Ihmisen papilloomavirustyypin (HPV) 16 pitkän säätelyalueen HPV16 E2-proteiinien sitoutumiskohtien (E2BS) metylaatioiden tutkimusmenetelmän pystytys

Ihmisen papilloomavirukset (HPV) on yhdistetty arviolta 28 %:iin virusten aiheuttamista syövistä, joista yksi esiintymispaikka on pään ja kaulan alue. Metylaatio on yksi syövän syntyyn liitetty muutos solujen genomissa. Tämän syventävän työn tutkimuksen aiheena oli metylaatiomuutosten vaikutus E2-proteiinien sitoutumisessa HPV-tyypin 16 genomin onkogeeneina tunnettujen E6- ja E7-geenien alueelle (E2BS). Tarkoituksena oli pystyttää tutkimuslinja, jolla kyseisten sitoutumisalueiden metylaatioasteiden muutokset ja variaatiot voitaisiin havaita HPV-infektoituneissa solulinjoissa. Lähtökohtana käytettiin Chaiwongkot ym. (2012) aiheesta julkaisemaa artikkelia, jonka tulokset pyrittiin toistamaan. Matalan (SiHa) ja korkean (CaSki) asteen HPV-infektoiduista kohdunkaulan levyepiteelisyöpäsolulinjoista eristetty DNA bisulfiittikäsiteltiin, monistettiin PCR:llä ja pyrosekvenoitiin. Saatujen sekvenssien metylaatioasteita verrattiin keskenään sekä aiempiin tutkimuksiin. Tässä syventävien opintojen työssä saatiin pääosin toistettua Chaiwongkotin ym. (2012) saadut tulokset CaSki- ja SiHa-solujen metylaatiosta. CaSki-soluilla E2BS1-alueen metylaatioaste oli keskimäärin 38–42 % (s± 4,1–4,3), E2BS2-alueen 13 % (s± 0,6) ja E2BS3-4alueella 92–99 % (s± 11–42). SiHa-soluilla vastaavat luvut olivat 4-7 %, 2 % ja 5-8 %. CaSki- ja SiHa-soluilla E2BS-alueiden metylaatio oli verrannollinen HPV:n suureen kopiolukuun. Vähäisin merkitys oli E2BS2-alueella, kun taas E2BS1- ja E2BS3-4-alueet olivat vahvemmin metyloituneet. Menetelmässä kohdattuihin ongelmiin kuului E2BS1-alueen pyrosekvenointitulosten jääminen virhemarginaalien ulkopuolelle sekä itse pyrosekvenointimenetelmä.

Carriage of herpes simplex virus and human papillomavirus in oral mucosa is rare in young women: a long-term prospective follow-up

Herpes simplex -virus 1 (HSV-1) ja ihmisen papilloomavirus (HPV) infektoivat suun epiteelisoluja. Useimmissa tapauksissa näiden virusten infektio on kliinisesti oireeton. Suun limakalvojen oireeton HPV-infektio on aikuisilla yleinen, ja valtaosa näistä infektioista ovat ohimeneviä ja vain pieni osa johtaa krooniseen HPV-infektioon. Krooninen HPV-infektio lisää riskiä epiteelisolujen transformoitumiseen kohti syöpäsolua. HPV infektio ei ole yksinään riittävä aiheuttamaan syöpäsolun, vaan siihen tarvitaan myös muita riskitekijöitä.. Muut infektiot, kuten esimerkiksi HSV-1-infektio saattaa olla yksi näistä riskitekijöistä. Tämän syventävän opinnäytetyön tutkimuksen tavoitteena oli selvittää HSV-1-infektion esiintymistä naisten suun limakalvonäytteissä kuuden vuoden seurannassa. Toinen tavoitteemme oli selvittää HSV-1 ja HPV -yhteisinfektion esiintymistä suun epiteelisoluissa, erityisesti naisilla joilla havaittiin suun krooninen HPV-infektio. Tämä tutkimus on osa kuusivuotista seurantatutkimusta (Finnish Family HPV -tutkimus), joka suunniteltiin selvittämään HPV-infektioiden dynamiikkaa ja riskitekijöitä 329 suomalaisperheessä. Suun limakalvoilta otettiin harjausnäyte ennen synnytystä ja kuusi kertaa synnytyksen jälkeen kuuden vuoden aikana. Näytteistä eristettyä DNA:ta oli saatavilla riittävästi HSV-1-analyysiä varten yhteensä 304 naiselta (keski-ikä 25.6 vuotta). Kaikkiaan tutkittavia näytteitä oli 1,873, joista HSV-1:n esiintyminen tutkittiin käyttäen kvantitatiivista PCR:ää. Lisäksi epävarmat PCR-tulokset varmistettiin PCR-tuotteen Southern Blot hybridisaatiolla. HSV-1 tuloksia verrattiin aikaisemmin saatuihin HPV-tuloksiin. Suun limakalvonäytteistä 2.2% oli HSV-1-positiivisia ja 19.6% oli HPV-positiivisia. Yhteensä 11.8%:lla äideistä suunäyte oli HSV-1-DNA -positiivinen ainakin kerran seurannan aikana. HSV-1 ja HPV -yhteisinfektio löydettiin vain neljältä äidiltä. Suurin osa äideistä, jotka olivat HSV-1-positiivisia ennen syntymää, pysyivät HSV-1-positiivisina myös synnytyksen jälkeen. Kolmella naisella todettiin persistentti HPV-16 infektio ja kahdella heistä oli samanaikainen HSV-1 infektio. Tuloksemme osoittaa, että HSV-1:n ja HPV:n esiintyminen yhtä aikaa nuorten naisten suun limakalvolla on harvinaista. On suositeltavaa, että yhteisinfektion omaavia äitejä seurataan myös tulevaisuudessa, sillä HSV-1-infektio saattaa olla yksi riskitekijä suun limakalvon malignissa muutoksessa kroonisen HPV-infektion yhteydessä.

HPV In situ -hybridisaation käyttöönotto

Ihmisen papilloomavirus (Human papillomavirus HPV) aiheuttaa yleisen sukupuoliteitse leviävän tartuntataudin. Virusinfektiolla on todettu olevan yhteys kohdunkaulan syöpään ja on siksi tärkeä tutkimuskohde. Kätilöopiston sairaalan patologian laboratoriossa tutkitaan HPV:ta Hybrid Capture 2 -menetelmällä, joka antaa tuloksen kvantitatiivisena. Tulos on joko positiivinen tai negatiivinen korkean riskin HPV-genotyypeille. Tutkimuskohteena oli ihmisen papilloomavirusta määrittävä in situ -hybridisaatiomenetelmä, joka on tarkoitus ottaa käyttöön Kätilöopiston sairaalan patologian laboratorioon. Näytemateriaali kerättiin HUSLAB:n Qpati-tietokannasta. 40 potilastapausta valittiin, joista kymmenen potilastapausta kuuluu kondyloma planum-, kymmenen dysplasia levis-, kymmenen dysplasia moderata- ja viimeiset kymmenen dysplasia gravis -luokitukseen. Näytteet oli valettu parafiiniin, joista leikkattiin uudet näytelasit. Näistä tehtiin HPV in situ -hybridisaatio-, p16INK4a-, Ki67- ja hematoksyliini-eosiinivärjäykset. HPV ISH:n tuloksia verrattiin negatiivisten ja positiivisten kontrollien antamiin tuloksiin. Lisäksi tutkittiin proteiinien p16INK4a ja Ki67 vastaavuutta HPV ISH:n antamiin tuloksiin. Ki67 ja p16INK4a ovat merkkiaineita, joita havaitaan HPV:n aiheuttamissa dysplastisissa muutoksissa. HE-värjäyksen avulla tarkistettiin diagnoosiluokat. HPV in situ -hybridisaationäytteissä esiintyi HPV DNA-viruskopioita 82,5 %:ssa (33/40). Näytteistä negatiivisen tuloksen antoi 12,5 % (5/40) ja 5 % (2/40) niistä ei voitu tulkita. Immunohistokemialliset värjäykset antoivat keskenään yhteneväisiä tuloksia. Tulokset olivat yhteneviä myös HPV in situ -hybridisaation antamiin tuloksiin. Tulokset olivat luotettavia, koska negatiivinen kontrolli antoi negatiivisen ja positiivinen kontrolli positiivisen tuloksen. Hematoksyliini-eosiinivärjäyksellä tarkistetuista diagnoosiluokista 20 prosenttia (8/40) oli muuttunut. Tulokset olivat luotettavia, joten voidaan todeta, että in situ -hybridisaatiomenetelmä voidaan ottaa käyttöön Kätilöopiston sairaalan patologian laboratoriolle.

Suuren riskin HPV:n osoittaminen nestemäisistä gynekologisista irtosolunäytteistä (ThinPrep®) in situ hybridisaatio -menetelmällä

Kohdunkaulan syöpä on maailmanlaajuisesti naisten toiseksi yleisin syöpätauti. Tutkimuksilla on osoitettu, että 99,7 %:ssa tapauksista taustalla on suuren riskin HPV-infektio (HR-HPV). HPV-infektio voidaan todeta naisilta otettavasta gynekologisesta irtosolunäytteestä sen tunnusomaisten solujen, koilosyyttien, ansiosta. Syövän esiasteissa alkaa koilosyyttien määrä kuitenkin vähentyä. Pahimmissa muutoksissa koilosyyttejä ei enää ole nähtävissä, jolloin HPV-infektio saadaan varmistettua kudosnäytteestä in situ hybridisaatio -menetelmällä (ISH). ISH on virus-DNA -värjäys. Tavallisen gynekologisen irtosolunäytteen rinnalle on kehitetty nestemäinen gynekologinen irtosolunäyte. Suomessa menetelmä on vielä tutkimusasteella, mutta muualla maailmassa sen käyttö on yleistynyt. Tutkimuskäytössä on myös polymeraasiketjureaktio -menetelmä (PCR), jolla voidaan luotettavasti tutkia suuren riskin HPV-infektion läsnäolo nestemäisestä gynekologisesta irtosolunäytteestä. Nestemäinen gynekologinen irtosolunäyte lienee tulevaisuutta myös Suomessa. Uuden menetelmän yleistyessä on mielekästä tutkia sen käyttömahdollisuuksia lisää. Opinnäytetyössäni tutkin, voidaanko potilaiden nestemäisistä gynekologisista irtosolunäytteistä todeta ISH-menetelmällä suuren riskin HPV-DNA:ta. Tutkimukseni käsitti 29 potilastapausta, joista kymmenellä (10) oli sytologisena luokituksena ASC-US, kymmenellä (10) LSIL ja yhdeksällä (9) ASC-H/HSIL. Näiltä potilailta oli määritetty HR-HPV-infektio netemäisistä gynekologisista irtosolunäytteistä myös PCR-menetelmällä. Luotettavuuden lisäämiseksi tein myös potilaiden histologisista näytteistä ISH:n, jonka jo tiedetään olevan toimiva menetelmä. Lisäksi tein proteiinivärjäykset p16INK4a:n ja Ki-67:n. Näiden proteiinien tiedetään lisääntyvän silloin, kun kyseessä on suuren riskin HPV-infektio. Kaikki sytologisista näytteistä tehdyt in situ hybridisaatio -värjäykset antoivat negatiivisen tuloksen. Toisin sanoen HPV-DNA:ta ei voitu havaita. PCR-menetelmällä saatujen tulosten sekä myös kudosnäytteistä tehtyjen ISH-, p16INK4a- ja Ki-67 -värjäysten perusteella tulosten olisi pitänyt olla positiivisia. Kaikkien saatujen tulosten perusteella voidaan todeta, että in situ hybridisaatio -värjäys ei toiminut odotetulla tavalla nestemäisistä gynekologisista irtosolunäytteistä. In situ hybridisaatio on siis nykykäytännöllä toimimaton menetelmä ja se vaatii lisäselvittelyjä.

Human papillomavirus (HPV) in mothers before and after delivery – a three year follow-up study.

Human papillomavirus (HPV) infections in mothers are important to consider since pregnancy may affect the outcome of the infection and the mother may transmit HPV to the child. This thesis is part of the 3-year Finnish Family HPV Study on HPV infection dynamics within 329 families. The presence of maternal HPV antibodies and HPV DNA in placenta, umbilical cord blood and breast milk was examined. In addition, genital and oral HR-HPV carriage was studied among mothers with one or two pregnancies. At enrollment, seropositivity to HPV 6, 11, 16, 18 and 45 was recorded in 53 %, 21 %, 35 %, 21 % and 9 % of the mothers, respectively. Age at sexual debut, number of sexual partners, a history of genital warts and antibodies to LR/HR-HPV predicted HR/LR-HPV-seropositivity. During follow-up 27 %, 14 %, 17 %, 17 % and 7 % of the mothers seroconverted to the tested HPV-types, respectively. Decay of HPV-antibodies was rare. The mother’s new pregnancy was of minor impact in the outcome of oral and cervical HR-HPV infections. HPV-DNA was present in 4.2 % and 3.5 % of the placentas and umbilical cord blood samples, and in 4.5 % and 19.7 % of the breast milk samples collected at day 3 and month 2 postpartum, respectively. HPV-positivity in placenta/cord blood was related to a history of abnormal pap-smears or genital warts, and raised the risk of the neonate being HPV-positive at birth. The mode of delivery did not predict the HPVstatus of neonate, placenta, or cord blood. HPV DNA in breast milk was associated with oral HPV status of the father, but not with HPV status of the neonate. The results indicate that exposure to HPV is common and that part of the exposure might take place already early in life. Contrary to the common claim, pregnancy is not a risk factor for HPV.

Outcome of human papillomavirus infection among men in the Finnish Family HPV Study

Ihmisen papilloomaviruksen taudinkuva suomalaisperheiden seurantatutkimuksen mieskohortissa Tieto ihmisen papilloomaviruksen (HPV) yhteydestä eri anatomisten alueiden sairauksien syntyyn on lisännyt mielenkiintoa miehen papilloomavirustulehduksen taudinkulun selvittämiseksi. Tämä väitöskirjatyö on osa suomalaista seurantatutkimusta, jossa tutkitaan HPVinfektioiden tartuntareittejä 329 perheessä. Väitöstyössä keskitytään tutkimukseen osallistuneiden 131 miehen aineistoon. Suun limakalvonäytteet otettiin seitsemässä aikapisteessä. Lisäksi otettiin sukuelinalueen näytteet kahdella seurantakäynnillä. Riskitekijöitä kartoittava kyselytutkimus teetettiin tutkimuksen alkutilanteessa sekä viimeisellä seurantakäynnillä. Oireettomat HPV infektiot olivat alkutilanteessa yleisiä molemmilla sukupuolilla (miesten suu 18,3 % ja sukuelinalue 35,9 %, naisten suu 17,2 % ja kohdunsuu 18,8 %), mutta HPV:n genotyyppien vastaavuus partnerien välillä oli vähäinen. Naisen, mutta ei miehen, seksuaalinen riskikäyttäytyminen oli yhteydessä pariskunnan HPV tyyppien vastaavuuteen. Partnerin ja siviilisäädyn vaihtaminen lisäsivät miehen riskiä saada uusia HPV infektioita. Miehen suun limakalvonäytteistä löytyi kaikkiaan 17 eri HPV tyyppiä. Suun HPV-tulehduksen esiintyvyys vaihteli eri aikapisteissä 15 %:sta 31 %:iin. Uusien HPV tulehdusten ilmaantumisaika vaihteli 3,9 ja 25,7 kuukauden välillä. Suun HPV infektio parani valtaosalla miehistä. Suun krooninen HPV-infektio todettiin 14 %:lla miehistä. Näiden infektioiden keskimääräinen kesto vaihteli 6.0:sta 30.7:ään kuukauteen. Tupakointi lisäsi korkean riskin HPV tyyppien aiheuttamien suun kroonisten infektioiden riskiä, kun taas aikaisemmin sairastetut sukuelinten kondyloomat suojasivat siltä. Tuloksemme osoittavat, että miehen oireeton HPV tulehdus on yleinen suussa ja sukuelinten alueella. Vakaa parisuhde suojaa uusilta HPV tulehduksilta. Tupakoinnilla on keskeinen merkitys suun HPV-infektion kroonistumisessa.

K[ajaa]ni 16/6.[1924]

Kirje 16.6.1924

Suurlähettiläs Ralph Enckell 16/12 1965

Kirje