Études fonctionnelles de deux nouvelles protéines centrosomales, NPHP5 et Cep76, et leurs implications dans les maladies humaines

Les centrosomes sont de petits organites qui régulent divers processus cellulaires comme la polarité ou la mitose dans les cellules de mammifères. Ils sont composés de deux centrioles entourés par une matrice péricentriolaire. Ces centrosomes sont les principaux centres organisateurs de microtubules. De plus, ils favorisent la formation de cils, des protubérances sur la surface des cellules quiescentes qui sont critiques pour la transduction du signal. Une grande variété de maladies humaines telles que les cancers ou les ciliopathies sont liées à un mauvais fonctionnement des centrosomes et des cils. C’est pourquoi le but de mes projets de recherche est de comprendre les mécanismes nécessaires à la biogénèse et au fonctionnement des centrosomes et des cils. Tout d'abord, j’ai caractérisé une nouvelle protéine centrosomale nommée nephrocystine - 5 (NPHP5). Cette protéine est localisée dans les cellules en interphase au niveau de la région distale des centrioles. Sa déplétion inhibe la migration des centrosomes à la surface cellulaire lors de l’étape précoce de la formation des cils. NPHP5 interagit avec la protéine CEP290 via sa région C-terminale qui est essentielle pour la ciliogenèse. Elle interagit également avec la calmoduline ce qui empêche son auto-agrégation. J’ai démontré que les domaines de liaison de NHPH5 à CEP290 et à la calmoduline, ainsi que son domaine de localisation centrosomale sont séparables. De plus, j’ai démontré que les protéines NPHP5 présentant des mutations pathogènes ne peuvent plus interagir avec CEP290 et ne sont plus localisées aux centrosomes, rendant ainsi ces protéines non fonctionnelles. Enfin, en utilisant une approche pharmacologique pour moduler les événements en aval dans la voie ciliogénique, j’ai montré que la formation des cils peut être restaurée même en absence de NPHP5. D’autre part, j’ai étudié le rôle de NPHP5 dans l'assemblage et le trafic du complexe BBSome dans le cil. Le BBSome est composé de huit sous-unités différentes qui s’assemblent en un complexe fonctionnel dont on sait peu de chose sur la régulation spatiotemporelle de son processus d'assemblage. J’ai précédemment montré que NPHP5 favorisait la formation des cils et que son dysfonctionnement contribuait au développement de néphronophtise (NPHP). Bien que la NPHP et le syndrome de Bardet-Biedl (BBS) soient des ciliopathies qui partagent des caractéristiques cliniques communes, la base moléculaire de ces ressemblances phénotypiques n’est pas comprise. J’ai constaté que NPHP5, localisé à la base du cil, contient deux sites de liaison distincts pour le BBSome. De plus, j’ai démontré que NPHP5 et son partenaire CEP290 interagissent de façon dynamique avec le BBSome pendant la transition de la prolifération à la quiescence. La déplétion de NPHP5 ou CEP290 conduit à la dissociation d’au moins deux sous-unités du BBSome formant alors un sous-complexe dont la capacité de migration dans le cil n’est pas compromise. J’ai montré que le transport des cargos vers le compartiment ciliaire par ce sous-complexe n’est que partiellement altéré. Enfin, j’ai également concentré mes recherches sur une autre protéine centrosomale peu caractérisée. La protéine centrosomale de 76 kDa (Cep76) a été précédemment impliquée dans le maintien d’une duplication unique des centrioles par cycle cellulaire, et dans une interaction avec la kinase cycline-dépendante 2 (CDK2). Cep76 est préférentiellement phosphorylée par le complexe cycline A/CDK2 sur le site unique S83. Cet événement est essentiel pour supprimer l'amplification des centrioles en phase S. J’ai démontré que Cep76 inhibe cette amplification en bloquant la phosphorylation de Plk1 au niveau des centrosomes. D’autre part, Cep76 peut être acétylée au site K279 en phase G2, ce qui régule négativement son activité et sa phosphorylation sur le site S83. Ces études permettent d'améliorer notre compréhension de la biologie des centrosomes et des cils et pourraient conduire au développement de nouvelles applications diagnostiques et thérapeutiques.

Laisser s'imposer l'être : appartenance et métaphysique des transcendantaux dans Vérité et méthode de H.-G. Gadamer.

L’herméneutique de Gadamer s’inscrit-elle dans la foulée de la critique heideggérienne de la métaphysique ? Devrait-on, par surcroit, la considérer comme une forme de nihilisme, où l’être serait réduit au langage et partant, à la pluralité des interprétations ? La présente étude vise plutôt à montrer, sous la conduite des indications de Gadamer lui-même, qu’il est impératif de reconnaître à son maître-ouvrage une dimension métaphysique certaine et cruciale et dont la portée consiste précisément à s’opposer aux interprétations nihiliste et nominaliste de notre rapport à l’être. Pour ce faire il sera d’abord établi que le concept d’appartenance (Zugehörigkeit) est le maître-concept de Vérité et méthode, comme l’avait vu Ricoeur, puis comment Gadamer rattache explicitement celui-ci à la métaphysique médiévale des transcendantaux, métaphysique qui demeure visible jusque dans les dernières conclusions de l’ouvrage qui traitent de la métaphysique de la lumière (Lichtmetaphysik). Nous verrons que c’est précisément à la lumière de cette proximité constante avec la métaphysique des transcendantaux qu’il faut comprendre la thèse de Gadamer à l’effet que l’être susceptible d’être compris est langage, de manière à y voir une affirmation soutenue de l’intelligibilité de l’être, comme l’avait d’ailleurs saisi Heidegger lui-même. Notre intention est ainsi de rendre perceptibles les sources et le cadre de cette métaphysique des transcendantaux, qui ont été négligés dans la réception de Gadamer. Nous porterons donc notre regard sur les sources médiévales de sa pensée que Gadamer connaît et commente, soit Thomas d’Aquin et Nicolas de Cues, mais aussi sur des auteurs moins connus de la tradition herméneutique, dont Philippe le Chancelier, auteur indispensable lorsqu’il s’agit de traiter de la métaphysique des transcendantaux à laquelle Gadamer se réfère. Cette enquête nous amènera à démontrer comment l’herméneutique de Gadamer s’inscrit dans la conception traditionnelle de la vérité comme adaequatio rei et intellectus, définition dont nous devons surtout à Thomas de l’avoir léguée à la postérité mais qu’ont aussi reprise les modernes, incluant Kant et Heidegger. C’est ainsi une nouvelle lecture du rapport de Gadamer à son maître Heidegger et à sa critique de la métaphysique qui résultera de cette archéologie des sources métaphysiques du concept d’appartenance ; il sera en effet démontré que l’héritage de Gadamer est à comprendre, de son propre aveu, en continuité et non en rupture avec la métaphysique. Enfin, fidèle à l’esprit herméneutique de l’application, nous éprouverons cette compréhension renouvelée du concept d’appartenance à l’aune d’une discussion de nature plus théologique, de manière à jeter un éclairage nouveau sur la fécondité de l’herméneutique gadamérienne dans le contexte de la théologie moderne. C’est ainsi que le concept de foi, compris habituellement dans le cadre imposé par la métaphysique moderne de la subjectivité qui le réduit à une « croyance » ou à un « choix personnel », sera mis à l’épreuve du tournant ontologique pris par l’herméneutique avec Gadamer et qui incite à dépasser la dichotomie entre le sujet et son objet en pensant le sujet à partir de l’être. C’est une compréhension de la foi comme appartenance, au sens précis que Gadamer donne à ce concept, qui sera ici mise au jour.

Étude du polymorphisme rs3846662 de l’HMGCR dans le cerveau et le système périphérique

Dans cette thèse, l’impact du polymorphisme rs3846662 sur l’épissage alternatif de la 3-hydroxy-3-méthylglutaryl coenzyme A réductase (HMGCR) a été investigué in vivo, chez des patients atteints d’hypercholestérolémie familiale (HF) ou de maladie d’Alzheimer (MA). Le premier manuscrit adresse la problématique de la normalisation de la quantification relative des ARNm par PCR quantitative. Les découvertes présentées dans ce manuscrit nous ont permis de déterminer avec un haut niveau de confiance les gènes de référence à utiliser pour la quantification relative des niveaux d’ARNm de l’HMGCR dans des échantillons de sang (troisième manuscrit) et de tissus cérébraux post-mortem (quatrième manuscrit). Dans le deuxième manuscrit, nous démontrons grâce à l’emploi de trois cohortes de patients distinctes, soit la population canadienne française du Québec et les deux populations nord américaines « Alzheimer’s Disease Cooperative Study (ADCS) » et « Alzheimer’s Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) », que le génotype AA au locus rs3846662 confère à ces porteurs une protection considérable contre la MA. Les femmes porteuses de ce génotype voient leur risque de MA diminuer de près de 50% et l’âge d’apparition de leurs premiers symptômes retarder de 3.6 ans. Les porteurs de l’allèle à risque APOE4 voient pour leur part leurs niveaux de plaques séniles et dégénérescences neurofibrillaires diminuer significativement en présence du génotype AA. Enfin, les individus atteints de déficit cognitif léger et porteurs à la fois de l’allèle APOE4 et du génotype protecteur AA voient leur risque de convertir vers la MA chuter de 76 à 27%. Dans le troisième manuscrit, nous constatons que les individus atteints d’HF et porteurs du génotype AA ont, contrairement au modèle établi chez les gens normaux, des niveaux plus élevés de cholestérol total et de LDL-C avant traitement comparativement aux porteurs de l’allèle G. Le fait que cette association n’est observée que chez les non porteurs de l’APOE4 et que les femmes porteuses du génotype AA présentent à la fois une augmentation des niveaux d’ARNm totaux et une résistance aux traitements par statines, nous indique que ce génotype influencerait non seulement l’épissage alternatif, mais également la transcription de l’HMGCR. Comme une revue exhaustive de la littérature ne révèle aucune étude abondant dans ce sens, nos résultats suggèrent l’existence de joueurs encore inconnus qui viennent influencer la relation entre le génotype AA, l’épissage alternatif et les niveaux d’ARNm de l’HMGCR. Dans le quatrième manuscrit, l’absence d’associations entre le génotype AA et les niveaux d’ARNm Δ13 ou de protéines HMGCR nous suggère fortement que ce polymorphisme est non fonctionnel dans le SNC affecté par la MA. Une étude approfondie de la littérature nous a permis d’étayer cette hypothèse puisque les niveaux de HNRNPA1, la ribonucléoprotéine influencée par l’allèle au locus rs3846662, sont considérablement réduits dans la MA et le vieillissement. Il est donc proposé que les effets protecteurs contre la MA associés au génotype AA soient le résultat d’une action indirecte sur le processus physiopathologique.

La querelle des universaux : analyse comparative de l’Isagôgè et du Commentaire aux Catégories d’Aristote de Porphyre

Le présent article propose une analyse comparative de l’Isagôgè et du Commentaire aux Catégories d’Aristote de Porphyre. Il s’agira de déterminer si le Commentaire aux Catégories d’Aristote permet de jeter quelque lumière sur le questionnaire porphyrien ou de trancher le débat qui a mené à la célèbre querelle des universaux.

Implicating the mechanisms of ADP-ribosylation factor activation in the resistance of invasive breast cancer cells to EGFR tyrosine kinase inhibitors

ADP-ribosylation factor-1 (ARF1) est une petite GTPase principalement connue pour son rôle dans la formation de vésicules au niveau de l’appareil de Golgi. Récemment, dans des cellules de cancer du sein, nous avons démontré qu’ARF1 est aussi un médiateur important de la signalisation du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) contrôlant la prolifération, la migration et l'invasion cellulaire. Cependant, le mécanisme par lequel l’EGFR active la GTPase ainsi que le rôle de cette dernière dans la régulation de la fonction du récepteur demeure inconnue. Dans cette thèse, nous avions comme objectifs de définir le mécanisme d'activation de ARF1 dans les cellules de cancer du sein hautement invasif et démontrer que l’activation de cette isoforme de ARF joue un rôle essentiel dans la résistance de ces cellules aux inhibiteurs de l'EGFR. Nos études démontrent que les protéines d’adaptatrices Grb2 et p66Shc jouent un rôle important dans l'activation de ARF1. Alors que Grb2 favorise le recrutement d’ARF1 à l'EGFR ainsi que l'activation de cette petite GTPase, p66Shc inhibe le recrutement du complexe Grb2-ARF1 au récepteur et donc contribue à limiter l’activation d’ARF1. De plus, nous démontrons que ARF1 favorise la résistance aux inhibiteurs des tyrosines kinases dans les cellules de cancer du sein hautement invasif. En effet, une diminution de l’expression de ARF1 a augmenté la sensibilité descellules aux inhibiteurs de l'EGFR. Nous montrons également que de hauts niveaux de ARF1 contribuent à la résistance des cellules à ces médicaments en améliorant la survie et les signaux prolifératifs à travers ERK1/2, Src et AKT, tout en bloquant les voies apoptotiques (p38MAPK et JNK). Enfin, nous mettons en évidence le rôle de la protéine ARF1 dans l’apoptose en réponse aux traitements des inhibiteurs de l’EGFR. Nos résultats indiquent que la dépletion d’ARF1 promeut la mort cellulaire induite par gefitinib, en augmentant l'expression de facteurs pro-apoptotiques (p66shc, Bax), en altérant le potentiel de la membrane mitochondriale et la libération du cytochrome C. Ensemble, nos résultats délimitent un nouveau mécanisme d'activation de ARF1 dans les cellules du cancer du sein hautement invasif et impliquent l’activité d’ARF1 comme un médiateur important de la résistance aux inhibiteurs EGFR.

Étude sur le rôle de SIGIRR chez les cas pédiatriques dans la maladie de Crohn.

Il est admis que la maladie de Crohn (MC) résulte de facteurs immunologiques, environnementaux et génétiques. SIGIRR, un récepteur anti-inflammatoire, n’a jamais été étudié dans le contexte de la MC, et de nombreuses découvertes à son sujet ont mené plusieurs à s’intéresser quant à son utilité dans l’atténuation de maladies inflammatoires. Récemment, l’IL-37 a été identifié comme ligand d’un complexe formé de SIGIRR-IL-18Rα. SIGIRR et l’IL-37 pourraient alors être des acteurs de la dérégulation de l’inflammation retrouvée chez la MC. Nous les avons étudiés dans le contexte de la MC pédiatrique, afin d’y caractériser leurs effets. Nous avons identifié une diminution de l’expression de SIGIRR sur certains types de cellules immunitaires. De plus, les personnes atteintes de la MC ont des concentrations de protéines altérées, soit SIGIRR soluble, l’IL-37, l’IL-18BP, et l’IL-18, et tendent à revenir à la normale lorsque l’inflammation est contrôlée par médication. De plus, la concentration de l’IL-18 libre suit le même patron. Par analyse de régression linéaire de SIGIRR soluble et l’IL-37, de l’IL-18BP et l’IL-18, ainsi que l’IL-37 et l’IL-18, des tendances divergentes ont été identifiées entre les patients non traités aux contrôles et patients traités. Nos résultats suggèrent que le système IL-37-SIGIRR est compromis chez les patients de la MC. Étant donné que ce système est un facteur crucial dans la régulation négative de l’inflammation, il sera intéressant de déterminer si SIGIRR et l’IL-37 peuvent constituer des cibles thérapeutiques importantes dans l’atténuation et la résolution de l’inflammation chez les patients atteints de la MC.

L’importance de la coopération de TRAF1 et LSP1 en aval du récepteur 4-1BB(CD137) pour la survie des lymphocytes

4-1BB (CD137) est un membre de la superfamille TNFR qui est impliqué dans la transmission des signaux de survie aux lymphocytes. TRAF1 est une protéine adaptatrice qui est recrutée par 4-1BB et autres TNFRs et est caractérisée par une expression très restreinte aux lymphocytes, cellules dendritiques et certaines cellules épithéliales. TRAF1 est nécessaire pour l’expansion et la survie des cellules T mémoire en présence d'agonistes anti-4-1BB in vivo. De plus, TRAF1 est requise en aval de 4-1BB pour activer (phosphoryler) la MAP kinase Erk impliquée dans la régulation de la molécule pro-apoptotique Bim. Suite à l’activation du récepteur 4-1BB, TRAF1 et ERK sont impliqués dans la phosphorylation de Bim et la modulation de son expression. L’activation et la régulation de TRAF1 et Bim ont un rôle important dans la survie des cellules T CD8 mémoires. Dans cette étude, nous avons utilisé une approche protéomique afin de pouvoir identifier de nouveaux partenaires de liaison de TRAF1. Utilisant cette stratégie, nous avons identifié que LSP1 (Leukocyte Specific Protein 1) est recruté dans le complexe de signalisation 4-1BB de manière TRAF1 dépendante. Une caractérisation plus poussée de l’interaction entre TRAF1 et LSP1 a montré que LSP1 lie la région unique N-terminal de TRAF1 de façon indépendante de la région conservée C-terminal. À l’instar des cellules T déficientes en TRAF1, les cellules T déficientes en LSP1 ne sont pas capables d’activer ERK en aval de 4-1BB et par conséquent ne peuvent pas réguler Bim. Ainsi, TRAF1 et LSP1 coopèrent en aval de 4-1BB dans le but d’activer ERK et réguler en aval les niveaux de Bim dans les cellules T CD8. Selon la littérature, le récepteur 4-1BB n’est pas exprimé à la surface des cellules B murines, mais le récepteur 4-1BB favorise la prolifération et la survie des cellules B humaines. Cependant, il est important d'étudier l'expression du récepteur 4-1BB dans les cellules B murines afin de disposer d'un modèle murin et de prédire la réponse clinique à la manipulation de 4-1BB. En utilisant différentes stimulations de cellules B murines primaires, nous avons identifié que le récepteur 4-1BB est exprimé à la surface des cellules B de souris suite à une stimulation avec le LPS (Lipopolysaccharides). Une caractérisation plus poussée a montré que le récepteur 4-1BB est induit dans les cellules B murines d'une manière dépendante de TLR4 (Toll Like Receptor 4). Collectivement, notre travail a démontré que la stimulation avec le LPS induit l’expression du récepteur 4-1BB à la surface des cellules B murines, menant ainsi à l'induction de TRAF1. De plus, TRAF1 et LSP1 coopèrent en aval de 4-1BB pour activer la signalisation de la Map kinase ERK dans les cellules B murines de manière similaire aux cellules T. Les cellules B déficientes en TRAF1 et les cellules B déficientes en LSP1 ne sont pas en mesure d'activer la voie ERK en aval de 4-1BB et montrent un niveau d’expression du récepteur significativement diminué comparé aux cellules B d’une souris WT. Ainsi, TRAF1 et LSP1 sont nécessaires pour une expression maximale du récepteur 4-1BB à la surface cellulaire de cellules B murines et coopèrent en aval de 4-1BB afin d'activer la cascade ERK dans les cellules B murines.

The role of mechanistic target of rapamycin (mTOR) pathway and synaptic protein GABAA-R in cortical GABAergic cell connectivity

Quelque 30 % de la population neuronale du cortex mammalien est composée d’une population très hétérogène d’interneurones GABAergiques. Ces interneurones diffèrent quant à leur morphologie, leur expression génique, leurs propriétés électrophysiologiques et leurs cibles subcellulaires, formant une riche diversité. Après leur naissance dans les éminences ganglioniques, ces cellules migrent vers les différentes couches corticales. Les interneurones GABAergiques corticaux exprimant la parvalbumin (PV), lesquels constituent le sous-type majeur des interneurones GABAergiques, ciblent spécifiquement le soma et les dendrites proximales des neurones principaux et des neurones PV+. Ces interneurones sont nommés cellules à panier (Basket Cells –BCs) en raison de la complexité morphologique de leur axone. La maturation de la connectivité distincte des BCs PV+, caractérisée par une augmentation de la complexité de l’axone et de la densité synaptique, se déroule graduellement chez la souris juvénile. Des travaux précédents ont commencé à élucider les mécanismes contrôlant ce processus de maturation, identifiant des facteurs génétiques, l’activité neuronale ainsi que l’expérience sensorielle. Cette augmentation marquante de la complexité axonale et de la synaptogénèse durant cette phase de maturation suggère la nécessité d’une synthèse de protéines élevée. La voie de signalisation de la cible mécanistique de la rapamycine (Mechanistic Target Of Rapamycin -mTOR) a été impliquée dans le contrôle de plusieurs aspects neurodéveloppementaux en régulant la synthèse de protéines. Des mutations des régulateurs Tsc1 et Tsc2 du complexe mTOR1 causent la sclérose tubéreuse (TSC) chez l’humain. La majorité des patients TSC développent des problèmes neurologiques incluant des crises épileptiques, des retards mentaux et l’autisme. D’études récentes ont investigué le rôle de la dérégulation de la voie de signalisation de mTOR dans les neurones corticaux excitateurs. Toutefois, son rôle dans le développement des interneurones GABAergiques corticaux et la contribution spécifique de ces interneurones GABAergiques altérés dans les manifestations de la maladie demeurent largement inconnus. Ici, nous avons investigué si et comment l’ablation du gène Tsc1 perturbe le développement de la connectivité GABAergique, autant in vitro que in vivo. Pour investiguer le rôle de l’activation de mTORC1 dans le développement d’une BC unique, nous avons délété le gène Tsc1 en transfectant CRE-GFP dirigé par un promoteur spécifique aux BCs dans des cultures organotypiques provenant de souris Tsc1lox. Le knockdown in vitro de Tsc1 a causé une augmentation précoce de la densité des boutons et des embranchements terminaux formés par les BCs mutantes, augmentation renversée par le traitement à la rapamycine. Ces données suggèrent que l’hyperactivation de la voie de signalisation de mTOR affecte le rythme de la maturation des synapses des BCs. Pour investiguer le rôle de mTORC1 dans les interneurones GABAergiques in vivo, nous avons croisé les souris Tsc1lox avec les souris Nkx2.1-Cre et PV-Cre. À P18, les souris Tg(Nkx2.1-Cre);Tsc1flox/flox ont montré une hyperactivation de mTORC1 et une hypertrophie somatique des BCs de même qu’une augmentation de l’expression de PV dans la région périsomatique des neurones pyramidaux. Au contraire, à P45 nous avons découvert une réduction de la densité des punctas périsomatiques PV-gephyrin (un marqueur post-synaptique GABAergique). L’étude de la morphologie des BCs en cultures organotypiques provenant du knock-out conditionnel Nkx2.1-Cre a confirmé l’augmentation initiale du rythme de maturation, lequel s’effondre ensuite aux étapes développementales tardives. De plus, les souris Tg(Nkx2.1Cre);Tsc1flox/flox montrent des déficits dans la mémoire de travail et le comportement social et ce d’une façon dose-dépendante. En somme, ces résultats suggèrent que l’activation contrôlée de mTOR régule le déroulement de la maturation et la maintenance des synapses des BCs. Des dysfonctions de la neurotransmission GABAergique ont été impliquées dans des maladies telles que l’épilepsie et chez certains patients, elles sont associées avec des mutations du récepteur GABAA. De quelle façon ces mutations affectent le processus de maturation des BCs demeuret toutefois inconnu. Pour adresser cette question, nous avons utilisé la stratégie Cre-lox pour déléter le gène GABRA1, codant pour la sous-unité alpha-1 du récepteur GABAA dans une unique BC en culture organotypique. La perte de GABRA1 réduit l’étendue du champ d’innervation des BCs, suggérant que des variations dans les entrées inhibitrices en raison de l’absence de la sous-unité GABAAR α1 peuvent affecter le développement des BCs. La surexpression des sous-unités GABAAR α1 contenant des mutations identifiées chez des patients épileptiques ont montré des effets similaires en termes d’étendue du champ d’innervation des BCs. Pour approfondir, nous avons investigué les effets de ces mutations identifiées chez l’humain dans le développement des épines des neurones pyramidaux, lesquelles sont l’endroit privilégié pour la formation des synapses excitatrices. Somme toute, ces données montrent pour la première fois que différentes mutations de GABRA1 associées à des syndromes épileptiques peuvent affecter les épines dendritiques et la formation des boutons GABAergiques d’une façon mutation-spécifique.

Co-encapsulation of enzymes and antibodies for chemical deactivation of pathogens on paper

Le papier bioactif est obtenu par la modification de substrat du papier avec des biomolécules et des réactifs. Ce type de papier est utilisé dans le développement de nouveaux biocapteurs qui sont portables, jetables et économiques visant à capturer, détecter et dans certains cas, désactiver les agents pathogènes. Généralement les papiers bioactifs sont fabriqués par l’incorporation de biomolécules telles que les enzymes et les anticorps sur la surface du papier. L’immobilisation de ces biomolécules sur les surfaces solides est largement utilisée pour différentes applications de diagnostic comme dans immunocapteurs et immunoessais mais en raison de la nature sensible des enzymes, leur intégration au papier à grande échelle a rencontré plusieurs difficultés surtout dans les conditions industrielles. Pendant ce temps, les microcapsules sont une plate-forme intéressante pour l’immobilisation des enzymes et aussi assez efficace pour permettre à la fonctionnalisation du papier à grande échelle car le papier peut être facilement recouvert avec une couche de telles microcapsules. Dans cette étude, nous avons développé une plate-forme générique utilisant des microcapsules à base d’alginate qui peuvent être appliquées aux procédés usuels de production de papier bioactif et antibactérien avec la capacité de capturer des pathogènes à sa surface et de les désactiver grâce à la production d’un réactif anti-pathogène. La conception de cette plate-forme antibactérienne est basée sur la production constante de peroxyde d’hydrogène en tant qu’agent antibactérien à l’intérieur des microcapsules d’alginate. Cette production de peroxyde d’hydrogène est obtenue par oxydation du glucose catalysée par la glucose oxydase encapsulée à l’intérieur des billes d’alginate. Les différentes étapes de cette étude comprennent le piégeage de la glucose oxydase à l’intérieur des microcapsules d’alginate, l’activation et le renforcement de la surface des microcapsules par ajout d’une couche supplémentaire de chitosan, la vérification de la possibilité d’immobilisation des anticorps (immunoglobulines G humaine comme une modèle d’anticorps) sur la surface des microcapsules et enfin, l’évaluation des propriétés antibactériennes de cette plate-forme vis-à-vis l’Escherichia coli K-12 (E. coli K-12) en tant qu’un représentant des agents pathogènes. Après avoir effectué chaque étape, certaines mesures et observations ont été faites en utilisant diverses méthodes et techniques analytiques telles que la méthode de Bradford pour dosage des protéines, l’électroanalyse d’oxygène, la microscopie optique et confocale à balayage laser (CLSM), la spectrométrie de masse avec désorption laser assistée par matrice- temps de vol (MALDI-TOF-MS), etc. Les essais appropriés ont été effectués pour valider la réussite de modification des microcapsules et pour confirmer à ce fait que la glucose oxydase est toujours active après chaque étape de modification. L’activité enzymatique spécifique de la glucose oxydase après l’encapsulation a été évaluée à 120±30 U/g. Aussi, des efforts ont été faits pour immobiliser la glucose oxydase sur des nanoparticules d’or avec deux tailles différentes de diamètre (10,9 nm et 50 nm) afin d’améliorer l’activité enzymatique et augmenter l’efficacité d’encapsulation. Les résultats obtenus lors de cette étude démontrent les modifications réussies sur les microcapsules d’alginate et aussi une réponse favorable de cette plate-forme antibactérienne concernant la désactivation de E. coli K-12. La concentration efficace de l’activité enzymatique afin de désactivation de cet agent pathogénique modèle a été déterminée à 1.3×10-2 U/ml pour une concentration de 6.7×108 cellules/ml de bactéries. D’autres études sont nécessaires pour évaluer l’efficacité de l’anticorps immobilisé dans la désactivation des agents pathogènes et également intégrer la plate-forme sur le papier et valider l’efficacité du système une fois qu’il est déposé sur papier.

Caractérisation bioinformatique des nouvelles protéines mitochondriales chez les moules d’eau douce (Bivalvia : Unionoida).

Malgré que le contenu des génomes mitochondriaux animaux soit dit bien conservé, des nouveaux gènes mitochondriaux ont été identifiés chez plusieurs espèces, surtout des invertébrés. Par exemple, les bivalves exhibant la double transmission uniparentale de leurs génomes mitochondriaux possèdent des nouveaux gènes spécifiques au sexe (M-ORF dans l’ADN de type M, F-ORF dans l’ADN de type F) qui ont été caractérisés in silico chez trois espèces de l’ordre Mytiloida, une espèce de Veneroida et une espèce de Unionoida par une précédente étude. Même si les séquences varient beaucoup entre ces trois ordres, cette étude à montré que des hélices transmembranaires ainsi que des peptides signaux sont conservés pour toutes les séquences. L’étude a aussi montré que les nouveaux gènes pourraient avoir des rôles dans la signalisation cellulaire, le cycle cellulaire et la réponse immunitaire et qu’ils pourraient être le résultat de l’endogénisation de l’ADN viral. Le projet présenté ici a pour but de mieux caractériser ces nouveaux gènes et leur origine potentielle, en plus d’étudier le H-ORF particulier aux hermaphrodites, en ciblant les espèces des unionidés. Les résultats montrent que les hélices transmembranaires et peptides signaux sont conservés chez les unionidés, les protéines semblent être associées à la membrane et être capables de lier des acides nucléiques et protéines, et les fonctions potentielles sont conservées. Les M-ORFs semblent avoir un rôle dans le transport et des processus cellulaires tels que la signalisation, le cycle cellulaire et la division, et l’organisation du cytosquelette. Les F-ORFs semblent être impliqués dans le trafic et transport cellulaire et la réponse immunitaire. Finalement, les H-ORFs semblent être des glycoprotéines structurales avec des rôles dans la signalisation, le transport et la transcription. Les résultats de ce projet pourraient supporter une origine virale ou mitochondriale pour ces gènes.

Augmentation de l’absorption intestinale à l’aide de promédicaments se liant aux gangliosides GM1

Le but de ce projet est de développer une approche biomimétique pour augmenter l'absorption de molécules actives peu perméables. Cette approche réplique le mécanisme d'internalisation de la toxine du choléra par sa liaison au récepteur GM1 à la surface des cellules intestinales. La technologie proposée est de synthétiser des promédicaments composés d'une molécule active, d'un espaceur et d'un peptide ayant de l'affinité pour le GM1. Les hypothèses de ce projet sont que le peptide faisant partie du promédicament augmentera l'absorption intestinale de médicaments peu perméables et que le complexe sera métabolisé rapidement après son absorption. Des prototypes de promédicaments ont été synthétisés et des essais de stabilité, d'affinité et de perméabilité sur les peptides et les promédicaments ont été développés et réalisés. Les résultats de cette étude ont démontré la possibilité de synthétiser des promédicaments à partir d'un peptide liant le GM1 et d'une molécule thérapeutique ayant une faible biodisponibilité. Les essais de stabilité, d'affinité et de perméabilité ont été optimisés et implémentés avec succès. Les études in vitro initiales ont rapporté des résultats prometteurs concernant les propriétés de liaison du peptide utilisé et d'un des promédicaments préparés. Par contre, les résultats des essais de stabilité ont montré un métabolisme partiel des promédicament dans le plasma ainsi qu'une instabilité des solutions mères. De plus, les essais de perméabilité se sont avérés non concluants. Les prochaines études porteront sur la préparation de nouveaux promédicaments par une approche similaire ainsi que sur l'investigation du mécanisme d'internalisation du peptide.

Improving the use of G-CSF during chemotherapy using physiological mathematical modelling : a quantitative systems pharmacology approach

La diminution des doses administrées ou même la cessation complète d'un traitement chimiothérapeutique est souvent la conséquence de la réduction du nombre de neutrophiles, qui sont les globules blancs les plus fréquents dans le sang. Cette réduction dans le nombre absolu des neutrophiles, aussi connue sous le nom de myélosuppression, est précipitée par les effets létaux non spécifiques des médicaments anti-cancéreux, qui, parallèlement à leur effet thérapeutique, produisent aussi des effets toxiques sur les cellules saines. Dans le but d'atténuer cet impact myélosuppresseur, on administre aux patients un facteur de stimulation des colonies de granulocytes recombinant humain (rhG-CSF), une forme exogène du G-CSF, l'hormone responsable de la stimulation de la production des neutrophiles et de leurs libération dans la circulation sanguine. Bien que les bienfaits d'un traitement prophylactique avec le G-CSF pendant la chimiothérapie soient bien établis, les protocoles d'administration demeurent mal définis et sont fréquemment déterminés ad libitum par les cliniciens. Avec l'optique d'améliorer le dosage thérapeutique et rationaliser l'utilisation du rhG-CSF pendant le traitement chimiothérapeutique, nous avons développé un modèle physiologique du processus de granulopoïèse, qui incorpore les connaissances actuelles de pointe relatives à la production des neutrophiles des cellules souches hématopoïétiques dans la moelle osseuse. À ce modèle physiologique, nous avons intégré des modèles pharmacocinétiques/pharmacodynamiques (PK/PD) de deux médicaments: le PM00104 (Zalypsis®), un médicament anti-cancéreux, et le rhG-CSF (filgrastim). En se servant des principes fondamentaux sous-jacents à la physiologie, nous avons estimé les paramètres de manière exhaustive sans devoir recourir à l'ajustement des données, ce qui nous a permis de prédire des données cliniques provenant de 172 patients soumis au protocol CHOP14 (6 cycles de chimiothérapie avec une période de 14 jours où l'administration du rhG-CSF se fait du jour 4 au jour 13 post-chimiothérapie). En utilisant ce modèle physio-PK/PD, nous avons démontré que le nombre d'administrations du rhG-CSF pourrait être réduit de dix (pratique actuelle) à quatre ou même trois administrations, à condition de retarder le début du traitement prophylactique par le rhG-CSF. Dans un souci d'applicabilité clinique de notre approche de modélisation, nous avons investigué l'impact de la variabilité PK présente dans une population de patients, sur les prédictions du modèle, en intégrant des modèles PK de population (Pop-PK) des deux médicaments. En considérant des cohortes de 500 patients in silico pour chacun des cinq scénarios de variabilité plausibles et en utilisant trois marqueurs cliniques, soient le temps au nadir des neutrophiles, la valeur du nadir, ainsi que l'aire sous la courbe concentration-effet, nous avons établi qu'il n'y avait aucune différence significative dans les prédictions du modèle entre le patient-type et la population. Ceci démontre la robustesse de l'approche que nous avons développée et qui s'apparente à une approche de pharmacologie quantitative des systèmes (QSP). Motivés par l'utilisation du rhG-CSF dans le traitement d'autres maladies, comme des pathologies périodiques telles que la neutropénie cyclique, nous avons ensuite soumis l'étude du modèle au contexte des maladies dynamiques. En mettant en évidence la non validité du paradigme de la rétroaction des cytokines pour l'administration exogène des mimétiques du G-CSF, nous avons développé un modèle physiologique PK/PD novateur comprenant les concentrations libres et liées du G-CSF. Ce nouveau modèle PK a aussi nécessité des changements dans le modèle PD puisqu’il nous a permis de retracer les concentrations du G-CSF lié aux neutrophiles. Nous avons démontré que l'hypothèse sous-jacente de l'équilibre entre la concentration libre et liée, selon la loi d'action de masse, n'est plus valide pour le G-CSF aux concentrations endogènes et mènerait en fait à la surestimation de la clairance rénale du médicament. En procédant ainsi, nous avons réussi à reproduire des données cliniques obtenues dans diverses conditions (l'administration exogène du G-CSF, l'administration du PM00104, CHOP14). Nous avons aussi fourni une explication logique des mécanismes responsables de la réponse physiologique aux deux médicaments. Finalement, afin de mettre en exergue l’approche intégrative en pharmacologie adoptée dans cette thèse, nous avons démontré sa valeur inestimable pour la mise en lumière et la reconstruction des systèmes vivants complexes, en faisant le parallèle avec d’autres disciplines scientifiques telles que la paléontologie et la forensique, où une approche semblable a largement fait ses preuves. Nous avons aussi discuté du potentiel de la pharmacologie quantitative des systèmes appliquées au développement du médicament et à la médecine translationnelle, en se servant du modèle physio-PK/PD que nous avons mis au point.

Mécanismes par lesquels le VEGF induit la translocation de la P-sélectine et l'adhésion des neutrophiles aux cellules endothéliales

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Effets de la surexpression de l'oncogène ErbB2 sur la fonction du récepteur des estrogènes dans une lignée d'un carcinome mammaire humain

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Dimérisation du récepteur de chimiokine CXCR4

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.