rcepteur CD45 in vitro. Le rcepteur CD45 est une tyrosine phosphatase exprime par toutes les cellules du systme hmatopotique qui contrle le dveloppement et lactivation des lymphocytes T. Dans un premier temps, nous avons tudi la fonction du facteur hnRNP L dans le dveloppement des lymphocytes T et dans lpissage de lARNm de CD45 in vivo en utilisant des souris dont le gne de hnRNP L a t supprim spcifiquement dans les cellules T. La dltion de hnRNP L dans les thymocytes rsulte en une expression aberrante des diffrents isoformes de CD45 avec une prdominance de l'isoforme CD45RA qui est gnralement absent dans le thymus. Une consquence de la dltion de hnRNP L est une diminution de la cellularit du thymus cause par un blocage partiel du dveloppement des cellules pr-T au stade DN4. Cette rduction du nombre de cellules dans le thymus nest pas lie une hausse de la mort cellulaire. Les thymocytes dficients pour hnRNP L dmontrent plutt une prolifration augmente compare aux thymocytes sauvages due une hyper-activation des kinases Lck, Erk1/2 et Akt. De plus, la dltion de hnRNP L dans le thymus cause une perte des cellules T en priphrie. Les rsultats des expriences in vitro suggrent que cette perte est principalement due un dfaut de migration des thymocytes dficients pour hnRNP L du thymus vers la priphrie en rponse aux chimiokines. Lpissage alternatif de CD45 ne peut expliquer ce phnotype mais lidentification de cibles par RNA-Seq a rvl un rle de hnRNP L dans la rgulation de lpissage alternatif de facteurs impliqus dans la polymrisation de lactine. Dans un second temps, nous avons tudi le rle de hnRNP L dans lhmatopose en utilisant des souris dont la dltion de hnRNP L tait spcifique aux cellules hmatopotiques dans les foies ftaux et la moelle osseuse. Lablation de hnRNP L rduit le nombre de cellules prognitrices incluant les cellules prognitrices lymphocytaires (CLPs), mylodes (CMPs, GMPs) et mgakaryocytes-rythrocytaires (MEPs) et une perte des cellules hmatopotiques matures. loppos des cellules prognitrices multipotentes (MPPs) qui sont affectes en absence de hnRNP L, la population de cellules souches hmatopotiques (HSCs) nest pas rduite et prolifre plus que les cellules contrles. Cependant, les HSCs nexprimant pas hnRNP L sont positives pour l'Annexin V et expriment CD95 ce qui suggre une mort cellulaire prononce. Comme pour les thymocytes, une analyse par RNA-Seq des foies ftaux a rvl diffrents gnes cibles de hnRNP L appartenant aux catgories relies la mort cellulaire, la rponse aux dommages lADN et ladhsion cellulaire qui peuvent tous expliquer le phnotype des cellules nexprimant pas le gne hnRNP L. Ces rsultats suggrent que hnRNP L et lpissage alternatif sont essentiels pour maintenir le potentiel de diffrenciation des cellules souches hmatopotiques et leur intgrit fonctionnelle. HnRNP L est aussi crucial pour le dveloppement des cellules T par la rgulation de lpissage de CD45 ainsi que pour leur migration.
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Linfection par le VIH-1 est caractrise par une activation chronique du systme immunitaire et par une rduction graduelle du nombre de lymphocytes TCD4+, qui contribuent une dtrioration lente du systme immunitaire menant la phase SIDA. Paradoxalement, ce sont majoritairement des lymphocytes T CD4+ non infects qui sont dtruits et la cause de ce phnomne reste encore inconnue. Certaines protines virales, dont la protine accessoire Vpr, sont souponnes de jouer un rle dans ce processus. Synthtise tardivement, Vpr est incorpore lintrieur des virions, en plus dtre relche sous forme soluble dans le milieu extracellulaire. La principale fonction biologique de Vpr est linduction dun arrt de cycle en phase G2/M, via le recrutement du complexe dubiquitine E3 ligase CUL4A-DDB1VprBP et lactivation de la voie de dommage lADN contrle par la kinase ATR. Une tude dmontre que lactivation des voies de dommages lADN conduit lexpression de ligands du rcepteur activateur NKG2D, exprims par les cellules NK, dclenchant leurs fonctions cytolytiques. Chose intressante, plusieurs tudes suggrent que le VIH-1 rgule positivement lexpression des ligands de NKG2D la surface des lymphocytes T CD4+ infects. Cependant, le facteur viral impliqu dans ce processus reste encore indfini. Le but de cette thse tait dvaluer le rle de Vpr dans la modulation des fonctions cytolytiques des cellules NK et son implication potentielle dans la destruction des lymphocytes T CD4+. Nos travaux ont permis de dmontrer que lexpression de Vpr, seule ou dans le contexte de linfection, est suffisante afin daugmenter spcifiquement lexpression du ligand de NKG2D, ULBP2, au niveau de lymphocytes T CD4+ primaires. Consquemment, Vpr augmente ainsi la susceptibilit de ces cellules une lyse par des cellules NK autologues. Nous dmontrons que cette rgulation positive dULBP2 repose sur la capacit de Vpr de recruter le complexe dubiquitine E3 ligase DDB1-CUL4AVprBP et lactivation de la voie de dommage lADN ATR. Plus important encore, nous apportons des preuves que Vpr augmente galement lexpression dULBP2 au niveau des cellules non infectes lors dune infection de lymphocytes TCD4+ par le VIH-1. cet effet, nous montrons que lacheminement de Vpr au niveau de lymphocytes T CD4+ non infects via des particules virales dfectives est suffisant afin de rguler positivement ULBP2 et daugmenter leur lyse par des cellules NK autologues. De plus, nous dcrivons pour la premire fois que Vpr, sous forme soluble, a la capacit dinduire des dommages lADN et de rguler positivement ULBP2 suite la transduction de diffrents types cellulaires, incluant des cellules T. Globalement, nos rsultats dmontrent que Vpr est un facteur viral cl impliqu dans la rgulation positive des ligands de NKG2D induite par le VIH-1. Cette rgulation positive dULBP2 pourrait alors contribuer la destruction des lymphocytes T CD4+ infects et non infects via lactivation des fonctions cytolytiques des cellules NK. Une meilleure comprhension de la contribution de cette activit de Vpr dans la pathogense du VIH-1 a le potentiel de permettre le dveloppement de nouvelles cibles ou stratgies thrapeutiques contre le VIH-1.
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La rponse cellulaire aux ultra-violets (UV), ou rponse UV, est une rponse complexe et spcialise dans ladaptation et la tolrance des dommages aux UV. Celle-ci est initie par un grand nombre dvnements molculaires et de signalisation nuclaire mais aussi au niveau de la membrane plasmique ou du cytoplasme. Limportance et linfluence exactes de ces vnements sur la rparation par excision de nuclotides (NER) des dommages UV lADN sont encore mal comprises et doivent encore tre mthodiquement dmontres. Dans cette thse, grce lutilisation dune mthode sensible danalyse de la rparation NER base sur la cytomtrie en flux, il est montr, dans un premier temps, que lactivit des voies MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinases), qui sont des voies de signalisation de stress UV dorigine cytoplsamique, ne participent pas lefficacit de rparation NER des dommages UV dans les cellules humaines. En effet, labrogation de la signalisation MAPK, par inhibition pharmacologique, par utilisation de mutants dominant-ngatifs ou par inhibition de leur expression endogne, ne rvlent aucun changement de la cintique de rparation des dommages UV par excision de nuclotides. Cependant, lutilisation de cette mme mthode de rparation, mais cette fois, applique pour ltude de rparation NER en fonction du cycle cellulaire, a permis de mettre en vidence la ncessit fonctionnelle de lADN polymrase translsionnelle eta (Pol ) dans la rparation NER des dommages UV, uniquement en phase S. Cette observation fut initialement caractrise dans les cellules de patients affects du syndrome variant de xrodermie pigmentaire (XP-V) puis, confirme ensuite par linhibition de lexpression de Pol endogne ou par la complmentation avec des mutants non-fonctionnels dans les cellules XP-V. Ces rsultats indiquent que, contrairement la rponse UV MAPK cytoplasmique, les vnements nuclaires comme la synthse translsionnelle, peuvent influencer lefficacit de rparation NER en phase S. Plus particulirement, ces donnes tablissent un lien possible entre la rparation NER en phase S et les niveaux de stress rplicatifs, rvl ici par la dficience fonctionnelle Pol ou ATR. Les observations, prsentes dans cette thse, renforcent un rle du point de contrle S aux UV sur lefficacit de la rparation NER et suggrent que linhibition NER, observe en phase S dans les cellules XP-V, est module par le stress rplicatif. Un tel moyen de contrle pourrait avoir une action plutt protectrice pendant cette phase critique du cycle cellulaire. Mots cls: UV, translsionnelle, eta, MAPK, NER, CPD, cytomtrie, phase-S, tolrance.
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La chromatine possde une plasticit complexe et essentielle pour rpondre diffrents mcanismes cellulaires fondamentaux tels la rplication, la transcription et la rparation de lADN. Les histones sont les constituants essentiels de la formation des nuclosomes qui assurent le bon fonctionnement cellulaire do lintrt de cette thse dy porter une attention particulire. Un dysfonctionnement de la chromatine est souvent associ lmergence du cancer. Le chapitre II de cette thse focalise sur la rpression transcriptionnelle des gnes dhistones par le complexe HIR (HIstone gene Repressor) en rponse au dommage l'ADN chez Saccharomyces cerevisiae. Lors de dommage lADN en dbut de phase S, les kinases du point de contrle Mec1, Tel1 et Rad53 sassurent de bloquer les origines tardives de rplication pour limiter le nombre de collisions potentiellement mutagniques ou cytotoxiques entre les ADN polymrases et les lsions persistantes dans l'ADN. Lorsque la synthse totale dADN est soudainement ralentie par le point de contrle, laccumulation d'un excs d'histones nouvellement synthtises est nfaste pour les cellules car les histones libres se lient de manire non-spcifique aux acides nucliques. L'un des mcanismes mis en place afin de minimiser la quantit dhistones libres consiste rprimer la transcription des gnes d'histones lors d'une chute rapide de la synthse d'ADN, mais les bases molculaires de ce mcanisme taient trs mal connues. Notre tude sur la rpression des gnes dhistones en rponse aux agents gnotoxiques nous a permis didentifier que les kinases du point de contrle jouent un rle dans la rpression des gnes dhistones. Avant le dbut de mon projet, il tait dj connu que le complexe HIR est requis pour la rpression des gnes dhistones en phase G1, G2/M et lors de dommage lADN en phase S. Par contre, la rgulation du complexe HIR en rponse au dommage l'ADN n'tait pas connue. Nous avons dmontr par des essais de spectromtrie de masse (SM) que Rad53 rgule le complexe HIR en phosphorylant directement une de ses sous-units, Hpc2, de multiples rsidus in vivo et in vitro. La phosphorylation dHpc2 est essentielle pour le recrutement aux promoteurs de gnes dhistones du complexe RSC (Remodels the Structure of Chromatin) dont la prsence sur les promoteurs des gnes d'histones corrle avec leur rpression. De plus, nous avons mis jour un nouveau mcanisme de rgulation du complexe HIR durant la progression normale travers le cycle cellulaire ainsi qu'en rponse aux agents gnotoxiques. En effet, durant le cycle cellulaire normal, la protine Hpc2 est trs instable durant la transition G1/S afin de permettre la transcription des gnes dhistones et la production d'un pool d'histones no-synthtises juste avant l'initiation de la rplication de lADN. Toutefois, Hpc2 n'est instable que pour une brve priode de temps durant la phase S. Ces rsultats suggrent qu'Hpc2 est une protine clef pour la rgulation de l'activit du complexe HIR et la rpression des gnes dhistones lors du cycle cellulaire normal ainsi qu'en rponse au dommage lADN. Dans le but de poursuivre notre tude sur la rgulation des histones, le chapitre III de ma thse concerne lanalyse globale de lactylation des histones induite par les inhibiteurs dhistone dsactylases (HDACi) dans les cellules normales et cancreuses. Les histones dsactylases (HDACs) sont les enzymes qui enlvent lactylation sur les lysines des histones. Dans plusieurs types de cancers, les HDACs contribuent loncogense par leur fusion aberrante avec des complexes protiques oncogniques. Les perturbations causes mnent souvent un tat silencieux anormal des suppresseurs de tumeurs. Les HDACs sont donc une cible de choix dans le traitement des cancers engendrs par ces protines de fusion. Notre tude de leffet sur lactylation des histones de deux inhibiteurs d'HDACs de relevance clinique, le vorinostat (SAHA) et lentinostat (MS-275), a permis de dmontrer une augmentation leve de lactylation globale des histones H3 et H4, contrairement H2A et H2B, et ce, autant chez les cellules normales que cancreuses. Notre quantification en SM de l'actylation des histones a rvl de faon inattendue que la stchiomtrie d'actylation sur la lysine 56 de lhistone H3 (H3K56Ac) est de seulement 0,03% et, de manire surprenante, cette stchiomtrie n'augmente pas dans des cellules traites avec diffrents HDACi. Plusieurs tudes de H3K56Ac chez lhumain prsentes dans la littrature ont rapport des rsultats irrconciliables. Qui plus est, H3K56Ac tait considr comme un biomarqueur potentiel dans le diagnostic et pronostic de plusieurs types de cancers. Cest pourquoi nous avons port notre attention sur la spcificit des anticorps utiliss et avons dtermin quune grande majorit danticorps utiliss dans la littrature reconnaissent dautres sites d'actylation de lhistone H3, notamment H3K9Ac dont la stchiomtrie d'actylation in vivo est beaucoup plus leve que celle d'H3K56Ac. De plus, le chapitre IV fait suite notre tude sur lactylation des histones et consiste en un rapport spcial de recherche dcrivant la fonction de H3K56Ac chez la levure et lhomme et comporte galement une valuation dun anticorps supposment spcifique d'H3K56Ac en tant qu'outil diagnostic du cancer chez lhumain.
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Lubiquitination est une modification post-traductionnelle qui joue un rle majeur dans la rgulation dune multitude de processus cellulaires. Dans cette thse, je discuterai de la caractrisation de deux protines, BRCA1 et BAP1, soit deux suppresseurs de tumeurs fonctionnellement relis. BRCA1, une ubiquitine ligase qui catalyse la liaison de lubiquitine une protine cible, est mute dans les cancers du sein et de l'ovaire. Il est bien tabli que cette protine aide maintenir la stabilit gnomique suite un bris double brin de lADN (BDB), et ce, laide dun mcanisme de rparation bien caractris appel recombinaison homologue. Cependant, les mcanismes de rgulation de BRCA1 suite des stresses gnotoxiques nimpliquant pas directement un BDB ne sont pas pleinement lucids. Nous avons dmontr que BRCA1 est rgule par dgradation protasomale suite une exposition des cellules deux agents gnotoxiques reconnus pour ne pas directement gnrer des BDBs, soit les rayons UV, qui provoquent la distorsion de lhlice dADN, et le mthyle mthanesulfonate (MMS), qui entrane lalkylation de lADN. La dgradation de BRCA1 est rversible et indpendante des kinases associes la voie des PI3 kinase, soit ATM, ATR et DNA-PK, protines qui sont rapidement actives par les dommages lADN. Nous proposons que la dgradation de BRCA1 prvienne son recrutement intempestif, ainsi que celui des facteurs qui lui sont associs, des sites de dommages dADN qui ne sont pas des BDBs, et que cette rgulation coordonne la rparation de lADN. Lenzyme de dubiquitination BAP1 a initialement t identifie comme une protine capable dinteragir avec BRCA1 et de rguler sa fonction. Elle est galement connue pour sa capacit se lier avec les protines du groupe Polycomb, ASXL1 et ASXL2. Cependant, limportance de ces interactions na toujours pas t tablie. Nous avons dmontr que BAP1 forme deux complexes protiques mutuellement exclusifs avec ASXL1 et ASXL2. Ces interactions sont critiques pour la liaison de BAP1 lubiquitine ainsi que pour la stimulation de son activit enzymatique envers lhistone H2A. Nous avons galement identifi des mutations de BAP1 drives de cancers qui empchent la fois son interaction avec ASXL1 et AXSL2, et son activit de dubiquitinase, ce qui fournit un lien mcanistique direct entre la dubiquitination de H2A et la tumorigense. lucider les mcanismes de rgulation de BRCA1 et BAP1 menera une meilleure comprhension de leurs rles de suppresseurs de tumeurs, permettant ainsi dtablir de nouvelles stratgies de diagnostic et traitement du cancer.
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Le cancer de lovaire (COv) est le cancer gyncologique le plus ltal chez la femme et les traitements existants, chirurgie et chimiothrapie, ont peu volu au cours des dernires dcennies. Nous proposons que la comprhension des diffrents destins cellulaires tels que la snescence que peuvent choisir les cellules du cancer de lovaire en rponse la chimiothrapie pourrait conduire de nouvelles opportunits thrapeutiques. La snescence cellulaire a t largement associe lactivit de la protine TP53, qui est mute dans plus de 90% des cas de cancer de lovaire sreux de haut grade (COv-SHG), la forme la plus commune de la maladie. Dans nos travaux, partir dchantillons drivs de patientes, nous montrons que les cultures primaires du cancer de lovaire sreux de haut grade exposes au stress ou des drogues utilises en chimiothrapie entrent en senescence grce lactivit dun isoforme du gne CDKN2A (p16INK4A). Dans ces cellules, nous avons valu les caractristiques fondamentales de la snescence cellulaire tels que les altrations morphologiques, lactivit bta galactosidase associe la snescence, les dommages lADN, larrt du cycle cellulaire et le phnotype scrtoire associ la snescence. En utilisant des micromatrices tissulaires construites partir dchantillons humains de COv-SHG pr- et post-chimiothrapie, accompagnes de leurs donnes cliniques, nous avons quantifi des marqueurs de snescence incluant une diminution de la prolifration cellulaire quelques semaines aprs chimiothrapie. De faon intressante, lexpression de p16INK4A dans les chantillons de COv-SHG prtraitement corrle avec une survie prolonge des patientes suite au traitement. Ceci suggre ainsi pour la premire fois un impact biologique bnfique pour la prsence de cellules cancreuses qui sont capable dactiver la snescence, particulirement pour le traitement du cancer de lovaire. Dans le but de complmenter les thrapies actuelles avec des approches de manipulation pharmacologique de la snescence, nos rsultats suggrent quil serait important de dterminer limpact positif ou ngatif de la snescence induite par la thrapie sur la progression de la maladie et la survie, pour chaque type de cancer de faon indpendante.
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Les kinases de la famille Polo (PLK) jouent un rle majeur durant le cycle cellulaire, notamment en promouvant des processus essentiels tels que lentre en phase M et la sortie du cycle cellulaire. Elles sont galement impliques dans plusieurs cancers et ont un fort pouvoir tumorigne. Notre laboratoire a rcemment montr que Cdc5 (la kinase PLK chez Saccharomyces cerevisiae) est galement ncessaire pour l'adaptation aux dommages l'ADN, et que la cible critique de Cdc5 au cours de ce processus pourrait tre une cible peu conventionnelle localise aux centrosomes de levures. Dans le but didentifier ce substrat, une analyse intgrale du phosphoprotome de PLK/Cdc5 par spectromtrie de masse devra tre ralise. Pour ce faire, un allle CDC5 sensible la temprature, cest--dire une version mutante qui devient inactive temprature leve, devra tre utilise. Cet allle devra tre thermosensible 30C, afin de sassurer quil sera le seul tre inactiv cette temprature et que, par consquent, seuls les substrats de Cdc5 seront identifis. cet effet, nous avons gnr deux allles cdc5 thermosensibles 30C : cdc5-17 et cdc5-18, puis analys leur cycle cellulaire 32C. Les rsultats de cette analyse ont montr que lexposition des cellules 32C rsulte en leur blocage en fin de mitose sous la forme bourgeonne, tmoignant dun dfaut dans la promotion de la sortie de la mitose. Ce dfaut est caus par la mutation du gne CDC5 dont la protine favorise la sortie de la mitose via deux voies : la voie du MEN (Mitotic Exit Network) et la voie du FEAR (Cdc Fourteen Early Anaphase Release). cdc5-17 et cdc5-18 reprsentent des outils biologiques prcieux qui permettront de mieux analyser le phosphoprotome de PLK/Cdc5 et de mener lidentification des cibles de Cdc5 lors de la rponse dadaptation aux dommages lADN. tant donn que ladaptation aux dommages lADN causs par des chimiothrapies reprsente lun des facteurs permettant la prolifration des tumeurs cancreuses, cette dcouverte serait un grand pas dans la lutte contre le cancer.
