Automaattisen nukleiinihappoeristyslaitteen ja reaaliaikaisen PCR-menetelmän soveltuvuus herpes simplex -virusten keskushermostoinfektiodiagnostiikkaan

Keskushermosto- ja neonataali-infektiot ovat herpes simplex -virusten aiheuttamista taudeista vakavimpia. Niihin on olemassa lääkitys, joka on tehokkain, kun se aloitetaan aivan sairauden alkuvaiheessa. Näiden infektioiden diagnostiikassa PCR-menetelmä on herkin. Tämä menetelmä on kuitenkin työläs ja aikaa vievä, joten uudet nopeammat menetelmät ovat tervetulleita. Opinnäytetyö tehtiin HUSLABin virologian osastolle. Työssä testattiin QIAGENIN artus®HSV-1/2 LC PCR-reagenssipakkausta, joka on tehty käytettäväksi Roche diagnosticsin reaaliaikaisella PCR-laitteella LightCyclerillä. Lisäksi työssä testattiin automaattista bioMérieuxin NucliSens easyMAG- nukleiinihappoeristyslaitetta. Referenssinä käytettiin HUSLABin virologian osastolla testaushetkellä käytössä olevia menetelmiä. Reaaliaikaisen PCR-menetelmän herkkyyttä testattiin positiivisilla HSV-1 ja HSV-2 kontrollilaimennussarjoilla. Menetelmän oikeellisuutta testattiin määrittämällä laaduntarkkailu- ja potilasnäytteitä, jotka olivat likvoria. Tuloksia verrattiin QCMD:n antamiin ja perinteisellä ”in house”- PCR-menetelmällä saatuihin referenssituloksiin. Spesifisyyttä testattiin muiden ihmisten herpesvirusten positiivisilla kontrolleilla. Automaattisen nukleiinihappoeristysmenetelmän toimivuutta testattiin HSV-positiivisilla ja -negatiivisilla likvornäytteillä, jotka oli aikaisemmin eristetty fenoli-kloroformiuutolla. Tulokset QIAGENIN artus®HSV-1/2 LC PCR-reagenssipakkauksesta olivat hyviä. Kont-rollilaimennussarjan määrityksessä reaaliaikainen PCR-menetelmä osoittautui perinteistä ”in house”- PCR-menetelmää herkemmäksi. Potilasnäytteiden määrityksessä tulokset olivat yhtenevät. EasyMAG- nukleiinihappoeristysmenetelmällä eristettyjen potilasnäytteiden määrityksistä saadut tulokset olivat myös hyviä. Kun tuloksia verrattiin fenoli-kloroformiuutolla saatuihin tuloksiin, olivat tulokset yhtä näytettä lukuun ottamatta yhtenevät. Molemmat testattavat menetelmät ovat nopeita ja virhelähteiden mahdollisuus on vähäisempi kuin perinteisessä ”in house”-PCR menetelmässä ja fenoli-kloroformiuutolla nukleiinihappoa eristettäessä. Tutkimusten tulokset osoittivat molempien menetelmien soveltuvan hyvin HSV:n eristykseen ja määritykseen likvornäytteistä.

Enterohemorraginen Escherichia coli (EHEC) ja sen osoittaminen PCR-menetelmällä

Summary: Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) and its detection with a PCR method

Switchable lanthanide fluorescence probes in homogenous molecular diagnostics

The number of molecular diagnostic assays has increased tremendously in recent years.Nucleic acid diagnostic assays have been developed, especially for the detection of human pathogenic microbes and genetic markers predisposing to certain diseases. Closed-tube methods are preferred because they are usually faster and easier to perform than heterogenous methods and in addition, target nucleic acids are commonly amplified leading to risk of contamination of the following reactions by the amplification product if the reactions are opened. The present study introduces a new closed-tube switchable complementation probes based PCR assay concept where two non-fluorescent probes form a fluorescent lanthanide chelate complex in the presence of the target DNA. In this dual-probe PCR assay method one oligonucleotide probe carries a non-fluorescent lanthanide chelate and another probe a light absorbing antenna ligand. The fluorescent lanthanide chelate complex is formed only when the non-fluorescent probes are hybridized to adjacent positions into the target DNA bringing the reporter moieties in close proximity. The complex is formed by self-assembled lanthanide chelate complementation where the antenna ligand is coordinated to the lanthanide ion captured in the chelate. The complementation probes based assays with time-resolved fluorescence measurement showed low background signal level and hence, relatively high nucleic acid detection sensitivity (low picomolar target concentration). Different lanthanide chelate structures were explored and a new cyclic seven dentate lanthanide chelate was found suitable for complementation probe method. It was also found to resist relatively high PCR reaction temperatures, which was essential for the PCR assay applications. A seven-dentate chelate with two unoccupied coordination sites must be used instead of a more stable eight- or nine-dentate chelate because the antenna ligand needs to be coordinated to the free coordination sites of the lanthanide ion. The previously used linear seven-dentate lanthanide chelate was found to be unstable in PCR conditions and hence, the new cyclic chelate was needed. The complementation probe PCR assay method showed high signal-to-background ratio up to 300 due to a low background fluorescence level and the results (threshold cycles) in real-time PCR were reached approximately 6 amplification cycles earlier compared to the commonly used FRET-based closed-tube PCR method. The suitability of the complementation probe method for different nucleic acid assay applications was studied. 1) A duplex complementation probe C. trachomatis PCR assay with a simple 10-minute urine sample preparation was developed to study suitability of the method for clinical diagnostics. The performance of the C. trachomatis assay was equal to the commercial C. trachomatis nucleic acid amplification assay containing more complex sample preparation based on DNA extraction. 2) A PCR assay for the detection of HLA-DQA1*05 allele, that is used to predict the risk of type 1 diabetes, was developed to study the performance of the method in genotyping. A simple blood sample preparation was used where the nucleic acids were released from dried blood sample punches using high temperature and alkaline reaction conditions. The complementation probe HLA-DQA1*05 PCR assay showed good genotyping performance correlating 100% with the routinely used heterogenous reference assay. 3) To study the suitability of the complementation probe method for direct measurement of the target organism, e.g., in the culture media, the complementation probes were applied to amplificationfree closed-tube bacteriophage quantification by measuring M13 bacteriophage ssDNA. A low picomolar bacteriophage concentration was detected in a rapid 20- minute assay. The assay provides a quick and reliable alternative to the commonly used and relatively unreliable UV-photometry and time-consuming culture based bacteriophage detection methods and indicates that the method could also be used for direct measurement of other micro-organisms. The complementation probe PCR method has a low background signal level leading to a high signal-to-background ratio and relatively sensitive nucleic acid detection. The method is compatible with simple sample preparation and it was shown to tolerate residues of urine, blood, bacteria and bacterial culture media. The common trend in nucleic acid diagnostics is to create easy-to-use assays suitable for rapid near patient analysis. The complementation probe PCR assays with a brief sample preparation should be relatively easy to automate and hence, would allow the development of highperformance nucleic acid amplification assays with a short overall assay time.

Quantitative Analysis of Novel Prostate Cancer Markers in Tissue

Prostate cancer is a heterogeneous disease affecting an increasing number of men all over the world, but particularly in the countries with the Western lifestyle. The best biomarker assay currently available for the diagnosis of the disease, the measurement of prostate specific antigen (PSA) levels from blood, lacks specificity, and even when combined with invasive tests such as digital rectal exam and prostate tissue biopsies, these methods can both miss cancers, and lead to overdiagnosis and subsequent overtreatment of cancers. Moreover, they cannot provide an accurate prognosis for the disease. Due to the high prevalence of indolent prostate cancers, the majority of men affected by prostate cancer would be able to live without any medical intervention. Their latent prostate tumors would not cause any clinical symptoms during their lifetime, but few are willing to take the risk, as currently there are no methods or biomarkers to reliably differentiate the indolent cancers from the aggressive, lethal cases that really are in need of immediate medical treatment. This doctoral work concentrated on validating 12 novel candidate genes for use as biomarkers for prostate cancer by measuring their mRNA expression levels in prostate tissue and peripheral blood of men with cancer as well as unaffected individuals. The panel of genes included the most prominent markers in the current literature: PCA3 and the fusion gene TMPRSS2-ERG, in addition to BMP-6, FGF-8b, MSMB, PSCA, SPINK1, and TRPM8; and the kallikrein-related peptidase genes 2, 3, 4, and 15. Truly quantitative reverse-transcription PCR assays were developed for each of the genes for the purpose, time-resolved fluorometry was applied in the real-time detection of the amplification products, and the gene expression data were normalized by using artificial internal RNA standards. Cancer-related, statistically significant differences in gene transcript levels were found for TMPRSS2-ERG, PCA3, and in a more modest scale, for KLK15, PSCA, and SPINK1. PCA3 RNA was found in the blood of men with metastatic prostate cancer, but not in localized cases of cancer, suggesting limitations for using this method for early cancer detection in blood. TMPRSS2-ERG mRNA transcripts were found more frequently in cancerous than in benign prostate tissues, but they were present also in 51% of the histologically benign prostate tissues of men with prostate cancer, while being absent in specimens from men without any signs of prostate cancer. PCA3 was shown to be 5.8 times overexpressed in cancerous tissue, but similarly to the fusion gene mRNA, its levels were upregulated also in the histologically benign regions of the tissue if the corresponding prostate was harboring carcinoma. These results indicate a possibility to utilize these molecular assays to assist in prostate cancer risk evaluation especially in men with initially histologically negative biopsies.

Aikaerotteisesti fluoresenssia mittaavan reaaliaikaisen PCR-laitteen kehitys

Kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (engl. polymerase chain reaction, PCR) on osoittautunut käyttäjäystävällisimmäksi menetelmäksi nukleiinihapposekvenssien kvantitoimisessa. Tätä menetelmää voidaan herkistää pienempien DNA-pitoisuuksien havaitsemiseen käyttämällä hyväksi aikaerotteista fluorometriaa (engl. time-resolved fluorometry, TRF) ja luminoivia lantanidileimoja, joiden fluoresenssin pitkän eliniän ansiosta emission mittaus voidaan suorittaa vasta hetki virittävän valopulssin jälkeen, jolloin lyhytikäinen taustasäteily ehtii sammua. Tuloksena saadaan korkea signaali-taustasuhde. Tämän diplomityön tarkoituksena oli rakentaa TRF:än pystyvä reaaliaikainen PCR-laite, sillä tällaista laitetta ei ole markkinoilla tarjolla. Laite rakennettiin kehittämällä lämpökierrätin ja yhdistämällä se valmiiseen TRF:än kykenevään mittapäähän. Mittapään ja lämpökierrättimen hallitsemiseksi kehitettiin myös tietokoneohjelma. Valon tuottamiseksi ja mittaamiseksi haluttiin käyttää edullisia komponentteja, joten työssä käytettiin valmiin mittapään optiikkaa, jossa viritys tapahtuu hohtodiodilla (engl. light-emitting diode, LED) ja lantanidileiman emission mittaus fotodiodilla (engl. photodiode, PD) tai valomonistinputkella (engl. photomultiplier tube, PMT). Myös mittapään suorituskykyä tutkittiin. Työtä varten kehitettiin lämpökierrätin, joka koostui Peltier-elementillä lämmitettävästä PCR-putkitelineestä ja lämpökannesta. Mittalaitteen suorituskyvyn tutkimiseen käytettiin kelaattikomplementaatioon perustuvaa PCR-tuotteen havaitsemismenetelmää. Kelaattikomplementaatio perustuu kahteen erilliseen oligonukleotidimolekyyliin, joista toiseen on sidottu lantanidi-ioni ja toiseen valoa absorboiva ligandirakenne, jotka yhdessä muodostavat fluoresoivan kokonaisuuden. Kehitetyn lämpökierrättimen todettiin olevan tarpeeksi tarkka sekä tehokas ja sen lämmitys- ja jäähdytysnopeuden maksimeiksi saatiin 2,6 °C/sekunti. Detektorina käytetyn PD:n ei todettu olevan tarpeeksi herkkä emission havainnoimiseksi ja se korvattiin laitteessa PMT:llä. Käytetyllä PCR-määrityksellä kynnyssykleiksi (engl. threshold cycle, Ct) sekä kehitetylle että referenssilaitteelle saatiin 28,4 käyttämällä samaa 100 000 kopion DNA:n aloitusmäärää. Työssä osoitettiin, että on mahdollista kehittää edullisia komponentteja käyttävä, TRF:än pystyvä, reaaliaikainen PCR-laite, joka kykenee vastaavaan Ct-arvoon kuin vertailulaite. PD:n herkkyys ei kuitenkaan riittänyt. Tulokset olivat lupaavia, sillä LED- ja PD-teknologiat kehittyvät ja markkinoille on tullut myös muita komponentteja, joiden avulla on tulevaisuudessa mahdollista kehittää vielä herkempi laite.