790 resultados para signalisation cellulaire
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Les rcepteurs coupls aux protines G (RCPGs) reprsentent la plus grande famille de cibles thrapeutiques pour le traitement dune panoplie de pathologies humaines. Bien que plusieurs dcennies de recherche aient permis de faonner nos connaissances sur ces protines membranaires, notre comprhension des dterminants molculaires de leur activit signaltique reste encore limite. De ces domaines de recherche, une avance rcente a mis jour un nouveau phnomne, appel slectivit fonctionnelle des ligands, qui a boulevers les paradigmes dcrivant leu fonctionnement de ces rcepteurs. Ce concept mane dobservations montrant que lactivit pharmacologique de certains ligands nest pas ncessairement conserve sur tout le rpertoire signaltiques connu du rcepteur et peu se restreindre l'activation slective dun sous-groupe de voies de signalisation.Ce nouveau modle pharmacologique de l'activation des RCPG ouvre de nouvelles possibilits pour la dcouverte de mdicaments plus efficace et sr, ciblant les RCPGs. En effet, il permet la conception de molcules modulant spcifiquement les voies signaltiques dintrt thrapeutique, sans engager les autres voies qui pourraient mener des effets secondaires indsirables ou de la tolrance. Cette thse dcrit l'utilisation d'une nouvelle approche sans marquage, base sur la mesure du changement l'impdance cellulaire. Par la mesure des changements cellulaires, comme la morphologie, ladhsion et/ou la redistribution des macromolcules, cette approche permet de mesurer de faon simultane l'activit de plusieurs voies de signalisation impliqus dans ces rponses. Utilisant le rcepteur 2-adrnergique (2AR) comme modle, nous avons dmontr que les variations dans limpdance cellulaire taient directement lies lactivation de multiples voies de signalisation suite la stimulation du rcepteur par son ligand. Lagoniste type du 2AR, lisoprotrnol, sest avr induire une rponse dimpdance dose-dpendante constitue, dans le temps, de plusieurs caractristiques distinctes pouvant tre bloques de faon comptitive par lantagoniste ICI118,551 Par lutilisation dinhibiteurs slectifs, nous avons t en mesure de dterminer la contribution de plusieurs voies signaltiques canoniques, comme les voies dpendantes de Gs et Gi, la production dAMPc et lactivation de ERK1/2, sur ces changements. De plus, la dissection de la rponse dimpdance a permis didentifier une nouvelle voie de mobilisation du Ca2+ contribuant la rponse globale des changements initis par la stimulation du 2AR. Dans une autre tude, nous avons rapport que la rponse calcique induite par le 2AR serait attribuable une transactivation Gs-dpendant du rcepteur purinergique P2Y11, lui-mme coupl la protine Gq. La mesure dimpdance permettant de distinguer et de dcrire une pliade dactivits signaltiques, nous avons mis lhypothse que des ligands arborant des profils signaltiques diffrents gnreraient des rponses dimpdance distinctes. Le criblage dune librairie de ligands spcifiques au 2AR a rvl une grande varit de signatures dimpdance. Grce au dveloppement dune approche computationnelle innovatrice, nous avons t en mesure de regrouper ces signatures en cinq classes de composs, un regroupement qui sest avr hautement corrl avec le profil signaltique des diffrents ligands. Nous avons ensuite combin le criblage de composs par impdance avec lutilisation dinhibiteurs slectifs de voies signaltiques afin daugmenter la rsolution du regroupement. En valuant limpact dune voie signaltique donne sur la signature dimpdance, nous avons t en mesure de rvler une plus grande varit de textures parmi les ligands. De plus, cette mthode sest avre efficace pour prdire le profil signaltique dune librairie de composs non caractriss, ciblant le 2AR. Ces travaux ont men llaboration dune mthode permettant dexprimer visuellement la slectivit fonctionnelle de ligands et ont rvl de nouvelles classes de composs pour ce rcepteur. Ces nouvelles classes de composs ont ensuite t testes sur des cardiomyocytes humains, confirmant que les composs regroups dans diffrentes classes produisent des effets distincts sur la contractilit de ces cellules. Globalement, ces travaux dmontrent la pertinence de lutilisation de limpdance cellulaire pour une valuation prcise des diffrences fonctionnelles parmi les composs ciblant les RCPGs. En fournissant une reprsentation pluridimensionnelle de la signalisation manant des RCPGs laide dun seul essai ne requrant pas de marquage, les signatures dimpdance reprsentent une stratgie simple et innovante pour lvaluation de la fonctionnalit slective des ligands. Cette mthode pourrait tre dune grande utilit dans le processus de dcouverte de nouveaux mdicaments.
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Le CD40 est une glycoprotine transmembranaire de type I, appartenant la famille des TNFRs, exprime la surface des cellules immunitaires, hmatopotiques, vasculaires, pithliales, et dautres types de cellules, y compris les cellules tumorales. Le CD40 ne possdant pas de domaine kinase, pour induire un signal il interagit directement ou indirectement avec des protines adaptatrices telles que les TRAFs et les JAKs. Linteraction du CD40 avec son principal ligand, le CD154, joue un rle primordial dans la rgulation de la rponse immunitaire et le maintien de lhomostasie. Lactivation du CD40 la surface des cellules B augmente leur capacit de prsentation dantigne, en plus dinduire la prolifration, la commutation isotypique et lapoptose. Les patients souffrant de mutations au niveau du gne codant pour le CD40 ou de son ligand sont immunosupprims et sensibles des infections opportunistes. Des tudes ont montr que le CD40 comme dautres membres de la famille des TNFRs est capable de former des homodimres. Plus rcemment, on a montr que la formation du CD40 homodimre est le rsultat de son engagement sur les cellules B. En plus, cette homodimrisation du CD40 est importante pour la phosphorylation de lAkt. Linteraction CD40/CD154 peut avoir un rle direct dans limmunothrapie par linduction de lapoptose de certaines cellules cancreuses ou un rle indirect en activant les cellules prsentatrices dantignes (CPA) afin d'augmenter lefficacit de lactivation des cellules T cytotoxiques. Nos rsultats montrent que linduction de la mort cellulaire par le CD40 requiert la permabilisation du lysosome, la libration de la cathepsine B, la prsence de ROS et une interaction avec le TRAF6, cette mort cellulaire programme est plus importante en prsence de la forme monomrique du CD40, mut au niveau de la cystine 238. Par ailleurs, lhomodimrisation du CD40 requerrait sa translocation vers les radeaux lipidiques et ncessiterait la prsence des ROS. Cette homodimrisation du CD40 semble tre importante pour lactivation des cellules B par le biais de linduction de lexpression du CD23, CD69 et CD80. De plus, nos rsultats montrent pour la premire fois une implication du CD40 homodimre dans linduction du CD23 par le biais du TLR4. Nos rsultats soulignent limportance du CD40 homodimre dans certaines voies de signalisation. Ainsi, ils mettent en vidence le rle de la Cys-238 dans la coopration entre des rcepteurs de la rponse immunitaire inne et adaptative. Toutes ces donnes permettraient une meilleure comprhension de certaines voies de signalisation impliques dans plusieurs maladies auto-immunes et faisant objet de plusieurs essais thrapeutiques.
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La rponse cellulaire aux ultra-violets (UV), ou rponse UV, est une rponse complexe et spcialise dans ladaptation et la tolrance des dommages aux UV. Celle-ci est initie par un grand nombre dvnements molculaires et de signalisation nuclaire mais aussi au niveau de la membrane plasmique ou du cytoplasme. Limportance et linfluence exactes de ces vnements sur la rparation par excision de nuclotides (NER) des dommages UV lADN sont encore mal comprises et doivent encore tre mthodiquement dmontres. Dans cette thse, grce lutilisation dune mthode sensible danalyse de la rparation NER base sur la cytomtrie en flux, il est montr, dans un premier temps, que lactivit des voies MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinases), qui sont des voies de signalisation de stress UV dorigine cytoplsamique, ne participent pas lefficacit de rparation NER des dommages UV dans les cellules humaines. En effet, labrogation de la signalisation MAPK, par inhibition pharmacologique, par utilisation de mutants dominant-ngatifs ou par inhibition de leur expression endogne, ne rvlent aucun changement de la cintique de rparation des dommages UV par excision de nuclotides. Cependant, lutilisation de cette mme mthode de rparation, mais cette fois, applique pour ltude de rparation NER en fonction du cycle cellulaire, a permis de mettre en vidence la ncessit fonctionnelle de lADN polymrase translsionnelle eta (Pol ) dans la rparation NER des dommages UV, uniquement en phase S. Cette observation fut initialement caractrise dans les cellules de patients affects du syndrome variant de xrodermie pigmentaire (XP-V) puis, confirme ensuite par linhibition de lexpression de Pol endogne ou par la complmentation avec des mutants non-fonctionnels dans les cellules XP-V. Ces rsultats indiquent que, contrairement la rponse UV MAPK cytoplasmique, les vnements nuclaires comme la synthse translsionnelle, peuvent influencer lefficacit de rparation NER en phase S. Plus particulirement, ces donnes tablissent un lien possible entre la rparation NER en phase S et les niveaux de stress rplicatifs, rvl ici par la dficience fonctionnelle Pol ou ATR. Les observations, prsentes dans cette thse, renforcent un rle du point de contrle S aux UV sur lefficacit de la rparation NER et suggrent que linhibition NER, observe en phase S dans les cellules XP-V, est module par le stress rplicatif. Un tel moyen de contrle pourrait avoir une action plutt protectrice pendant cette phase critique du cycle cellulaire. Mots cls: UV, translsionnelle, eta, MAPK, NER, CPD, cytomtrie, phase-S, tolrance.
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La vasculopathie du greffon est une pathologie caractrise par un rtrcissement progressif et oblitrant des vaisseaux sanguins menant une ischmie et une perte de fonction du greffon. Le rtrcissement vasculaire est d une accumulation de matrice extracellulaire (MEC) et de cellules mononucles positives pour lactine musculaire lisse alpha (alphaSMA) dont les cellules souches msenchymateuses, le tout formant une nointima oblitrante. Cette pathologie est la cause principale de la perte des greffons rnaux et cardiaques long terme. Le rejet vasculaire aigu est un prdicteur de la vasculopathie du greffon. Lquipe du Dr Hbert a dmontr que lapoptose endothliale, qui joue un rle important dans le dveloppement du rejet vasculaire, initie la libration de LG3, un fragment du protoglycan perlcan. Les taux sanguins et urinaires de LG3 sont augments chez les receveurs dallogreffe rnale avec rejet vasculaire et vasculopathie du greffon. Les rsultats obtenus en laboratoire durant ma matrise ont permis de mieux caractriser limpact du LG3 sur un type cellulaire important participant la formation de nointima : les cellules souches msenchymateuses. Mes travaux ont dmontr que le LG3 induit la fois la migration horizontale des MSC et la transmigration des MSC. Cette migration est dpendante de la voie de signalisation dERK1/2, prcdemment identifie comme voie centrale dans la formation de nointima. De plus, nos rsultats dmontrent que la kinase Src est active en amont de lactivation de la voie MAPK. La migration horizontale et la transmigration induites par le LG3 sont aussi dpendantes des intgrines alpha2beta1, ainsi que lactivation de la voie MAPK. Dans un modle de transplantation murin, nous avons galement dmontr que linjection srique de LG3 recombinant favorise laccumulation de cellules positives pour alphaSMA dans la nointima. En outre, lorsque le receveur est dficient pour lintgrine alpha2, mais que le greffon est sauvage, la formation de nointima induite par linjection de LG3 est diminue dans le greffon suggrant que les cellules du receveur jouent un rle important dans la formation de la nointima. Enfin, nous avons dmontr que linjection de LG3 augmente aussi le nombre de cellules positives pour la forme phosphoryle dERK1/2 (p-ERK1/2) dans la nointima du greffon et que cette accumulation est dpendante de la prsence des intgrines 2 1 chez les cellules du receveur.Lorsque le receveur est sauvage, il y a une augmentation du nombre de cellules positives pour p-ERK1/2. Linvestigation de ces mcanismes dans le remodelage vasculaire expose de nouvelles opportunits pour inhiber la rponse cellulaire qui mne au remodelage inadapt lors dun dommage vasculaire chronique et ainsi prolonger la survie du greffon.
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Le circovirus porcin de type 2 (PCV2) est un pathogne majeur pour lindustrie porcine et est associ une longue liste de maladies associes au circovirus porcin (MACVP). Les premires tentatives pour reproduire ces maladies ont montr que le virus doit tre combin dautres agents pathognes du porc ou diffrents stimulants du systme immunitaire. De ces agents, le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP) est celui qui est le plus souvent co-isol avec le PCV dans les fermes. Une grande partie des efforts faits pour tudier les interactions entre ces deux virus ont t mens in vivo. Les interactions in vitro ont jusqu maintenant t peu tudies du fait quil nexiste pas de modle cellulaire permettant la rplication efficace des deux virus. Lobjectif de ce projet tait donc de dvelopper un modle cellulaire propice la rplication des deux virus et dtudier leur interaction en co-infection. Une ligne cellulaire provenant de la trache dun porcelet nouveau-n (NPTr), permissive au PCV, a t gntiquement modifie pour exprimer la protine CD163, un rcepteur majeur du VSRRP. Ce projet a montr que cette nouvelle ligne cellulaire (NPTr-CD163) est permissive au VSRRP ainsi qu plusieurs gnotypes de PCV (PCV1, PCV2a, PCV2b et PCV1/2a). De plus, les rsultats obtenus lors dinfections mixtes suggrent que la rplication du VSRRP et du PCV conditionne de faon gnotype-dpendante celle du PCV puisque la rplication du PCV1 est inhibe en prsence de VSRRP, alors que celle du PCV2b est significativement augmente dans les mmes conditions. Ni la mortalit cellulaire, ni la rponse cellulaire en cytokines na permis dexpliquer ces rsultats. La modulation de la rplication du PCV par le VSRRP serait donc lie un mcanisme spcifique qui demeure inconnu. De plus, cet effet varierait en fonction du gnotype de PCV.
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La leucmie mylode aige (LMA) est la forme de leucmie la plus frquente chez ladulte au Canada. Bien que de nombreux rarrangements chromosomiques rcurrents aient t identifis chez les patients LMA, prs de la moiti des cas prsentent un caryotype normal (LMA-CN). Ltude de la LMA-CN in vitro est rendue difficile par le fait que la survie des cellules primaires de patients est dfectueuse sur le long terme et que les lignes cellulaires leucmiques ont un caryotype hautement anormal. En 2009, Munker et son quipe ont tabli une nouvelle ligne cellulaire, CG-SH, ayant la particularit davoir un caryotype normal. Lobjectif principal de ce projet dtude est de caractriser plus en dtail ce nouveau modle dtude. Nous avons identifi lensemble des variants gntiques prsents dans CG-SH grce au squenage du gnome entier. Les variants susceptibles de participer la leucmognse ont t isols, tels que des insertions dtectes dans EZH2 et GATA2, et de nombreux variants faux-sens dtects dans des gnes pertinents pour la LMA. Nous avons montr que les cellules CG-SH sont sensibles leffet prolifratif dune combinaison de cytokines, qui agissent sur le comportement des cellules en modifiant lexpression des gnes associs la rgulation de la prolifration, de lapoptose et de la diffrentiation. De plus, les cytokines diminuent le taux de ncrose des cellules en culture sur le court terme. La prsente tude a permis dapprofondir notre connaissance sur les caractristiques molculaires de la ligne cellulaire CG-SH, un nouveau modle dtude in vitro de la LMA-CN.
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En lien avec laugmentation constante de lobsit, de plus en plus de personnes sont atteintes de rsistance linsuline ou de diabte de type 2. Ce projet doctoral sest surtout intress lune des consquences majeures des pathologies cardiomtaboliques, soit la dyslipidmie diabtique. cet gard, les gens prsentant une rsistance linsuline ou un diabte de type 2 sont plus risque de dvelopper des perturbations lipidiques caractrises essentiellement par des taux levs de triglycrides et de LDL-cholestrol ainsi que de concentrations restreintes en HDL-cholestrol dans la circulation. Les risques de maladies cardiovasculaires sont ainsi plus levs chez ces patients. Classiquement, trois organes sont connus pour dvelopper linsulino-rsistance : le muscle, le tissu adipeux et le foie. Nanmoins, certaines vidences scientifiques commencent galement pointer du doigt lintestin, un organe critique dans la rgulation du mtabolisme des lipides postprandiaux, et qui pourrait, consquemment, avoir un impact important dans lapparition de la dyslipidmie diabtique. De faon trs intressante, des peptides produits par lintestin, notamment le GLP-1 (glucagon-like peptide-1), ont dj dmontr leur potentiel thrapeutique quant lamlioration du statut diabtique et leur rle dans le mtabolisme intestinal lipoprotinique. Une autre vidence est apporte par la chirurgie bariatrique qui a un effet positif, durable et radical sur la perte pondrale, le contrle mtabolique et la rduction des comorbidits du diabte de type 2, suite la drivation bilio-intestinale. Les objectifs centraux du prsent programme scientifique consistent donc dterminer le rle de lintestin dans (i) lhomostasie lipidique/lipoprotinique en rponse des concentrations leves de glucose ( linstar du diabte) et des peptides gastro-intestinaux tels que le PYY (peptide YY); (ii) la coordination du mtabolisme en disposant de lAMPK (AMP-activated protein kinase) comme senseur incontournable permettant lajustement prcis des besoins et disponibilits nergtiques cellulaires; et (iii) lajustement de sa capacit dabsorption des graisses alimentaires en fonction du gain ou de la perte de sa sensibilit linsuline dmontre dans les spcimens intestinaux humains prlevs durant la chirurgie bariatrique. Dans le but de confirmer le rle de lintestin dans la dyslipidmie diabtique, nous avons tout dabord utilis le modle cellulaire intestinal Caco-2/15. Ces cellules ont permis de dmontrer quen prsence de hautes concentrations de glucose en basolatral, telle quen condition diabtique, lintestin absorbe davantage de cholestrol provenant de la lumire intestinale par lintermdiaire du transporteur NPC1L1 (Niemann Pick C1-like 1). Lutilisation de lezetimibe, un inhibiteur du NPC1L1, a permis de contrecarrer cette augmentation de lexpression de NPC1L1 tout comme llvation de labsorption du cholestrol, prouvant ainsi que le NPC1L1 est bel et bien responsable de cet effet. Dautre part, des travaux antrieurs avaient identifi certains indices quant un rle potentiel du peptide intestinal PYY au niveau du mtabolisme des lipides intestinaux. Toutefois, aucune tude navait encore trait cet aspect systmatiquement. Pour tablir dfinitivement laptitude du PYY moduler le transport et le mtabolisme lipidique dans lintestin, nous avons utilis les cellules Caco-2/15. Notre tude a permis de constater que le PYY incub du ct apical est capable de rduire significativement labsorption du cholestrol et le transporteur NPC1L1. Puisque le rle de l'AMPK dans l'intestin demeure inexplor, il est important non seulement de dfinir sa structure molculaire, sa rgulation et sa fonction dans le mtabolisme des lipides, mais aussi d'examiner l'impact de linsulino-rsistance et du diabte de type 2 (DT2) sur son statut et son mode daction gastro-intestinal. En employant les cellules Caco-2/15, nous avons t capables de montrer (i) la prsence de toutes les sous-units AMPK (1/2/1/2/1/2/3) avec une diffrence marque dans leur abondance et une prdominance de lAMPK1 et la prvalence de lhtrotrimre 1/2/1; (ii) lactivation de lAMPK par la metformine et lAICAR, rsultant ainsi en une phosphorylation accrue de lenzyme actylCoA carboxylase (ACC) et sans influence sur l'HMG-CoA rductase; (iii) la modulation ngative de lAMPK par le compos C et des concentrations de glucose leves avec des rpercussions sur la phosphorylation de lACC. Dautre part, ladministration de metformine au Psammomys obesus, un modle animal de diabte et de syndrome mtabolique, a conduit (i) une rgulation positive de lAMPK intestinale (phosphorylation de lAMPK-Thr172); (ii) la rduction de l'activit ACC; (iii) laugmentation de lexpression gnique et protique de CPT1, supportant une stimulation de la -oxydation; (iv) une tendance la hausse de la sensibilit l'insuline reprsente par linduction de la phosphorylation d'Akt et linactivation de la phosphorylation de p38; et (v) labaissement de la formation des chylomicrons ce qui conduit la diminution de la dyslipidmie diabtique. Ces donnes suggrent que l'AMPK remplit des fonctions cls dans les processus mtaboliques de l'intestin grle. La preuve flagrante de limplication de lintestin dans les vnements cardiomtaboliques a t obtenue par lexamen des spcimens intestinaux obtenus de sujets obses, suite une chirurgie bariatrique. Lexploration intestinale nous a permis de constater chez ceux avec un indice HOMA lev (marqueur dinsulinorsistance) (i) des dfauts de signalisation de l'insuline comme en tmoigne la phosphorylation rduite d'Akt et la phosphorylation leve de p38 MAPK; (ii) la prsence du stress oxydatif et de marqueurs de l'inflammation; (iii) la stimulation de la lipogense et de la production des lipoprotines riches en triglycrides avec limplication des protines cls FABP, MTP et apo B-48. En conclusion, l'intestin grle peut tre class comme un tissu insulino-sensible et rpondant plusieurs stimuli nutritionnels et hormonaux. Son drglement peut tre dclench par le stress oxydatif et l'inflammation, ce qui conduit l'amplification de la lipogense et la synthse des lipoprotines, contribuant ainsi la dyslipidmie athrogne chez les patients atteints du syndrome mtabolique et de diabte de type 2.
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Le rcepteur V2 (V2R) de la vasopressine est un rcepteur coupl aux protines G (RCPG), jouant un rle fondamental dans le maintien de lhomostasie hydrosodique. linstar de nombreux RCPGs, il est capable dinteragir avec plusieurs types de protines G htrotrimriques et possde des voies de signalisation peu explores aux mcanismes mal compris. Ces voies non canoniques font lobjet des travaux exposs dans ce mmoire. Il sagit dexplorer les caractristiques et mcanismes de la signalisation de V2R via G12, et de la voie dactivation dERK 1/2 par transactivation du rcepteur de linsulin-like growth factor 1, IGF1R. Par des tudes de transfert dnergie de rsonance de bioluminescence (BRET), nous exposons la capacit de V2R interagir avec la sous-unit G12 ainsi que la modulation de la conformation de lhtrotrimre G12 par lagoniste de V2R, larginine-vasopressine. Ces travaux dvoilent galement la modulation de linteraction entre G12 et son effecteur classique RhoA, suggrant un engagement de RhoA, ainsi que la potentialisation via G12 de la production dAMP cyclique. laide de diverses mthodes dinhibition slective, nos rsultats prcisent les mcanismes de la transactivation. Ils supportent notamment le rle initiateur de lactivation de Src par V2R et labsence dimplication des ligands connus dIGF1R dans la transactivation. La mtalloprotase MMP 3 apparat par ailleurs comme un bon candidat pour rguler la transactivation. Ce projet met en lumire des modes de signalisation peu explors de V2R, dont limplication physiologique et physiopathologique pourrait savrer significative, au-del dun apport fondamental dans la comprhension de la signalisation des RCPGs.
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Le couplage neurovasculaire (CNV) est un mecanisme dhomeostasie cerebrale regulant le debit sanguin cerebral (CBF) en fonction de lactivite neuronale. La maniere dont il est altere par langiotensine II (Ang II), une hormone synthetisee et relachee dans la circulation systemique ou, alternativement, produite dans le cerveau grace aux astrocytes, demeure a elucider. Ces cellules expriment le recepteur AT1 (rAT1) et participent a lorchestration du CNV en relachant des agents vasoactifs suivant la reponse calcique astrocytaire. Nous avons donc etudie le role de cette reponse dans lalteration du CNV induite par lAng II. Nous avons trouve par fluxmetrie par laser Doppler que lAng II attenue (p<0.05) la reponse du CBF engendree par lactivation des recepteurs metabotropes du glutamate du groupe I (mGluRI) du cortex chez la souris C57BL/6. De maniere similaire, lAng II diminue l'elevation du CBF induite par la stimulation des vibrisses (p<0.05). Sur tranches de cerveaux en aigue, la polarite de la reponse vasculaire induite par un agoniste mGluRI dans les arterioles parenchymateuses a ete significativement renversee par lAng II de la vasodilatation vers la vasoconstriction. En parallele, lAng II a augmente les niveaux de calcium astrocytaire basaux et lamplitude des reponses calciques (p<0.05). Lalteration des reponses vasculaires et calciques maximales a ete prevenue par le candesartan, antagoniste des rAT1. Nos resultats suggerent que lAng II potentialise via les rAT1 la reponse calcique qui atteint un seuil favorisant la vasoconstriction par rapport a la vasodilatation, alterant ainsi laugmentation du CBF en reponse a lactivite neuronale.
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La rgulation de la transcription des gnes par les rcepteurs des estrognes ER et ER joue un rle important dans la croissance cellulaire et dans le dveloppement du cancer du sein. Une augmentation de lexpression de CXCR4 et de son ligand SDF-1/CXCL12 corrle avec un phnotype plus agressif du cancer du sein. Ici, nous dmontrons un mcanisme de boucle de rgulation positive entre la signalisation de CXCR4/SDF-1 et lactivit transcriptionnelle des ERs dans des cellules cancreuses mammaires. Lactivit transcriptionnelle de ER et lexpression de gnes cibles de ER, dont SDF-1 lui-mme, sont augmentes dans la ligne cancreuse mammaire MCF-7 en rponse SDF-1. Ces effets sont bloqus par lanti-estrogne fulvestrant et par la dltion de CXCR4. Par ailleurs, lexpression des gnes et la prolifration des cellules cancreuses mammaires MCF-7 en rponse lestrogne sont altres par linhibition de CXCR4. La signalisation par les facteurs de croissance joue un rle important dans le cancer du sein. La surexpression et la drgulation de la signalisation par le rcepteur activit tyrosine kinase ErbB2 corrlent avec un phnotype tumoral mammaire plus agressif et un moins bon pronostic. Cependant, comment la signalisation de ErbB2 et de CXCR4 sont fonctionnellement relies dans la rgulation de la rponse de ER dans les cellules cancreuses mammaires nest pas connue. Nous dmontrons ici que CXCR4 rgule ngativement lexpression protique de ErbB2 et de son partenaire dinteraction ErbB3 ainsi que la phosphorylation de ErbB2. CXCR4 altre lactivation de la voie PI3-K/Akt par le dimre ErbB2/ErbB3 en rponse hrguline alors quen prsence de SDF-1, les niveaux dactivation sont rcuprs. Nous avons trouv que hrguline- promouvoit la phosphorylation de la srine 339 de CXCR4, un site important pour linternalisation et la signalisation du rcepteur. De plus, le recrutement de ErbB2 CXCR4 est favoris par ErbB3 et hrguline-. Lactivit transcriptionnelle ainsi que lexpression des gnes cibles de ER en rponse lhrguline sont releves avec lexpression de CXCR4 et partiellement rcupres avec laddition de SDF-1. Ces rsultats dmontrent que le recrutement de CXCR4 ErbB2 altre la signalisation mdie par ErbB2/ErbB3 ainsi que lactivit hormonale de ER dans des cellules cancreuses mammaires. Nous travaux ont permis didentifier et de caractriser limpact de la signalisation mdie par des rcepteurs membranaires sur la rponse transcriptionnelle de ER dans des cellules cancreuses mammaires. La signalisation membranaire est un facteur pouvant contribuer la rsistance aux thrapies endocriniennes et donc cibler les rcepteurs impliqus savrerait utile pour amliorer les traitements existants et mettre au point de nouvelles approches.
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Introduction: Notre laboratoire a prcdemment tabli que Hoxa9 acclrait lapparition de leucmie de type B induite par E2A-PBX1. Une analyse par qRT-PCR a montr que les niveaux dARN de Flt3, une cible de Hoxa9, taient 32 fois plus levs dans les leucmies Hoxa9/E2A-PBX1 par rapport que dans les leucmies E2A-PBX1. Il est important de noter que lexpression aberrante de Flt3 est retrouve dans les leucmies ALL de type B et les AML. De plus, lactivation constitutive de Flt3 est associe un faible pronostic. Nous avons pos lhypothse que la maintenance/r-initiation des leucmies de type pr-B induites par E2A-Pbx1 est associe la prsence du rcepteur Flt3. Mthodes et Rsultats: Premirement, nous avons analys par FACS la prsence de Flt3 et mesur lexpression de Flt3 par qRT-PCR des cellules E2A-PBX1 leucmiques pr-B. Nous avons montr que les cellules leucmiques E2A-PBX1 expriment lARNm du gne Flt3. Cependant, le rcepteur ntait dtectable la surface cellulaire que dans des proportions variant de 0.3 28%. Deuximement, nous avons valu le potentiel leucmique des fractions positive et ngative pour Flt3. Toutes deux ont t capables de r-initier la leucmie environ 20 jours aprs transplantation. Des analyses par FACS ont montr quune proportion de cellules leucmiques exprimaient Flt3, incluant mme celles provenant de la fraction Flt3-. Troisimement, une stratgie de perte de fonction de Flt3 par shARN a t mise en uvre afin dexaminer le rle de la voie de signalisation de Flt3 dans les cellules leucmiques E2A-PBX1. Pour ce faire, des cellules primaires leucmiques ont t infectes, soit par le shARN anti-Flt3 soit shARN contrle, et transplantes dans des souris receveuses. Les cellules leucmiques contenant le shARN ont t capables de rgnrer la leucmie. Cependant, une proportion des cellules exprimaient toujours Flt3, ce qui indique que lefficacit des shARn ntait pas suffisante. Conclusion et Perspectives: Nos shARN ne sont pas suffisamment efficaces sur les cellules leucmiques choisies. De ce fait, nous proposons dutiliser des cellules leucmiques moins agressives tout en ralisant le mme set-up exprimental. Des transplantations dans des receveurs KO Flt3-/- seraient galement requises afin de rellement tudier limpact de la voie de signalisation Flt3 dans la r-initiation leucmique.
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L'arthrose est une maladie articulaire dgnrative, avec une pathogense inconnue. Des tudes rcentes suggrent que l'activation du facteur de transcription du rcepteur activateur de la prolifration des peroxysomes (PPAR) gamma est une cible thrapeutique pour ce maladie. Les agonistes du PPAR inhibent l'inflammation et rduisent la synthse des produits de dgradation du cartilage in vitro et in vivo. Cependant, des tudes utilisant des agonistes du PPAR nlucident pas les effets exacts mdis par ce gne complexe. En effet, certains de ces agonistes ont la capacit de rgulariser d'autres voies de signalisation indpendantes de PPAR, ainsi entranant des effets secondaires graves. Afin d'obtenir une efficacit thrapeutique avec potentiellement moins de problmes de scurit, il est donc essentiel d'lucider, in vivo, le rle exact de PPAR dans la physiopathologie OA. Mon projet de thse permettra de dterminer, pour la premire fois, le rle spcifique de PPAR in vivo dans la physiopathologie OA. Les souris utilises pour ltude avaient une dltion conditionnelle du gne PPAR dans le cartilage. Ces dernires ont t gnres en employant le systme LoxP/Cre. Pour tester cette hypothse, j'ai gnr deux types de souris avec une dltion au PPAR, (a) une suppression du gne PPAR spcifiquement dans le cartilage germinale pour l'tude de l'arthrose lie au dveloppement et l'ge et (b) la suppression inductible du gne PPAR spcifiquement dans le cartilage chez la souris adulte pour les tudes OA. Ltude prcdente dans notre laboratoire, utilisant ces souris ayant une dltion au gne PPAR germinales, montre que ces souris prsentent des anomalies du dveloppement du cartilage. J'ai galement explor si ces souris qui prsentent des dfauts prcoces du dveloppement ont toutes les modifications phnotypiques dans le cartilage au cours du vieillissement. Mes rsultats ont montr que les souris adultes, ayant une dltion au gne PPAR, ont prsenter un phnotype de l'arthrose spontane associe une dgradation du cartilage, lhypocellularit, la fibrose synoviale. Cette tude a montr que PPAR est un rgulateur essentiel pour le cartilage, et cest le manque (labsence) de ce dernier qui conduit un phnotype de l'arthrose spontane acclre (American Journal of Pathologie). A partir de ce but de l'tude, on na pas pu vrifier si ces souris prsentaient lOA spontane en raison des dfauts de dveloppement ou la suite de la dltion du gne PPAR. Pour contourner les dfauts de dveloppement, j'ai gnr des souris ayant une dltion du gne PPAR spcifiquement dans le cartilage inductible avec le systme Col2rTACre. Ces souris ont t soumises modle de la chirurgie OA (DMM: dstabilisation du mnisque mdial) et les rsultats rvlent que les souris PPAR KO ont une dgradation acclre du cartilage, une hypocellularit, une fibrose synoviale et une augmentation de l'expression des marqueurs cataboliques et des marqueurs inflammatoire. La perte de PPAR dans le cartilage articulaire est un vnement critique qui initie la dgradation de cartilage dans OA. Les tudes rcentes suggrent que le procs dautophagie, une forme de survie cellulaire programme, est altr pendant lOA et peut contribuer vers une protection diminue des cellules, rsultant la dgradation du cartilage. Jai donc explor le rle de PPAR dans la protection des cellules en dterminant leffet de manque de PPAR dans le cartilage par lexpression de mTOR (rgulateur ngatif principal dautophagie) et les gnes dautophagie durant OA. Mes rsultats ont montr que les souris KO PPAR prsentent galement une augmentation sur l'expression de mTOR et une diminution sur lexpression des marqueurs autophagiques en comparaison avec les chondrocytes articulaires isols des souris contrles OA. J'ai suggr l'hypothse que PPAR contrle la rgulation de la signalisation de mTOR/autophagie, et finalement la mort des chondrocytes et lexpression des facteurs cataboliques et les facteurs inflammatoire. Pour tester cette hypothse, jai fait la transfection des chondrocytes arthrosiques PPAR-KO avec le vecteur dexpression de PPAR pour dterminer si la restauration de l'expression de PPAR peut sauver le phnotype des cellules PPAR-KO OA. J'ai observ que la restauration de l'expression de PPAR dans les cellules PPAR-KO en prsence du vecteur d'expression PPAR, a pu considrablement rgulariser ngativement l'expression de mTOR et mettre en rgle positivement l'expression des gnes autophagiques ainsi que le sauvetage significative de l'expression du collagne de type II et laggrecan et de baisser de manire significative l'expression de marqueurs cataboliques critiques et des marqueurs inflammatoires. Pour prouver que laugmentation de la signalisation de mTOR et la diminution de l'autophagie est responsable du phnotype OA acclre observe dans les souris PPAR KO in vivo, j'ai gnr les souris doubles KO PPAR- mTOR inductible spcifique du cartilage en utilisant le systme Col2 - rtTA -Cre et soumis ces souris DMM modle de l'arthrose. Mes rsultants dmontrent que les souris avec PPAR- mTOR doubles KO ont t significativement protgs contre les OA DMM induites associes une protection significative contre la destruction du cartilage, la perte de protoglycanes et la perte de chondro-cellularit par rapport aux souris tmoins. Considrant que mTOR est un rpresseur majeur de l'autophagie, j'ai trouv que l'expression de deux marqueurs de l'autophagie critiques (ULK1 et LC3B) a t significativement plus leve dans les chondrocytes extraits les souris doubles KO PPAR-mTOR par rapport aux souris tmoins. En plus, les tudes de sauvetage in vitro en utilisant le vecteur d'expression PPAR et les tudes in vivo utilisant les souris doubles KO PPAR- mTOR montrent que PPAR est impliqu dans la rgulation de la protine signalant de mTOR/autophagie dans le cartilage articulaire. Ces rsultats contournent PPAR et sa signalisation en aval de mTOR/autophagie en tant que cibles thrapeutiques potentielles pour le traitement de l'arthrose.
Resumo:
La restriction de croissance intrautrine (RCIU) est associe lapparition de maladies lge adulte et le phnotype de la condition pathologique peut tre diffrent selon le sexe. Notre laboratoire a dvelopp un modle de RCIU chez le rat en administrant une dite faible en sodium lors du dernier tiers de la gestation entranant une rduction de lexpansion volmique maternelle et de la perfusion utroplacentaire. L'activit rnine et la concentration d'aldostrone plasmatique sont augmentes chez la mre et les foetus RCIU. Antrieurement, notre laboratoire a dmontr une augmentation de lexpression gnique et protique rnale de la Na+-K+-ATPase-1 uniquement chez les foetus femelles RCIU. Ainsi, nous mettons lhypothse que la diminution du volume circulant chez la rate gestante entrane une augmentation et une expression diffrentielle, selon le sexe, des lments de la cascade de signalisation du rcepteur des minralocorticodes (MR) dans les reins de foetus RCIU. Lexpression des gnes est ralise par qRT-PCR et celle des protines par immunobuvardage de type Western. Bien que les rsultats dmontrent que la transcription gnique de SGK1, -ENaC et GILZ soit augmente dans les reins de foetus RCIU, lexpression protique de SGK1, pSGK1(Thr 256) et -ENaC est similaire celle des tmoins. La protine GILZ est indtectable. Pour CNKSR3, aucune diffrence de lARNm ou de la protine na t observe entre les deux groupes. Par contre, mme si lexpression gnique du MR nest pas diffrente, lexpression protique est diminue chez les RCIU. Aucun effet du sexe na t observ. En conclusion, laugmentation d'aldostrone plasmatique chez les foetus ayant subi une RCIU stimule la transcription des gnes associs la voie de rabsorption sodique, mais la quantit protique demeure inchange. Ceci suggre quil peut avoir des mcanismes de rgulation post-transcriptionnelle ou une dgradation acclre des protines. Malgr la pertinence du sexe dans le dveloppement de maladies, le sexe ninfluence pas lexpression des composantes de la voie de rtention sodique chez le foetus. Il serait important de suivre cette voie en fonction de lge et de corrler les expressions gnique et protique avec lapparition de maladies.
Resumo:
Lacide -aminobutyrique (GABA) est le principal neurotransmetteur inhibiteur du systme nerveux central et est impliqu dans diverses pathologies incluant lpilepsie, lanxit, la dpression et la dpendance aux drogues. Le GABA agit sur lactivit neuronale par lactivation de deux types de rcepteurs; le canal chlorique pentamrique GABAA et lhtrodimre obligatoire de rcepteurs coupls aux protines G (RCPG) GABAB. Chacun des rcepteurs est responsable de phases distinctes de la rponse cellulaire au GABA. Lors dune stimulation par le GABA, il est essentiel pour la cellule de pouvoir contrler le niveau dactivit des rcepteurs et au besoin, de limiter leur activation par des mcanismes de dsensibilisation et de rgulation ngative. La dsensibilisation ncessite le dcouplage du rcepteur de ses effecteurs, ainsi que sa compartimentation hors de la membrane plasmique dans le but de diminuer la rponse cellulaire lagoniste. Les mcanismes de contrle de lactivit de GABAB semblent anormaux pour un RCPG et sont encore mal molculairement caractriss. Lobjet de cette thse est dtudier la rgulation du rcepteur GABAB et de sa signalisation par la caractrisation de nouvelles protines dinteractions tant impliques dans la dsensibilisation, linternalisation et la dgradation du rcepteur. Une premire tude nous a permis didentifier la protine NSF (N-ethylmaleimide sensitive factor) comme interagissant avec le rcepteur htrodimrique. Nous avons caractris le site dinteraction au niveau du domaine coiled-coil de chacune des deux sous-units de GABAB et constat la dpendance de cette interaction au statut de lactivit ATPasique de NSF. Nous avons observ que cette interaction pouvait tre dissocie par lactivation de GABAB, induisant la phosphorylation du rcepteur par la protine kinase C (PKC) paralllement la dsensibilisation du rcepteur. Lactivation de PKC par le rcepteur est dpendante de linteraction NSF-GABAB, ce qui suggre une boucle de rtroaction entre NSF et PKC. Nous proposons donc un modle o, ltat basal, le rcepteur interagit avec NSF, lui permettant dactiver PKC en rponse la stimulation par un agoniste, et o cette activation permet PKC de phosphoryler le rcepteur, induisant sa dissociation de NSF et sa dsensibilisation. Nous avons par la suite tudi la dgradation et lubiquitination constitutive de GABAB et la rgulation de celles-ci par PKC et lenzyme de dubiquitination USP14 (ubiquitin-specific protease 14). Au niveau basal, le rcepteur est ubiquitin, et prsente une internalisation et une dgradation rapide. Lactivation de PKC augmente lubiquitination la surface cellulaire et linternalisation, et acclre la dgradation du rcepteur. USP14 est en mesure de dubiquitiner le rcepteur suite linternalisation, mais acclre aussi la dgradation par un mcanisme indpendant de son activit enzymatique. Nos rsultats suggrent un mcanisme o lubiquitination promeut linternalisation et o USP14 cible le rcepteur ubiquitin vers un processus de dgradation lysosomale. La troisime tude porte sur la rgulation de la densit de rcepteurs la membrane plasmique par la protine Grb2 (growth factor receptor-bound protein 2). Nous avons dtermin que Grb2 interagit avec GABAB1 au niveau de la squence PEST (riche en proline, glutamate, srine et thronine) du domaine carboxyl-terminal, et que cette interaction module lexpression la surface du rcepteur htrodimrique en diminuant linternalisation constitutive par un mcanisme encore inconnu. Cette inhibition de linternalisation pourrait provenir dune comptition pour le site de liaison de Grb2 GABAB1, ce site tant dans une rgion interagissant avec plusieurs protines impliques dans le trafic du rcepteur, tels le complexe COPI et la sous-unit 2S du rcepteur GABAA (1, 2). En proposant de nouveaux mcanismes molculaires contrlant lactivit et lexpression la membrane du rcepteur GABAB par les protines NSF, PKC, USP14 et Grb2, les tudes prsentes dans cette thse permettent de mieux comprendre les processus dinternalisation et de dgradation, ainsi que du contrle de lactivit de GABAB par la dsensibilisation, ouvrant la porte une meilleure comprhension de la signalisation GABAergique.
Resumo:
Le fer, un mtal de transition, est requis pour la survie de presque tout les organismes vivant cause de son habilit accepter ou donner un lectron et donc catalyser plusieurs ractions biochimique fondamentales. Cependant, la mme proprit permet aussi au fer ionique dacclrer la formation de radicaux libres et donc le fer peut potentiellement avoir des effets nfastes. Consquemment, lhomostasie du fer doit tre troitement rgul, tant au niveau cellulaire que systmique. Notre tude met lemphase sur deux molcules importante pour rgulation du mtabolisme du fer : la lipocaline 2 (Lcn2) et lhepcidine. Lcn2, une protine de phase aigu, est implique dans le transport du fer par les sidrophores. Lcn2 est un candidat potentiel comme transporteur du fer qui pourrait tre responsable de laccumulation excessive du fer non li la transferrine dans le foie des patients atteints dhmochromatose hrditaire (HH). Nous avons gnr des souris double-dficiente HfeLcn2 pour valuer limportance de Lcn2 dans la pathogense de surcharge en fer hpatique dans les souris knock-out Hfe (Hfe -/-). Notre tude rvle que la dltion de Lcn2 dans les souris Hfe-/- ninfluence pas leur accumulation de fer hpatique ou leur rponse une surcharge en fer. Le phnotype des souries HfeLcn2-/- demeure indiscernable de celui des souris Hfe-/-. Nos donnes impliquent que Lcn2 nest pas essentiel pour la livraison du fer aux hpatocytes dans lHH. Lhepcidine, un rgulateur cl du mtabolisme du fer, est un petit peptide antimicrobien produit par le foie et qui rgule labsorption intestinale du fer et son recyclage par les macrophages. Lexpression de lhepcidine est induite par la surcharge en fer et linflammation, tandis que, l'inverse, elle est inhibe par l'anmie et l'hypoxie. Dans certaine situations pathologique, lhepcidine est rgule dans des directions opposes par plus dun rgulateur. Nous avons, en outre, analys comment les diffrents facteurs influencent lexpression de lhepcidine in vivo en utilisant un modle de souris avec un mtabolisme du fer altr. Nous avons examin la rgulation de lhepcidine en prsence de stimuli opposs, ainsi que la contribution des mdiateurs et des voix de signalisation en aval de lexpression de lhepcidine. Nous avons dmontr que l'rythropose, lorsque stimul par lrythropotine, mais pas par lhypoxie, diminue lexpression de lhepcidine dune faon dpendante de la dose, mme en prsence de lipopolysaccharides ou de surcharge de fer alimentaire, qui peuvent agir de manire additive. De plus, lentranement rythropotique inhibe tant la voix inflammatoire que celle de dtection du fer, du moins en partie, par la suppression du signal IL-6/STAT3 et BMP/SMAD4 in vivo. Au total, nos donnes suggrent que le niveau dexpression de lhepcidine en prsence de signaux opposs est dtermin par la force du stimulus individuel plutt que par une hirarchie absolue. Ces dcouvertes sont pertinentes pour le traitement de lanmie des maladies chronique et les dsordres de surcharge en fer.
