Endoscopic mucosal resection in the esophagus with a new rigide device : an animal study

Résumé: Introduction : L'utilisation de méthodes endoscopiques peu invasives est en constante augmentation pour le traitement des lésions tumorales précoces de l'oesophage. Le but du traitement comprend l'éradication complète de tous les foyers de dysplasie ou de carcinome in situ, notamment dans les métaplasies intestinales de l'oesophage de Barrett, qui peuvent dégénérer en adénocarcinome. Plusieurs techniques d'ablation de la muqueuse oesophagienne (laser, argon plasma, electrocoagulation, photothérapie dynamique, résection endoscopique) ont été utilisées jusqu'à présent, mais aucune n'a vraiment donné entière satisfaction. Les techniques actuelles de résections endoscopiques par fibroscopie sont entre autres limitées par le grand nombre de séances nécessaires à l'éradication complète de la lésion et par la petite taille des fragments de muqueuse obtenus, ce qui rend l'analyse histologique difficile. Dans notre étude animale, nous avons évalué la faisabilité, l'efficacité et la sécurité d'une méthode de résection endoscopique à l'aide d'un nouvel oesophagoscope rigide. Matériel et méthode : Le résectoscope est formé d'un oesophagoscope rigide avec une fenêtre distale transparente à travers laquelle la muqueuse et une partie de la sous-muqueuse sont aspirées et ensuite réséquées avec une anse thermique. Les diverses fenêtres utilisées ont une taille comprise entre 2.2 et 4.4 cm. Le mouton a été choisi en raison de la ressemblance de son oesophage avec celui de l'humain en ce qui concerne l'épaisseur de son oesophage et sa structure histologique. Nous avons effectué 55 résections hémi-circonférentielles sur 21 animaux et 11 résections circonférentielles sur 11 autres. La Mitomycine-C, une substance qui inhibe la prolifération fibroblastique, a été utilisée dans 8 résections circonférentielles à différents intervalles de temps afin d'empêcher la survenue de sténoses oesophagiennes. Résultats : Toutes les résections hémi-circonférentielles ont permis d'obtenir des fragments compacts de tissu avec des bords nets, ce qui permet une excellente étude histologique. La surface du tissu prélevé était en corrélation avec la taille de la fenêtre du resectoscope. Nous avons ainsi pu obtenir des fragments avec des dimensions comprises entre 6 et 12 cm2. Pour les résections circonférentielles, les tissus étaient obtenus en 2 parties, en inversant de 180° la position de l'appareil. La profondeur de la résection a été optimale dans 58 cas sur 65 avec une découpe précise au niveau de la sous-muqueuse sans lésion de la couche musculaire sous- jacente. Il n'y a pas eu de complications après les résections hémi-circonférentielles. Les complications engendrées par les résections circonférentielles (sténose, perforation) n'ont plus été rencontrées après application locale de Mitomycine-C administrée à des intervalles de temps bien précis. Conclusion : Notre méthode de résection endoscopique de la muqueuse oesophagienne offre une nouvelle approche très prometteuse par rapport aux options déjà disponibles. Elle apparaît supérieure en ce qui concerne la taille de tissu prélevé, la précision et régularité de la profondeur de résection, ainsi que la facilité et sûreté du diagnostic histologique et des marges de sécurité. Les résections hémi-circonférentielles se sont révélées sûres chez le modèle animal. Cette nouvelle technique mérite de plus amples investigations pour les résections circonférentielles avant son utilisation chez l'humain. Abstract: Background and Study Aims: We undertook this retrospective study to evaluate the frequency and prognosis of endoscopic treatment of laterally spreading tumors (LSTs) in the rectum. The recurrence rate for lesions of the lower rectum was compared with that of the upper rectum. Patients and Methods: During the period from July 1989 to June 2002, a total of 1237 rectal tumors were detected. LSTs accounted for 6.9% (85/1237) of all rectal tumors. A total of 224 tumors of the lower rectum were detected among the 1237 rectal tumors. LSTs accounted for 16.1 % (36/224) of all the lower rectal tumors. From 85 LST lesions, 67 were evaluated for their prognosis after endoscopic mucosal resection (EMR). Patients whose LSTs had been resected were followed up by endoscopy at the following frequencies: once 15 (22.4%); twice (more than 1 year), 20 (29.9%); three times (more than 3 years), 21(31.3%); and four times or more (more than 5 years), 11 (16.4%). Results: A total of 67 patients with endoscopically treated LSTs were followed up by endoscopy. We observed recurrences in two lesions of the upper rectum (2/38, 5.3%) and five lesions of the lower rectum (5/29, 17.2%) (P = 0.2364); all seven lesions were resected piecemeal. LSTs whose horizontal margin reached the pectinate line frequently recurred in the lower rectum, at a rate of 80% (4/5). However, all patients were completely cured by additional endoscopic resections, the greatest number of treatments being four. Conclusion: For early detection of recurrence and successful endoscopic cure, further colonoscopic examination within a few months after the first treatment is necessary.

Gene expression mapping in neuropathic pain : molecular plasticity in nociceptors and superficial dorsal horn

RESUME : La douleur neuropathique est le résultat d'une lésion ou d'un dysfonctionnement du système nerveux. Les symptômes qui suivent la douleur neuropathique sont sévères et leur traitement inefficace. Une meilleure approche thérapeutique peut être proposée en se basant sur les mécanismes pathologiques de la douleur neuropathique. Lors d'une lésion périphérique une douleur neuropathique peut se développer et affecter le territoire des nerfs lésés mais aussi les territoires adjacents des nerfs non-lésés. Une hyperexcitabilité des neurones apparaît au niveau des ganglions spinaux (DRG) et de la corne dorsale (DH) de la moelle épinière. Le but de ce travail consiste à mettre en évidence les modifications moléculaires associées aux nocicepteurs lésés et non-lésés au niveau des DRG et des laminae I et II de la corne dorsale, là où l'information nociceptive est intégrée. Pour étudier les changements moléculaires liés à la douleur neuropathique nous utilisons le modèle animal d'épargne du nerf sural (spared nerve injury model, SNI) une semaine après la lésion. Pour la sélection du tissu d'intérêt nous avons employé la technique de la microdissection au laser, afin de sélectionner une sous-population spécifique de cellules (notamment les nocicepteurs lésés ou non-lésés) mais également de prélever le tissu correspondant dans les laminae superficielles. Ce travail est couplé à l'analyse à large spectre du transcriptome par puce ADN (microarray). Par ailleurs, nous avons étudié les courants électriques et les propriétés biophysiques des canaux sodiques (Na,,ls) dans les neurones lésés et non-lésés des DRG. Aussi bien dans le système nerveux périphérique, entre les neurones lésés et non-lésés, qu'au niveau central avec les aires recevant les projections des nocicepteurs lésés ou non-lésés, l'analyse du transcriptome montre des différences de profil d'expression. En effet, nous avons constaté des changements transcriptionnels importants dans les nocicepteurs lésés (1561 gènes, > 1.5x et pairwise comparaison > 77%) ainsi que dans les laminae correspondantes (618 gènes), alors que ces modifications transcriptionelles sont mineures au niveau des nocicepteurs non-lésés (60 gènes), mais important dans leurs laminae de projection (459 gènes). Au niveau des nocicepteurs, en utilisant la classification par groupes fonctionnels (Gene Ontology), nous avons observé que plusieurs processus biologiques sont modifiés. Ainsi des fonctions telles que la traduction des signaux cellulaires, l'organisation du cytosquelette ainsi que les mécanismes de réponse au stress sont affectés. Par contre dans les neurones non-lésés seuls les processus biologiques liés au métabolisme et au développement sont modifiés. Au niveau de la corne dorsale de la moelle, nous avons observé des modifications importantes des processus immuno-inflammatoires dans l'aire affectée par les nerfs lésés et des changements associés à l'organisation et la transmission synaptique au niveau de l'aire des nerfs non-lésés. L'analyse approfondie des canaux sodiques a démontré plusieurs changements d'expression, principalement dans les neurones lésés. Les analyses fonctionnelles n'indiquent aucune différence entre les densités de courant tétrodotoxine-sensible (TTX-S) dans les neurones lésés et non-lésés même si les niveaux d'expression des ARNm des sous-unités TTX-S sont modifiés dans les neurones lésés. L'inactivation basale dépendante du voltage des canaux tétrodotoxine-insensible (TTX-R) est déplacée vers des potentiels positifs dans les cellules lésées et non-lésées. En revanche la vitesse de récupération des courants TTX-S et TTX-R après inactivation est accélérée dans les neurones lésés. Ces changements pourraient être à l'origine de l'altération de l'activité électrique des neurones sensoriels dans le contexte des douleurs neuropathiques. En résumé, ces résultats suggèrent l'existence de mécanismes différenciés affectant les neurones lésés et les neurones adjacents non-lésés lors de la mise en place la douleur neuropathique. De plus, les changements centraux au niveau de la moelle épinière qui surviennent après lésion sont probablement intégrés différemment selon la perception de signaux des neurones périphériques lésés ou non-lésés. En conclusion, ces modulations complexes et distinctes sont probablement des acteurs essentiels impliqués dans la genèse et la persistance des douleurs neuropathiques. ABSTRACT : Neuropathic pain (NP) results from damage or dysfunction of the peripheral or central nervous system. Symptoms associated with NP are severe and difficult to treat. Targeting NP mechanisms and their translation into symptoms may offer a better therapeutic approach.Hyperexcitability of the peripheral and central nervous system occurs in the dorsal root ganglia (DRG) and the dorsal horn (DH) of the spinal cord. We aimed to identify transcriptional variations in injured and in adjacent non-injured nociceptors as well as in corresponding laminae I and II of DH receiving their inputs.We investigated changes one week after the injury induced by the spared nerve injury model of NP. We employed the laser capture microdissection (LCM) for the procurement of specific cell-types (enrichment in nociceptors of injured/non-injured neurons) and laminae in combination with transcriptional analysis by microarray. In addition, we studied functionál properties and currents of sodium channels (Nav1s) in injured and neighboring non-injured DRG neurons.Microarray analysis at the periphery between injured and non-injured DRG neurons and centrally between the area of central projections from injured and non-injured neurons show significant and differential expression patterns. We reported changes in injured nociceptors (1561 genes, > 1.5 fold, >77% pairwise comparison) and in corresponding DH laminae (618 genes), while less modifications occurred in non-injured nociceptors (60 genes) and in corresponding DH laminae (459 genes). At the periphery, we observed by Gene Ontology the involvement of multiple biological processes in injured neurons such as signal transduction, cytoskeleton organization or stress responses. On contrast, functional overrepresentations in non-injured neurons were noted only in metabolic or developmentally related mechanisms. At the level of superficial laminae of the dorsal horn, we reported changes of immune and inflammatory processes in injured-related DH and changes associated with synaptic organization and transmission in DH corresponding to non-injured neurons. Further transcriptional analysis of Nav1s indicated several changes in injured neurons. Functional analyses of Nav1s have established no difference in tetrodotoxin-sensitive (TTX-S) current densities in both injured and non-injured neurons, despite changes in TTX-S Nav1s subunit mRNA levels. The tetrodotoxin-resistant (TTX-R) voltage dependence of steady state inactivation was shifted to more positive potentials in both injured and non-injured neurons, and the rate of recovery from inactivation of TTX-S and TTX-R currents was accelerated in injured neurons. These changes may lead to alterations in neuronal electrogenesis. Taken together, these findings suggest different mechanisms occurring in the injured neurons and the adjacent non-injured ones. Moreover, central changes after injury are probably driven in a different manner if they receive inputs from injured or non-injured neurons. Together, these distinct and complex modulations may contribute to NP.

Exercice physique et athérosclérose : quels sont les mécanismes physiologiques et moléculaires de l'exercice qui préviennent et protègent de l'athérosclérose? : approche chez un modèle expérimental d'athérosclérose : la souris génétiquement dépourvue en apolipoprotéine E (apoE-/-)

RESUME : L'athérosclérose, pathologie inflammatoire artérielle chronique, est à l'origine de la plupart des maladies cardiovasculaires qui constituent l'une des premières causes de morbidité et mortalité en France. Les études observationnelles et expérimentales montrent que l'exercice physique prévient la mortalité cardiovasculaire. Cependant, les mécanismes précisant les bénéfices cliniques de l'exercice sur l'athérosclérose sont encore largement inconnus. Le but général de ce travail a donc été d'explorer, en utilisant un modèle expérimental d'athérosclérose, la souris hypercholestérolémique génétiquement dépourvue en apolipoprotéine E (apoE-/-), les mécanismes athéroprotecteurs de l'exercice. La dysfonction endothéliale, généralement associée aux facteurs de risque cardiovasculaire, serait l'une des étapes précoces majeures de l'athérogenèse. Elle est caractérisée par une diminution de la biodisponibilité en monoxyde d'azote (NO) avec la perte de ses propriétés vasculo-protectrices, ce qui favorise un climat pro-athérogène (stress oxydatif, adhésion et infiltration des cellules inflammatoires dans la paroi artérielle...) conduisant à la formation de la plaque athéromateuse. L'objectif de notre premier travail a donc été d'explorer les effets de l'exercice d'une part, sur le développement des plaques athéromateuses et d'autre part, sur la fonction endothéliale de la souris apoE-/-. Nos résultats montrent que l'exercice réduit significativement l'extension de l'athérosclérose et prévient la dysfonction endothéliale. L'explication pharmacologique montre que l'exercice stimule la fonction endothéliale via, notamment, une plus grande sensibilité des récepteurs endothéliaux muscariniques, ce qui active les événements signalétiques cellulaires récepteurs-dépendants à l'origine d'une bioactivité accrue de NO. Les complications cliniques graves de l'athérosclérose sont induites par la rupture de la plaque instable provoquant la formation d'un thrombus occlusif et l'ischémie du territoire tissulaire en aval. L'objectif de notre deuxième travail a été d'examiner l'effet de l'exercice sur la qualité/stabilité de la plaque. Nos résultats indiquent que l'exercice de longue durée stabilise la plaque en augmentant le nombre de cellules musculaires lisses et en diminuant le nombre de macrophages intra-plaques. Nos résultats montrent aussi que la phosphorylation de la eNOS (NO Synthase endothéliale) Akt-dépendante n'est pas le mécanisme moléculaire majeur à l'origine de ce bénéfice. Enfin, dans notre troisième travail, nous avons investigué l'effet de l'exercice sur le développement de la plaque vulnérable. Nos résultats montrent, chez un modèle murin de plaque instable (modèle d'hypertension rénovasculaire à rénine et angiotensine II élevés) que l'exercice prévient l'apparition de la plaque vulnérable indépendamment d'un effet hémodynamique. Ce bénéfice serait associé à une diminution de l'expression vasculaire des récepteurs AT1 de l'Angiotensine II. Nos résultats justifient l'importance de l'exercice comme outil préventif des maladies cardiovasculaires. ABSTRACT : Atherosclerosis, a chronic inflammatory disease, is one of the main causes of morbidity and mortality in France. Observational and experimental data indicate that regular physical exercise has a positive impact on cardiovascular mortality. However, the mechanisms by which exercise exerts clinical benefits on atherosclerosis are still unknown. The general aim of this work was to elucidate the anti-atherosclerotic effects of exercise, using a mouse model of atherosclerosis: the apolipoprotein E-deficient mice (apoE-/- mice). Endothelial dysfunction, generally associated with cardiovascular risk factors, has been recognized to be a major and early step in atherogenesis. Endothelial dysfunction is characterized by Nitric Oxide (NO) biodisponibility reduction with loss of NO-mediated vasculoprotective actions. This leads to vascular effects such as increased oxidative stress and increased adhesion of inflammatory cells into arterial wall thus playing a role in atherosclerotic plaque development. Therefore, one of the objective of our study was to explore the effects of exercise on atherosclerotic plaque extension and on endothelial function in apoE-/- mice. Results show that exercise significantly reduces plaque progression and prevents endothelial dysfunction. Pharmacological explanation indicates that exercise stimulates endothelial function by increasing muscarinic receptors sensitivity which in turn activates intracellular signalling receptor-dependent events leading to increased NO bioactivity. The clinical manifestations of atherosclerosis are the consequences of unstable plaque rupture with thrombus formation leading to tissue ischemia. The second aim of our work was to determine the effect of exercise on plaque stability. We demonstrate that long-term exercise stabilizes atherosclerotic plaques as shown by decreased macrophage and increased Smooth Muscle Cells plaque content. Our results also suggest that the Akt-dependent eNOS phosphorylation pathway is not the primary molecular mechanism mediating these beneficial effects. Finally, we assessed a putative beneficial effect of exercise on vulnerable plaque development. In a mouse model of Angiotensine II (Ang II)-mediated vulnerable atherosclerotic plaques, we provide fist evidence that exercise prevents atherosclerosis progression and plaque vulnerability. The beneficial effect of swimming was associated with decreased aortic Ang II AT1 receptor expression independently from any hemodynamic change. These findings suggest clinical benefit of exercise in terms of cardiovascular event protection.

Translation of biomechanical concepts in bone tissue engineering: from animal study to revision knee arthroplasty.

Bone defects in revision knee arthroplasty are often located in load-bearing regions. The goal of this study was to determine whether a physiologic load could be used as an in situ osteogenic signal to the scaffolds filling the bone defects. In order to answer this question, we proposed a novel translation procedure having four steps: (1) determining the mechanical stimulus using finite element method, (2) designing an animal study to measure bone formation spatially and temporally using micro-CT imaging in the scaffold subjected to the estimated mechanical stimulus, (3) identifying bone formation parameters for the loaded and non-loaded cases appearing in a recently developed mathematical model for bone formation in the scaffold and (4) estimating the stiffness and the bone formation in the bone-scaffold construct. With this procedure, we estimated that after 3 years mechanical stimulation increases the bone volume fraction and the stiffness of scaffold by 1.5- and 2.7-fold, respectively, compared to a non-loaded situation.

NEW METHODS FOR DETECTION, SUSCEPTIBILITY TESTING AND BIOFILM ERADICATION OF DIFFICULT ORGANISMS

Aujourd'hui, les problèmes des maladies infectieuses concernent l'émergence d'infections difficiles à traiter, telles que les infections associées aux implants et les infections fongiques invasives chez les patients immunodéprimés. L'objectif de cette thèse était de développer des stratégies pour l'éradication des biofilms bactériens (partie 1), ainsi que d'étudier des méthodes innovantes pour la détection microbienne, pour l'établissement de nouveaux tests de sensibilité (partie 2). Le traitement des infections associées aux implants est difficile car les biofilms bactériens peuvent résister à des niveaux élevés d'antibiotiques. A ce jour, il n'y a pas de traitement optimal défini contre des infections causées par des bactéries de prévalence moindre telles que Enterococcus faecalis ou Propionibacterium acnés. Dans un premier temps, nous avons démontré une excellente activité in vitro de la gentamicine sur une souche de E. faecalis en phase stationnaire de croissance Nous avons ensuite confirmé l'activité de la gentamicine sur un biofilm précoce en modèle expérimental animal à corps étranger avec un taux de guérison de 50%. De plus, les courbes de bactéricidie ainsi que les résultats de calorimétrie ont prouvé que l'ajout de gentamicine améliorait l'activité in vitro de la daptomycine, ainsi que celle de la vancomycine. In vivo, le schéma thérapeutique le plus efficace était l'association daptomycine/gentamicine avec un taux de guérison de 55%. En établissant une nouvelle méthode pour l'évaluation de l'activité des antimicrobiens vis-à-vis de micro-organismes en biofilm, nous avons démontré que le meilleur antibiotique actif sur les biofilms à P. acnés était la rifampicine, suivi par la penicilline G, la daptomycine et la ceftriaxone. Les études conduites en modèle expérimental animal ont confirmé l'activité de la rifampicine seule avec un taux de guérison 36%. Le meilleur schéma thérapeutique était au final l'association rifampicine/daptomycine avec un taux de guérison 63%. Les associations de rifampicine avec la vancomycine ou la levofloxacine présentaient des taux de guérisons respectivement de 46% et 25%. Nous avons ensuite étudié l'émergence in vitro de la résistance à la rifampicine chez P. acnés. Nous avons observé un taux de mutations de 10"9. La caractérisation moléculaire de la résistance chez les mutant-résistants a mis en évidence l'implication de 5 mutations ponctuelles dans les domaines I et II du gène rpoB. Ce type de mutations a déjà été décrit au préalable chez d'autres espèces bactériennes, corroborant ainsi la validité de nos résultats. La deuxième partie de cette thèse décrit une nouvelle méthode d'évaluation de l'efficacité des antifongiques basée sur des mesures de microcalorimétrie isotherme. En utilisant un microcalorimètre, la chaleur produite par la croissance microbienne peut être-mesurée en temps réel, très précisément. Nous avons évalué l'activité de l'amphotéricine B, des triazolés et des échinocandines sur différentes souches de Aspergillus spp. par microcalorimétrie. La présence d'amphotéricine Β ou de triazole retardait la production de chaleur de manière concentration-dépendante. En revanche, pour les échinochandines, seule une diminution le pic de « flux de chaleur » a été observé. La concordance entre la concentration minimale inhibitrice de chaleur (CMIC) et la CMI ou CEM (définie par CLSI M38A), avec une marge de 2 dilutions, était de 90% pour l'amphotéricine B, 100% pour le voriconazole, 90% pour le pozoconazole et 70% pour la caspofongine. La méthode a été utilisée pour définir la sensibilité aux antifongiques pour d'autres types de champignons filamenteux. Par détermination microcalorimétrique, l'amphotéricine B s'est avéré être l'agent le plus actif contre les Mucorales et les Fusarium spp.. et le voriconazole le plus actif contre les Scedosporium spp. Finalement, nous avons évalué l'activité d'associations d'antifongiques vis-à-vis de Aspergillus spp. Une meilleure activité antifongique était retrouvée avec l'amphotéricine B ou le voriconazole lorsque ces derniers étaient associés aux échinocandines vis-à-vis de A. fumigatus. L'association échinocandine/amphotéricine B a démontré une activité antifongique synergique vis-à-vis de A. terreus, contrairement à l'association échinocandine/voriconazole qui ne démontrait aucune amélioration significative de l'activité antifongique. - The diagnosis and treatment of infectious diseases are today increasingly challenged by the emergence of difficult-to-manage situations, such as infections associated with medical devices and invasive fungal infections, especially in immunocompromised patients. The aim of this thesis was to address these challenges by developing new strategies for eradication of biofilms of difficult-to-treat microorganisms (treatment, part 1) and investigating innovative methods for microbial detection and antimicrobial susceptibility testing (diagnosis, part 2). The first part of the thesis investigates antimicrobial treatment strategies for infections caused by two less investigated microorganisms, Enterococcus faecalis and Propionibacterium acnes, which are important pathogens causing implant-associated infections. The treatment of implant-associated infections is difficult in general due to reduced susceptibility of bacteria when present in biofilms. We demonstrated an excellent in vitro activity of gentamicin against E. faecalis in stationary growth- phase and were able to confirm the activity against "young" biofilms (3 hours) in an experimental foreign-body infection model (cure rate 50%). The addition of gentamicin improved the activity of daptomycin and vancomycin in vitro, as determined by time-kill curves and microcalorimetry. In vivo, the most efficient combination regimen was daptomycin plus gentamicin (cure rate 55%). Despite a short duration of infection, the cure rates were low, highlighting that enterococcal biofilms remain difficult to treat despite administration of newer antibiotics, such as daptomycin. By establishing a novel in vitro assay for evaluation of anti-biofilm activity (microcalorimetry), we demonstrated that rifampin was the most active antimicrobial against P. acnes biofilms, followed by penicillin G, daptomycin and ceftriaxone. In animal studies we confirmed the anti-biofilm activity of rifampin (cure rate 36% when administered alone), as well as in combination with daptomycin (cure rate 63%), whereas in combination with vancomycin or levofloxacin it showed lower cure rates (46% and 25%, respectively). We further investigated the emergence of rifampin resistance in P. acnes in vitro. Rifampin resistance progressively emerged during exposure to rifampin, if the bacterial concentration was high (108 cfu/ml) with a mutation rate of 10"9. In resistant isolates, five point mutations of the rpoB gene were found in cluster I and II, as previously described for staphylococci and other bacterial species. The second part of the thesis describes a novel real-time method for evaluation of antifungals against molds, based on measurements of the growth-related heat production by isothermal microcalorimetry. Current methods for evaluation of antifungal agents against molds, have several limitations, especially when combinations of antifungals are investigated. We evaluated the activity of amphotericin B, triazoles (voriconazole, posaconazole) and echinocandins (caspofungin and anidulafungin) against Aspergillus spp. by microcalorimetry. The presence of amphotericin Β or a triazole delayed the heat production in a concentration-dependent manner and the minimal heat inhibition concentration (MHIC) was determined as the lowest concentration inhibiting 50% of the heat produced at 48 h. Due to the different mechanism of action echinocandins, the MHIC for this antifungal class was determined as the lowest concentration lowering the heat-flow peak with 50%. Agreement within two 2-fold dilutions between MHIC and MIC or MEC (determined by CLSI M38A) was 90% for amphotericin B, 100% for voriconazole, 90% for posaconazole and 70% for caspofungin. We further evaluated our assay for antifungal susceptibility testing of non-Aspergillus molds. As determined by microcalorimetry, amphotericin Β was the most active agent against Mucorales and Fusarium spp., whereas voriconazole was the most active agent against Scedosporium spp. Finally, we evaluated the activity of antifungal combinations against Aspergillus spp. Against A. jumigatus, an improved activity of amphotericin Β and voriconazole was observed when combined with an echinocandin. Against A. terreus, an echinocandin showed a synergistic activity with amphotericin B, whereas in combination with voriconazole, no considerable improved activity was observed.

Nouveau modèle de remboursement : un plafond pour le prix des traitements innovants très coûteux

Cet article présente le nouveau modèle de remboursement proposé par l'industrie pharmaceutique pour des traitements très coûteux : le "capping model" ou CAP. Les autorités acceptent le remboursement d'un montant plafond et l'industrie prend en charge un éventuel dépassement de coût du traitement.

Myocardial angiogenesis induction with bone protein derived growth factors (animal experiment).

Myocardial angiogenesis induction with vascular growth factors constitutes a potential strategy for patients whose coronary artery disease is refractory to conventional treatment. The importance of angiogenesis in bone formation has led to the development of growth factors derived from bovine bone protein. Twelve pigs (mean weight, 73 +/- 3 kg) were chosen for the study. In the first group (n = 6, growth factor group) five 100 micrograms boluses of growth factors derived from bovine bone protein, diluted in Povidone 5%, were injected in the lateral wall of the left ventricle. In the second group (n = 6, control group), the same operation was performed but only the diluting agent was injected. All the animals were sacrificed after 28 days and the vascular density of the left lateral wall (expressed as the number of vascular structures per mm2) as well as the area of blood vessel profiles per myocardial area analysed were determined histologically with a computerised system. The growth factor group had a capillary density which was significantly higher than that of the control group: 12.6 +/- 0.9/mm2 vs 4.8 +/- 0.5/mm2 (p < 0.01). The same holds true for the arteriolar density: 1 +/- 0.2/mm2 vs 0.3 +/- 0.1/mm2 (p < 0.01). The surface ratios of blood vessel profiles per myocardial area were 4900 +/- 800 micron 2/mm2 and 1550 +/- 400 micron 2/mm2 (p < 0.01) respectively. In this experimental model, bovine bone protein derived growth factors induce a significant neovascularisation in healthy myocardium, and appear therefore as promising candidates for therapeutic angiogenesis.

Methods for integration site distribution analyses in animal cell genomes.

The question of where retroviral DNA becomes integrated in chromosomes is important for understanding (i) the mechanisms of viral growth, (ii) devising new anti-retroviral therapy, (iii) understanding how genomes evolve, and (iv) developing safer methods for gene therapy. With the completion of genome sequences for many organisms, it has become possible to study integration targeting by cloning and sequencing large numbers of host-virus DNA junctions, then mapping the host DNA segments back onto the genomic sequence. This allows statistical analysis of the distribution of integration sites relative to the myriad types of genomic features that are also being mapped onto the sequence scaffold. Here we present methods for recovering and analyzing integration site sequences.

Sleep in vitro : Erk pathway regulates sleep duration and sleep related genes

To date, for most biological and physiological phenomena, the scientific community has reach a consensus on their related function, except for sleep, which has an undetermined, albeit mystery, function. To further our understanding of sleep function(s), we first focused on the level of complexity at which sleep-like phenomenon can be observed. This lead to the development of an in vitro model. The second approach was to understand the molecular and cellular pathways regulating sleep and wakefulness, using both our in vitro and in vivo models. The third approach (ongoing) is to look across evolution when sleep or wakefulness appears. (1) To address the question as to whether sleep is a cellular property and how this is linked to the entire brain functioning, we developed a model of sleep in vitro by using dissociated primary cortical cultures. We aimed at simulating the major characteristics of sleep and wakefulness in vitro. We have shown that mature cortical cultures display a spontaneous electrical activity similar to sleep. When these cultures are stimulated by waking neurotransmitters, they show a tonic firing activity, similar to wakefulness, but return spontaneously to the "sleep-like" state 24h after stimulation. We have also shown that transcriptional, electrophysiological, and metabolic correlates of sleep and wakefulness can be reliably detected in dissociated cortical cultures. (2) To further understand at which molecular and cellular levels changes between sleep and wakefulness occur, we have used a pharmacological and systematic gene transcription approach in vitro and discovered a major role played by the Erk pathway. Indeed, pharmacological inhibition of this pathway in living animals decreased sleep by 2 hours per day and consolidated both sleep and wakefulness by reducing their fragmentation. (3) Finally, we tried to evaluate the presence of sleep in one of the most primitive species with a neural network. We set up Hydra as a model organism. We hypothesized that sleep as a cellular (neuronal) property may occur with the appearance of the most primitive nervous system. We were able to show that Hydra have periodic rest phases amounting to up to 5 hours per day. In conclusion, our work established an in vitro model to study sleep, discovered one of the major signaling pathways regulating vigilance states, and strongly suggests that sleep is a cellular property highly conserved at the molecular level during evolution. -- Jusqu'à ce jour, la communauté scientifique s'est mise d'accord sur la fonction d'une majorité des processus physiologiques, excepté pour le sommeil. En effet, la fonction du sommeil reste un mystère, et aucun consensus n'est atteint le concernant. Pour mieux comprendre la ou les fonctions du sommeil, (1) nous nous sommes d'abord concentré sur le niveau de complexité auquel un état ressemblant au sommeil peut être observé. Nous avons ainsi développé un modèle du sommeil in vitro, (2) nous avons disséqué les mécanismes moléculaires et cellulaires qui pourraient réguler le sommeil, (3) nous avons cherché à savoir si un état de sommeil peut être trouvé dans l'hydre, l'animal le plus primitif avec un système nerveux. (1) Pour répondre à la question de savoir à quel niveau de complexité apparaît un état de sommeil ou d'éveil, nous avons développé un modèle du sommeil, en utilisant des cellules dissociées de cortex. Nous avons essayé de reproduire les corrélats du sommeil et de l'éveil in vitro. Pour ce faire, nous avons développé des cultures qui montrent les signes électrophysiologiques du sommeil, puis quand stimulées chimiquement passent à un état proche de l'éveil et retournent dans un état de sommeil 24 heures après la stimulation. Notre modèle n'est pas parfait, mais nous avons montré que nous pouvions obtenir les corrélats électrophysiologiques, transcriptionnels et métaboliques du sommeil dans des cellules corticales dissociées. (2) Pour mieux comprendre ce qui se passe au niveau moléculaire et cellulaire durant les différents états de vigilance, nous avons utilisé ce modèle in vitro pour disséquer les différentes voies de signalisation moléculaire. Nous avons donc bloqué pharmacologiquement les voies majeures. Nous avons mis en évidence la voie Erkl/2 qui joue un rôle majeur dans la régulation du sommeil et dans la transcription des gènes qui corrèlent avec le cycle veille-sommeil. En effet, l'inhibition pharmacologique de cette voie chez la souris diminue de 2 heures la quantité du sommeil journalier et consolide l'éveil et le sommeil en diminuant leur fragmentation. (3) Finalement, nous avons cherché la présence du sommeil chez l'Hydre. Pour cela, nous avons étudié le comportement de l'Hydre pendant 24-48h et montrons que des périodes d'inactivité, semblable au sommeil, sont présentes dans cette espèce primitive. L'ensemble de ces travaux indique que le sommeil est une propriété cellulaire, présent chez tout animal avec un système nerveux et régulé par une voie de signalisation phylogénétiquement conservée.