Myelin gene expression during demyelination and remyelination in aggregating brain cell cultures.

Remyelination can be studied in aggregating rat brain cell cultures after limited demyelination. Demyelination was induced using a monoclonal antibody against myelin/oligodendrocyte glycoprotein (MOG mAb), in the presence of complement. De- and remyelination were assessed by measuring myelin basic protein (MBP). Two days after removing the MOG mAb, MBP levels reached 50% of controls and after 7 days 93%. During this period, cell proliferation determined by [14C]thymidine incorporation was similar in remyelinating and control cultures. Hormones and growth factors were tested for possible stimulatory effect on remyelinating cultures. Bovine growth hormone (bGH), triiodothyronine (T3), basic fibroblast growth factor (bFGF) and platelet-derived growth factor (PDGF) did not improve remyelination. Only epidermal growth factor (EGF) increased the level of remyelination. PDGF increased the rate of cell proliferation in both control and remyelinating cultures. A significant proportion of oligodendrocytes entered the cell division cycle and were not available for remyelination. The results obtained with PDGF and FGF (inhibition) support the idea that a pool of progenitor cells was still present and able to proliferate and differentiate into myelinating oligodendrocytes. The levels of myelin protein mRNAs were investigated during de- and remyelination. During demyelination, myelin protein mRNA levels decreased to approximately 50% of control cultures and returned to normal during remyelination. These preliminary results indicate that normal levels of gene transcription are sufficient to meet the increased need for newly synthesized myelin proteins during remyelination.

Thyroid hormone enhances transected axonal regeneration and muscle reinnervation following rat sciatic nerve injury.

Improvement of nerve regeneration and functional recovery following nerve injury is a challenging problem in clinical research. We have already shown that following rat sciatic nerve transection, the local administration of triiodothyronine (T3) significantly increased the number and the myelination of regenerated axons. Functional recovery is a sum of the number of regenerated axons and reinnervation of denervated peripheral targets. In the present study, we investigated whether the increased number of regenerated axons by T3-treatment is linked to improved reinnervation of hind limb muscles. After transection of rat sciatic nerves, silicone or biodegradable nerve guides were implanted and filled with either T3 or phosphate buffer solution (PBS). Neuromuscular junctions (NMJs) were analyzed on gastrocnemius and plantar muscle sections stained with rhodamine alpha-bungarotoxin and neurofilament antibody. Four weeks after surgery, most end-plates (EPs) of operated limbs were still denervated and no effect of T3 on muscle reinnervation was detected at this stage of nerve repair. In contrast, after 14 weeks of nerve regeneration, T3 clearly enhanced the reinnervation of gastrocnemius and plantar EPs, demonstrated by significantly higher recovery of size and shape complexity of reinnervated EPs and also by increased acetylcholine receptor (AChRs) density on post synaptic membranes compared to PBS-treated EPs. The stimulating effect of T3 on EP reinnervation is confirmed by a higher index of compound muscle action potentials recorded in gastrocnemius muscles. In conclusion, our results provide for the first time strong evidence that T3 enhances the restoration of NMJ structure and improves synaptic transmission.

Effect of acute and chronic exercise on fat oxidation and hormonal and plasma metabolite kinetics in obese and severely obese men

Acute exercise increases energy expenditure (EE) during exercise and post-exercise recovery [excess post-exercise oxygen consumption (EPOC)] and therefore may be recommended as part of the multidisciplinary management of obesity. Moreover, chronic exercise (training) effectively promotes an increase in insulin sensitivity, which seems to be associated with increased fat oxidation rates (FORs). The main purpose of this thesis is to investigate 1) FORs and extra-muscular factors (hormones and plasma metabolites) that regulate fat metabolism during acute and chronic exercise; and 2) EPOC during acute post-exercise recovery in obese and severely obese men (class II and III). In the first study, we showed that obese and severely obese men present a lower exercise intensity (Fatmax) eliciting maximal fat oxidation and a lower reliance on fat oxidation at high, but not at low and moderate, exercise intensities compared to lean men. This was most likely related to an impaired muscular capacity to oxidize non-esterified fatty acids (NEFA) rather than decreased plasma NEFA availability or a change in the hormonal milieu during exercise. In the second study, we developed an accurate maximal incremental test to correctly and simultaneously evaluate aerobic fitness and fat oxidation kinetics during exercise in this population. This test may be used for the prescription of an appropriate exercise training intensity. In the third study, we demonstrated that only 2 wk of exercise training [continuous training at Fatmax and adapted high-intensity interval training (HIIT)], matched with respect to mechanical work, may be effective to improve aerobic fitness, FORs during exercise and insulin sensitivity, which suggest that FORs might be rapidly improved and that adapted HIIT is feasible in this population. The increased FORs concomitant with the lack of changes in lipolysis during exercise suggest an improvement in the mismatching between NEFA availability and oxidation, highlighting the importance of muscular (oxidative capacity) rather than extra-muscular (hormones and plasma metabolites) factors in the regulation of fat metabolism after a training program. In the fourth study, we observed a positive correlation between EE during exercise and EPOC, suggesting that a chronic increase in the volume or intensity of exercise may increase EE during exercise and during recovery. This may have an impact in weight management in obesity. In conclusion, these findings might have practical implications for exercise training prescriptions in order to improve the therapeutic approaches in obesity and severe obesity. -- L'exercice aigu augmente la dépense énergétique (DE) pendant l'exercice et la récupération post-exercice [excès de consommation d'oxygène post-exercise (EPOC)] et peut être utilisé dans la gestion multidisciplinaire de l'obésité. Quant à l'exercice chronique (entraînement), il est efficace pour augmenter la sensibilité à l'insuline, ce qui semble être associé à une amélioration du débit d'oxydation lipidique (DOL). Le but de cette thèse est d'étudier 1) le DOL et les facteurs extra-musculaires (hormones et métabolites plasmatiques) qui régulent le métabolisme lipidique pendant l'exercice aigu et chronique et 2) l'EPOC lors de la récupération aiguë post-exercice chez des hommes obèses et sévèrement obèses (classe II et III). Dans la première étude nous avons montré que les hommes obèses et sévèrement obèses présentent une plus basse intensité d'exercice (Fatmax) correspondant au débit d'oxydation lipidique maximale et un plus bas DOL à hautes, mais pas à faibles et modérées, intensités d'exercice comparé aux sujets normo-poids, ce qui est probablement lié à une incapacité musculaire à oxyder les acides gras non-estérifiés (AGNE) plutôt qu'à une diminution de leur disponibilité ou à un changement du milieu hormonal pendant l'exercice. Dans la deuxième étude nous avons développé un test maximal incrémental pour évaluer simultanément l'aptitude physique aérobie et la cinétique d'oxydation des lipides pendant l'exercice chez cette population. Dans la troisième étude nous avons montré que seulement deux semaines d'entraînement (continu à Fatmax et intermittent à haute intensité), appariés par la charge de travail, sont efficaces pour améliorer l'aptitude physique aérobie, le DOL pendant l'exercice et la sensibilité à l'insuline, ce qui suggère que le DOL peut être rapidement amélioré chez cette population. Ceci, en absence de changements de la lipolyse pendant l'exercice, suggère une amélioration de la balance entre la disponibilité et l'oxydation des AGNE, ce qui souligne l'importance des facteurs musculaires (capacité oxydative) plutôt que extra-musculaires (hormones et métabolites plasmatiques) dans la régulation du métabolisme lipidique après un entraînement. Dans la quatrième étude nous avons observé une corrélation positive entre la DE pendant l'exercice et l'EPOC, ce qui suggère qu'une augmentation chronique du volume ou de l'intensité de l'exercice pourrait augmenter la DE lors de l'exercice et lors de la récupération post-exercice. Ceci pourrait avoir un impact sur la gestion du poids chez cette population. En conclusion, ces résultats pourraient avoir des implications pratiques lors de la prescription des entraînements dans le but d'améliorer les approches thérapeutiques de l'obésité et de l'obésité sévère.

Multiple courses of antenatal corticosteroids for preterm birth (MACS): a randomised controlled trial.

BACKGROUND: One course of antenatal corticosteroids reduces the risk of respiratory distress syndrome and neonatal death. Weekly doses given to women who remain undelivered after a single course may have benefits (less respiratory morbidity) or cause harm (reduced growth in utero). We aimed to find out whether multiple courses of antenatal corticosteroids would reduce neonatal morbidity and mortality without adversely affecting fetal growth. METHODS: 1858 women at 25-32 weeks' gestation who remained undelivered 14-21 days after an initial course of antenatal corticosteroids and continued to be at high risk of preterm birth were randomly assigned to multiple courses of antenatal corticosteroids (n=937) or placebo (n=921), every 14 days until week 33 or delivery, whichever came first. The primary outcome was a composite of perinatal or neonatal mortality, severe respiratory distress syndrome, intraventricular haemorrhage (grade III or IV), periventricular leucomalacia, bronchopulmonary dysplasia, or necrotising enterocolitis. Analysis was by intention to treat. All patients and caregivers were unaware of the treatment given. This trial is registered as number ISRCTN2654148. FINDINGS: Infants exposed to multiple courses of antenatal corticosteroids had similar morbidity and mortality to those exposed to placebo (150 [12.9%] vs 143 [12.5%]). Those receiving multiple doses of corticosteroids also weighed less at birth than those exposed to placebo (2216 g vs 2330 g, p=0.0026), were shorter (44.5 cm vs 45.4 cm, p<0.001), and had a smaller head circumference (31.1 cm vs 31.7 cm, p<0.001). INTERPRETATION: Multiple courses of antenatal corticosteroids, every 14 days, do not improve preterm-birth outcomes, and are associated with a decreased weight, length, and head circumference at birth. Therefore, this treatment schedule is not recommended. FUNDING: Canadian Institutes of Health Research.

Steroid hormone pulsing drives cyclic gene expression.

Transcriptional cycling of activated glucocorticoid receptor (GR) and ultradian glucocorticoid secretion are well established processes. Ultradian hormone release is now shown to result in pulsatile gene transcription through dynamic exchange of GR with the target-gene promoter and GR cycling through the chaperone machinery.

Circulating estrogens and progesterone during primiparous pregnancies and risk of maternal breast cancer.

Pregnancy reduces maternal risk of breast cancer in the long term, but the biological determinants of the protection are unknown. Animal experiments suggest that estrogens and progesterone could be involved, but direct human evidence is scant. A case-control study (536 cases and 1,049 controls) was nested within the Finnish Maternity Cohort. Eligible were primiparous women who delivered at term a singleton offspring before age 40. For each case, two individually matched controls by age (±6 months) and date of sampling (±3 months) were selected. Estradiol, estrone and progesterone in first-trimester serum were measured by high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry and sex-hormone binding globulin (SHBG) by immunoassay. Odds ratios (OR) and 95% confidence intervals (CI) were estimated through conditional logistic regression. In the whole study population there was no association of breast cancer with any of the studied hormones. In analyses stratified by age at diagnosis, however, estradiol concentrations were positively associated with risk of breast cancer before age 40 (upper quartile OR, 1.81; CI, 1.08-3.06), but inversely associated with risk in women who were diagnosed ≥age 40 (upper quartile OR, 0.64; CI, 0.40-1.04), p(interaction) 0.004. Risk estimates for estrone mirrored those for estradiol but were less pronounced. Progesterone was not associated with risk of subsequent breast cancer. Our results provide initial evidence that concentrations of estrogens during the early parts of a primiparous pregnancy are associated with maternal risk of breast cancer and suggest that the effect may differ for tumors diagnosed before and after age 40.

Sex steroids and gender differences in nonmuscle invasive bladder cancer.

PURPOSE OF REVIEW: To review and summarize current knowledge on gender differences and sex steroid hormones in nonmuscle invasive bladder cancer. RECENT FINDINGS: Beyond the proven role of gender as a risk factor for the development of bladder cancer, recent studies indicate that women present with more advanced bladder cancer tumor stages than men, which may be due to differences in both bladder cancer care and biology. In addition, female gender has been identified as an independent prognostic factor for both recurrence and progression and may be associated with worse response to Bacillus Calmette-Guérin instillation therapy. Overall, sex steroid hormones and their receptors impact bladder carcinogenesis, recurrence and progression. Basic and transitional research evidence suggests that estrogens may initially protect against bladder cancer development, but later promote bladder cancer progression. Androgens, in contrast, seem to initiate and drive bladder cancer with its receptor playing a central role. Promising novel research shows a potential role of sex steroid hormones as therapeutic targets. SUMMARY: Whereas men are more likely to develop bladder cancer, women present generally with more advanced disease and have worse oncologic outcomes even after adjusting for tumor stage. Sex steroid hormones and their receptors play an active role in bladder cancer development and progression and represent attractive therapeutic targets for gender-specific care.

Regulation of the expression of components of the exocytotic machinery of insulin-secreting cells by microRNAs

Fine-tuning of insulin secretion from pancreatic beta-cells participates in blood glucose homeostasis. Defects in this process can lead to chronic hyperglycemia and diabetes mellitus. Several proteins controlling insulin exocytosis have been identified, but the mechanisms regulating their expression remain poorly understood. Here, we show that two non-coding microRNAs, miR124a and miR96, modulate the expression of proteins involved in insulin exocytosis and affect secretion of the beta-cell line MIN6B1. miR124a increases the levels of SNAP25, Rab3A and synapsin-1A and decreases those of Rab27A and Noc2. Inhibition of Rab27A expression is mediated by direct binding to the 3'-untranslated region of Rab27A mRNA. The effect on the other genes is indirect and linked to changes in mRNA levels. Over-expression of miR124a leads to exaggerated hormone release under basal conditions and a reduction in glucose-induced secretion. miR96 increases mRNA and protein levels of granuphilin, a negative modulator of insulin exocytosis, and decreases the expression of Noc2, resulting in lower capacity of MIN6B1 cells to respond to secretagogues. Our data identify miR124a and miR96 as novel regulators of the expression of proteins playing a critical role in insulin exocytosis and in the release of other hormones and neurotransmitters

Role of the epithelial sodium channel (ENaC) and its positive regulator, the channel-activating protease 1 (CAP1) in skin

Summary: The mammalian epidermis is a pluristratified epithelium composed of 90% keratinocytes, and its main function is to serve as barrier for the body. The epithelial sodium channel (ENaC), formed by three homologous subunits α, β and γ is found in a variety of epithelia including epidermis. Previous studies showed that ENaC modulates different aspects of epidermal differentiation, such as synthesis of differentiation-specific proteins and lipid secretion. ENaC plays also a critical role in sodium homeostasis of renal and pulmonary epithelia, and its activity is thereby well controlled by hormones and non-hormonal factors, such as the serine protease CAP1 (channel-activating protease 1), also termed prostasin encoded by Prss8 gene. Serine proteases are proteolytic enzymes involved in numerous physiological and pathological processes in the epidermis. In order to evaluate the role of β and γENaC in epidermis, we analyzed the skin phenotype of β and γENaC null mutant (βENaC-/- and γENaC-/-) mice in comparison with the phenotype of αENaC-deficient mice. Furthermore, keratin14-specific CAP1-deficient mice (Prss8lox/Δ /K14-Cre) were generated in order to unveil the role of the serine protease CAP1 in epidermal development and function. This study reveals that the skin phenotype of βENaC and γENaC null mutant mice is less severe than the one of αENaC-deficient mice. However, all these mice present a common premature lipid secretion in the mid-granular layer of the epidermis. Further, the composition of the lipids of the stratum corneum in αENaC-deficient mice is strongly altered, suggesting that epidermal barrier function is compromised. K14-specific CAP1-deficient newborn mice are born at the expected Mendelian ratio, but die soon after birth, showing that CAP1 is required for postnatal survival. The epidermis of these mice exhibits striking malformations of the stratum corneum showing hyperkeratosis. These defects seriously affect both inward and outward epidermal barrier function, leading to rapid and fatal dehydration. As in αENaC-deficient mice, the lipid composition of the stratum corneum of K14-specific CAP1-deficient mice is disturbed. Furthermore, lack of CAP1 leads to the selective loss of filaggrin monomers, important for keratins aggregation and skin moisturization, and to an increased of aberrant profilaggrin precursors. In conclusion, both ENaC and CAP1 expression in the epidermis are crucial for keratinocyte differentiation processes and/or barrier function. Since the abnormalities in K14-specific CAP1-deficient mice resemble key features of human skin ichthyosis, in particular Harlequin ichthyosis, the study of ENaC and CAP1 mutant mice might allow new insights into mechanisms underlying skin diseases. Résumé: L'épiderme des mammifères est un épithélium pluristratifié, protégeant le corps contre les perturbations extérieures et la déshydratation. Le canal épithélial à sodium (ENaC), formé de trois sous-unités α, β et γ, est exprimé dans de nombreux épithélia, comme l'épiderme. Des études ont montré que l'absence de la sous-unité αENaC modulait différents aspects de la différenciation des kératinocytes de l'épiderme, comme la synthèse de protéines spécifiques ou la sécrétion de lipides dans la couche granulaire de l'épiderme. ENaC joue également un rôle crucial dans l'homéostasie du sodium dans les épithélia électriquement étanches, comme l'épithélium rénal ou pulmonaire. L'activité de ENaC est par conséquent finement régulée, en partie par des hormones, mais aussi par des facteurs non-hormonaux, telle que la sérine protéase CAP1 (« channel-activating protease 1 >>) (nommée également prostasine et codée par le gène Prss8). Le but de ce travail a donc été d'étudier le rôle des sous-unités β et γENaC dans l'épiderme en comparaison avec celui de la sous-unité α en utilisant des souris mutantes βENaC-/- et γENaC-/-. Dans un deuxième temps, le phénotype d'une souris chez qui CAP1 a été spécifiquement invalidé dans l'épiderme (Prsslox/Δ/K14-Cre) a été analysé, dans le but de mettre en évidence le rôle de cette protéase dans l'épiderme. Comme déjà montré pour les souris αENaC-/-, la sécrétion des lipides dans la couche granulaire de l'épiderme des souris βENaC-/- et γENaC-/- est prématurée. Cependant, l'hyperplasie et l'expression anormale des protéines marqueurs de la différenciation présents chez les souris αENaC-/- n'ont pas été observés dans l'épiderme des souris βENaC-/- et γENaC-/-. La composition lipidique de la couche cornée des souris αENaC-/- est fortement altérée suggérant que la fonction de barrière de l'épiderme de ces souris est compromise. Les souris mutantes CAP1 ont quant à elles révélé des malformations sévères de leur couche cornée, affectant la fonction de barrière de leur épiderme et conduisant à la mort de ces souris par déshydratation quelques jours après leur naissance. De plus, la composition en lipides de la couche cornée ainsi que la taille des cellules cornées, les cornéocytes, de ces souris sont modifiées par rapport aux souris contrôles. L'invalidation de la protéine CAP1 dans l'épiderme conduit aussi à la perte de la filaggrine, une protéine cruciale pour l'agrégation des kératines dans la couche cornée et le maintien du niveau d'hydratation de la peau, et à l'accumulation de ses précurseurs. En conclusion, l'expression de ENaC et de CAP1 est cruciale pour la différenciation de l'épiderme et/ou sa fonction de barrière. De plus, le phénotype des souris mutantes CAP1 présente des caractéristiques qui ressemblent à celles observées dans certaines pathologies humaines cutanées, comme l'ichthyose d'Harlequin. L'étude des souris mutantes ENaC et CAP1 pourrait donc apporter de nouvelles connaissances dans les mécanismes impliqués dans l'ichthyose d'Harlequin ou d'autres maladies de la peau chez l'homme. Résumé tout public: La peau est le plus grand organe vital du corps humain. Sa fonction principale est de protéger le corps comme une barrière, contre les agressions extérieures et la déshydratation. De nombreuses maladies de la peau résultent d'une perte de fonction de cette barrière. Bien que les pathologies cutanées soient très bien décrites, leur cause génétique n'est en général pas encore connue. La souris est alors un modèle de choix pour la recherche fondamentale. En effet, grâce aux progrès récents de la science, le génome de la souris peut aujourd'hui être modifié dans le but d'étudier le rôle de nombreuses protéines. Dans différents organes, comme le rein et le poumon, le canal épithélial à sodium (ENaC), composé de trois sous-unités protéiques homologues (α, β, et γ), joue un rôle essentiel dans la réabsorption du sodium. L'activité de ENaC est régulée par de nombreux facteurs hormonaux et non-hormonaux, telle que la protéase CAP1 (« channel-activating protease 1 »). L'invalidation de la sous-unité αENaC chez la souris a permis de montrer que dans la peau, le canal ENaC est impliqué dans la différenciation des cellules de l'épiderme et la croissance des poils. Durant ce travail, le phénotype des souris chez qui la protéine βENaC, γENaC ou CAP1 a été invalidée (souris mutantes), a été étudié dans le but de mieux comprendre le rôle des sous-unités du canal ENaC et de son régulateur CAP1 dans la peau. Les résultats de ce projet ont montré que les souris mutantes βENaC et γENaC présentent un épiderme anormal avec une synthèse prématurée de lipides dans la couche granulaire, suggérant l'implication de ENaC dans la fonction de barrière de la peau. De plus, quand CAP1 est invalidé de manière totale chez les souris, le développement embryonnaire est perturbé et ces souris meurent avant la naissance. CAP1 a donc été invalidé spécifiquement dans l'épiderme des souris. Ces souris mutantes « épiderme-spécifique » naissent normalement, mais meurent peu après la naissance de déshydratation. La couche superficielle de l'épiderme, appelée couche cornée, de ces souris est malformée et ne confère plus à la peau sa fonction de barrière. De plus, les composants de la couche cornée, les cellules cornées entourées de lipides, sont sévèrement altérés. Le phénotype de ces souris ressemble aux caractéristiques présentes chez les patients atteints d'ichthyoses, en particulier l'ichthyose d'Harlequin. En conclusion, le canal ENaC ainsi que son régulateur CAP1 jouent un rôle clé dans les processus de différenciation de l'épiderme et/ou de sa fonction de barrière. De plus, les souris mutantes pour CAP1 et ENaC se révéleront peut-être comme des modèles appropriés dans l'étude de l'ichthyose d'Harlequin ou d'autres maladies cutanées.

Analyse fonctionnelle et moléculaire d'un nouveau gène (VIT32) impliqué dans le mécanisme d'action de la vasopressine

Résumé Les mécanismes de régulation de la réabsorption fine du sodium dans la partie distale (tube distal et tube collecteur) du néphron ont un rôle essentiel dans le maintien de l'homéostasie de la composition ionique et du volume des fluides extracellulaires. Ces mécanismes permettent le maintien de la pression sanguine. Dans la cellule principale du tube collecteur cortical (CCD), le taux de réabsorption de sodium dépend essentiellement de l'activité du canal épithélial à sodium (ENaC) à la membrane apicale et de la pompe sodium-potassium-adénosine-triphosphatase (Na+-K±ATPase) à la membrane basolatérale. L'activité de ces deux molécules de transport est en partie régulée par des hormones dont l'aldostérone, la vasopressine et l'insuline. Dans les cellules principales de CCD, la vasopressine régule le transport de sodium en deux étapes : une étape précoce dite « non-génomique » et une étape tardive dite « génotnique ». Durant l'étape précoce, la vasopressine régule l'expression de gènes, dont certains peuvent être impliqués dans le transport de sodium, comme ENaC et la Na+ -K+ATP ase. Le but de mon travail a été d'étudier l'implication d'une protéine appelée VIP32 (vasopressin induced protein : VIP) dans le transport de sodium. L'expression de VIP32 est augmentée par la vasopressine dans les cellules principales de CCD. Dans l'ovocyte de Xenopus laevis utilisé comme système d'expression hétérologue, nous avons montré que l'expression de VIP32 provoque la maturation méiotique de l'ovocyte par l'activation de la voie des MAPK (mitogen-activated protein kinase : MAPK) et du facteur de promotion méiotique (MPF). La co-expression d'ENaC et de VIP32 diminue l'activité d'ENaC de façon sélective, par l'activation de la voie des MAPK, sans affecter l'expression du canal à la surface membranaire. Nous avons également montré que la régulation de l'activité d'ENaC par la voie des MAPK est dépendante du mécanisme de régulation d'ENaC lié à un motif du canal appelé PY. Ce motif est impliqué dans le contrôle de la probabilité d'ouverture ainsi que l'expression à la surface membranaire d'ENaC. Dans les cellules principales, VIP32 par l'activation de la voie des MAPK peut être impliqué dans la régulation négative du transport transépithélial qui a lieu après plusieurs heures de traitement à la vasopressine. Le tube collecteur de reins normaux présente un taux basal significatif d'activité de la voie MAPK MEK1/2-ERK1/2. Dans la lignée mpkCCDc14 de cellules principales de CCD de souris, que nous avons utilisé pour cette partie du travail, nous avons montré la présence d'un taux basal d'activité d'ERK1/2 (pERK1/2). L'aldostérone et la vasopressine, connus pour stimuler le courant sodique transépithélial dans le CCD, ne changeaient pas le taux basal de pERK1/2. Le transport de sodium transépithélial basal, ou stimulé par l'aldostérone ou la vasopressine est diminué par l'effet de PD98059, un inhibiteur de MEK1/2 qui diminue parallèlement le taux de pERK1/2. Nous avons également montré dans des cellules non stimulées, ou stimulées par de l'aldostérone ou de la vasopressine, que l'activité de la Na+-K+ ATPase, mais pas celle d'ENaC est inhibée par des traitements avec différents inhibiteurs de MEK1/2. Par un marquage de la Na±-K+ATPase à la surface membranaire nous avons montré que la voie d'ERK1/2 contrôle l'activité intrinsèque de la Na+-K+ ATPase, plutôt que son expression à la surface membranaire. Ces données ont montré que l'activité de la Na+-K+ATPase et le transport transépithélial de sodium sont contrôlés par l'activité basal et constitutive de la voie d'ERK1/2. Summary The regulation of sodium reabsorption in the distal nephron (distal tubule and cortical collecting duct) in the kidney plays an essential role in the control of extracellular fluids composition and volume, and thereby blood pressure. In the principal cell of the collecting duct (CCD), the level of sodium reabsorption mainlly depends on the activity of both epithlial sodium channel (ENaC) and sodium-potassium-adenosine-triphosphatase (Na+-K+ATPase). The activity of these two transporters is regulated by hormones especially aldosterone, vasopressin and insuline.In the principal cell of the CCD, vasopressin regulates sodium transport via a short-term effect and a late genomic effect. During the genomic effect vasopressin activates a complex network of vasopressin-dependent genes involved in the regulation of sodium transport as ENaC and Na+-K+ATPase. We were interested in the role of a recently identified vasopressin induced protein (VIP32) and its implication in the regulation of sodium transport in principal cell of the CCD. The Xenopus oocyte expression system revealed two functions : expressed alone VIP32 rapidly induces oocyte meiotic maturation through the activation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway and the meiotic promoting factor and when co-expressed with ENaC, V1P32 selectively dowrn-egulates channel activity, but not channel cell surface expression. We have shown that the ENaC downregulation mediated by the activation of the MAPK pathway is related to the PY motif of ENaC. This motif is implicated in ENaC cell surface expression and open probability regulation. In the kidney principal cell, VIP32 through the activation of MAPK pathway may be involved in the downregulation of transepithelial sodium transport observed within a few hours after vasopressin treatment. The collecting duct of normal kidney exhibits significant activity of the MEK1/2-ERK1/2 MAPK pathway. Using in vitro cultured mpkCCDc14 principal cells we have shown a significant basal level of ERK1/2 activity (pERK1/2). Aldosterone and vasopressin, known to upregulate sodium reabsorption in CCDs, did not change ERK1/2 activity. Basal and aldosterone- or vasopressin-stimulated sodium transport were downregulated by the MEK1/2 inhibitor PD98059 in parallel with a decrease in pERK1/2 in vitro. The activity of Na+-K+ATPase but not that of ENaC was inhibited by MEK1/2 inhibitors in both, unstimulated and aldosterone- or vasopressin-stimulated CCDs in vitro. Cell surface labelling showed that intrinsic activity rather than cell surface expression of Na+-K+ATPase was controlled by pERK1/2. Our data demonstrate that basal constitutive activity of ERK1/2 pathway controls Na+-K+ATPase activity and transepithelial sodium transport in the principal cell. Résumé tout public Les mécanismes de régulation de la réabsorption fine du sodium dans la partie distale du néphron (l'unité fonctionnelle du rein) ont un rôle essentiel dans le maintien de l'homéostasie de la composition et du volume des fluides extracellulaires. Ces mécanismes permettent de maintenir une pression sanguine effective. Dans les cellules principales du tube collecteur, une région spécifique du néphron distal, le transport de sodium dépend essentiellement de l'activité de deux transporteurs de sodium : le canal épithélial à sodium (ENaC) et la pompe sodium-potassium-adénosine-triphosphatase (Na+-K+ATPase). Afin de répondre aux besoins de l'organisme, l'activité de ces deux molécules de transport est en partie régulée par des hormones dont l'aldostérone, la vasopressine et l'insuline. Dans les cellules principales du tube collecteur, la vasopressine régule le transport de sodium en deux étapes : une étape rapide et une étape lente dite « génomique ». Durant l'étape lente, la vasopressine régule l'expression de gènes pouvant être impliqués dans le transport de sodium, dont notamment ceux d'ENaC et de la Na+-K+ATPase. Parmi les gènes dont l'expression est augmentée par la vasopressine, celui de VIP32 (vasopressin induced protein : VIP) fait l'objet de cette étude. Le but de mon travail a été d'étudier, dans un système d'expression hétérologue (l'ovocyte de Xenopus leavis), l'implication de VIP32 dans le transport de sodium. Nous avons montré que VIP32 est capable d'activer un mécanisme moléculaire en cascade appelé MAPK (mitogen-activated protein kinase : MAPK) et est aussi capable de diminuer l'activité d'ENaC. Parallèlement, dans une lignée de cellules principales de tube collecteur les mpkCCDc14, nous avons montré que le taux basal d'activité de la cascade MAPK est capable de réguler l'activité de la Na+-K+ATPase, tandis qu'il n'influence pas l'activité d'ENaC.

Rôle du transporteur de glucose GLUT2 dans les mécanismes centraux de glucodétection impliqués dans le contrôle de la sécrétion du glucagon et de la prise alimentaire

Résumé Rôle du transporteur de glucose GLUT2 dans les mécanismes centraux de glucodétection impliqués dans le contrôle de la sécrétion du glucagon et de la prise alimentaire. Les mécanismes centraux de glucodétection jouent un rôle majeur dans le contrôle de l'homéostasie glucidique. Ces senseurs régulent principalement la sécrétion des hormones contre-régulatrices, la prise alimentaire et la dépense énergétique. Cependant, la nature cellulaire et le fonctionnement moléculaire de ces mécanismes ne sont encore que partiellement élucidés. Dans cette étude, nous avons tout d'abord mis en évidence une suppression de la stimulation de la sécrétion du glucagon et de la prise alimentaire en réponse à une injection intracérébroventriculaire (i.c.v.) de 2-déoxy-D-glucose (2-DG) chez les souris de fond génétique mixte et déficientes pour le gène glut2 (souris RIPG1xglut2-/-). De plus, chez ces souris, l'injection de 2-DG n'augmente pas l'activation neuronale dans l'hypothalamus et le complexe vagal dorsal. Nous avons ensuite montré que la ré-expression de GLUT2 dans les neurones des souris RIPG1xg1ut2-/- ne restaure pas la sécrétion du glucagon et la prise alimentaire en réponse à une injection i.c.v. de 2-DG. En revanche, l'injection de 2-DG réalisée chez les souris RIPG1xg1ut2-/- ré-exprimant le GLUT2 dans leurs astrocytes, stimule la sécrétion du glucagon et l'activation neuronale dans le complexe vagal dorsal mais n'augmente pas la prise alimentaire ni l'activation neuronale dans l'hypothalamus. L'ensemble de ces résultats démontre l'existence de différents mécanismes centraux de glucodétection dépendants de GLUT2. Les mécanismes régulant la sécrétion du glucagon sont dépendants de GLUT2 astrocytaire et pourraient être localisés dans le complexe vagal dorsal. L'implication des astrocytes dans ces mécanismes suggère un couplage fonctionnel entre les astrocytes et les neurones adjacents « sensibles au glucose ». Lors de cette étude, nous avons remarqué chez les souris RIPG1xg1ut2-/- de fond génétique pur C57B1/6, que seul le déclenchement de la prise alimentaire en réponse à l'injection i.p. ou i.c.v. de 2-DG est aboli. Ces données mettent en évidence que suivant le fond génétique de la souris, les mécanismes centraux de glucodétection impliqués dans la régulation de la sécrétion peuvent être indépendants de GLUT2. Summary. Role of transporter GLUT2 in central glucose sensing involved in the control of glucagon secretion and food intake. Central glucose sensors play an important role in the control of glucose homeostasis. These sensors regulate general physiological functions, including food intake, energy expenditure and hormones secretion. So far the cellular and molecular basis of central glucose detection are poorly understood. Hypoglycemia, or cellular glucoprivation by intraperitoneal injection of 2-deoxy¬glucose (2-DG) injection, elicit multiple glucoregulatory responses, in particular glucagon secretion and stimulation of feeding. We previously demonstrated that the normal glucagon response to insulin-induced hypoglycemia was suppressed in mice lacking GLUT2. This indicated the existence of extra-pancreatic, GLUT2-dependent, glucose sensors controllling glucagon secretion. Here, we have demonstrated that the normal glucagon and food intake responses to central glucoprivation, by intracerebroventricular (i.c.v.) injections of 2-DG, were suppressed in mice lacking GLUT2 (RIPG1xglut2-/- mice) indicating that GLUT2 plays a role in central glucose sensing units controlling secretion of glucagon and food intake. Whereas it is etablished that glucose responsive neurons change their firing rate in response to variations of glucose concentrations, the exact mechanism of glucose detection is not established. In particular, it has been suggested that astrocytic cells may be the primary site of glucose detection and that a signal is subsequently transmitted to neurons. To evaluate the respective role of glial and neuronal expression of GLUT2 in central glucodetection, we studied hypoglycemic and glucoprivic responses following cellular glucoprivation in RIPG1xglut2-/- mice reexpressing the transgenic GLUT2 specifially in their astrocytes (pGFAPG2xRIPG1xglut2-/- mice) or their neurons (pSynG2xRIPG1xglut2-/- mice). The increase of food intake after i.p. injection of 2-DG in control mice was not observed in the pGFAPG2xRIPG1xglut2-/- mice. Whereas a strong increase of glucagon secretion was observed in control and pGFAPG2xRIPG1xglut2-/- mice, not glucagonemic response was induced in pSynG2xRIPG1xglut2-/- mice. Our results show that GLUT2 reexpression in glial cells but not in neurons restored glucagon secretion and thus present a strong evidence that glucose detection and the control of glucagon secretion require a coupling between glial cells and neurons. Furthermore, these results show the existence of differents glucose sensors in CNS. Résumé tout public. Rôle du transporteur de glucose GLUT2 dans les mécanismes centraux de glucodétection impliqués dans le contrôle de la sécrétion du glucagon et de la prise alimentaire. Chez les mammifères, en dépit des grandes variations dans l'apport et l'utilisation du glucose, la glycémie est maintenue à une valeur relativement constante d'environ 1 g/l. Cette régulation est principalement sous le contrôle de deux hormones produites par le pancréas l'insuline et le glucagon. A la suite d'un repas, la détection de l'élévation de la glycémie par le pancréas permet la libération pancréatique de l'insuline dans le sang. Cette hormone va alors permettre le stockage dans le foie du glucose sanguin en excès et diminuer ainsi la glycémie. Sans insuline, le glucose s'accumule dans le sang. On parle alors d'hyperglycémie chronique. Cette situation est caractéristique du diabète et augmente les risques de maladies cardiovasculaires. A l'inverse, lors d'un jeûne, la détection de la diminution de la glycémie par le cerveau permet le déclenchement de la prise alimentaire et stimule la sécrétion de glucagon par le pancréas. Le glucagon va alors permettre la libération dans le sang du glucose stocké par le foie. Les effets du glucagon et de la prise de nourriture augmentent ainsi les concentrations sanguines de glucose pour empêcher une diminution trop importante de la glycémie. Une hypoglycémie sévère peut entraîner un mauvais fonctionnement du cerveau allant jusqu'à des lésions cérébrales. Contrairement aux mécanismes pancréatiques de détection du glucose, les mécanismes de glucodétection du cerveau ne sont encore que partiellement élucidés. Dans le laboratoire, nous avons observé, chez les souris transgéniques n'exprimant plus le transporteur de glucose GLUT2, une suppression de la stimulation de la sécrétion du glucagon et du déclenchement de la prise alimentaire en réponse à une hypoglycémie, induite uniquement dans le cerveau. Dans le cerveau, le GLUT2 est principalement exprimé par les astrocytes, cellules gliales connues pour soutenir, nourrir et protéger les neurones. Nous avons alors ré-exprimé spécifiquement le GLUT2 dans les astrocytes des souris transgéniques et nous avons observé que seule la stimulation de la sécrétion du glucagon en réponse à l'hypoglycémie est restaurée. Ces résultats mettent en évidence que la sécrétion du glucagon et la prise alimentaire sont contrôlées par différents mécanismes centraux de glucodétection dépendants de GLUT2.

Effects of dexamethasone on hepatic glucose production and fructose metabolism in healthy humans.

This study was designed to determine whether glucocorticoids alter autoregulation of glucose production and fructose metabolism. Two protocols with either dexamethasone (DEX) or placebo (Placebo) were performed in six healthy men during hourly ingestion of[13C]fructose (1.33 mmol.kg-1.h-1) for 3 h. In both protocols, endogenous glucose production (EGP) increased by 8 (Placebo) and 7% (DEX) after fructose, whereas gluconeogenesis from fructose represented 82 (Placebo) and 72% (DEX) of EGP. Fructose oxidation measured from breath 13CO2 was similar in both protocols [9.3 +/- 0.7 (Placebo) and 9.6 +/- 0.5 mumol.kg-1.min-1 (DEX)]. Nonoxidative carbohydrate disposal, calculated as fructose administration rate minus net carbohydrate oxidation rate after fructose ingestion measured by indirect calorimetry, was also similar in both protocols [5.8 +/- 0.8 (Placebo) and 5.9 +/- 2.0 mumol.kg-1.min-1 (DEX)]. We concluded that dexamethasone 1) does not alter the autoregulatory process that prevents a fructose-induced increase in gluconeogenesis from increasing total glucose production and 2) does not affect oxidative and nonoxidative pathways of fructose. This indicates that the insulin-regulated enzymes involved in these pathways are not affected in a major way by dexamethasone.

A study of the translational regulation exerted by some neuroactive substances on the expression of the monocarboxylate transporter MCT2 in cultured cortical neurons

Summary of the thesis Glucose has been considered the major, if not the exclusive, energy substrate for the brain. But under certain conditions other substrates, namely monocarboxylates (lactate, pyruvate, and ketone bodies), can contribute significantly to satisfy brain energy demands. These monocarboxylates need to be transported across the blood brain barrier as well as out of astrocytes into the extracellular space and taken up into neurons. It has been shown that monocarboxylates are transported by a family of proton-linked transporters called monocarboxylate transporters (MCTs). In the central nervous system, MCT2 is the predominant neuronal form and little is known about the regulation of its expression. The neurotransmitter noradrenaline (NA) was shown previously to enhance the expression of MCT2 in cultured cortical neurons via a translational mechanism. Here, we demonstrate that two other substances, namely, insulin and IGF-1 enhance MCT2 protein expression in cultured mouse cortical neurons in a time- and concentrationdependent manner without affecting MCT2 mRNA levels. This result confirmed that MCT2 protein expression is translationally regulated and extend the observation to different types of neuroactive substances. Then we sought to determine by which signaling pathway(s) NA, insulin and IGF-1 can induce MCT2 protein expression. First, we observed by Western blot that all three substances cause activation of the MAP kinase ERK as well as the kinase Akt via their phosphorylation. Moreover, the mTOR/S6K pathway which is known to play an important role in translation initiation regulation was also strongly stimulated by all three substances. Second, we sought to determine the implication of these signaling pathways on the NA-, insulin- and IGF-1-induced enhancement of MCT2 protein expression and used specific inhibitors of these signaling pathways. We observed that the Pia kinase and mTOR inhibitors LY294002 and rapamycin respectively, strongly prevent the enhancement. of MCT2 expression caused by either NA, insulin ar IGF-1. In contrast, the MEK inhibitor PD98059 and the p38 MAP kinase inhibitor SB202190 had only a slight effect on the enhancement of MCT2 expression in all three cases. These results suggest that NA, insulin and IGF-1 regulate MCT2 protein expression by a common mechanism most likely involving the Akt/PKB pathway and translational activation via mTOR. In conclusion, considering the roles of NA, insulin and IGF-1 in synaptic plasticity, the tight translational regulation of MCT2 expression by these substances may represent a common mechanism through which supply of potentiated synapses with nonglucose energy substrates can be adapted to the level of activity. Résumé du travail de thèse Le glucose représente le substrat énergétique majeur pour le cerveau. Cependant, dans certaines conditions physiologiques ou pathologiques, le cerveau a la capacité d'utiliser des substrats énergétiques appartenant à la classe des monocarboxylates (lactate, pyruvate et corps cétoniques) afin de satisfaire ses besoins énergétiques. Ces monocarboxylates doivent être transportés à travers la barrière hématoencéphalique mais aussi hors des astrocytes vers l'espace extracellulaire puis re-captés par les neurones. Leur transport est assuré par une famille de transporteurs spécifiques, protons-dépendants, appelés transporteurs aux monocarboxylates (MCTs). Dans le système nerveux central, les neurones expriment principalement l'isoforme MCT2 mais peu d'informations sont disponibles concernant la régulation de son expression. Il a été montré que le neurotransmetteur noradrénaline (NA) augmente l'expression de MCT2 dans les cultures de neurones corticaux de souris par le biais d'un mécanisme de régulation traductionnel. La présente étude nous a permis de démontrer que deux autres substances, l'insuline et 17GF-1, induisent une augmentation de la protéine MCT2 dans ces mêmes cultures selon un décours temporel et une gamme de concentrations particulière. Etonnamment, aucun changement n'a été observé concernant les niveaux d'ARNm de MCT2. Ce résultat .confirme que la protéine MCT2 est régulée de manière traductionnelle et révèle que différentes substances neuro-actives peuvent réguler l'expression de MCT2. Compte tenu de ces observations, nous avons voulu déterminer par quelle(s) voie(s) de signalisation la NA, l'insuline et l'IGF-1 exercent leur effet sur l'expression de MCT2. Dans un premier temps, nous avons pu observer par Western blot que ces trois substances activent la MAP kinase ERK ainsi que la kinase Akt via leur phasphorylation. De plus, la voie mTOR/S6K, connue pour son implication dans la régulation de l'initiation de la traduction est aussi fortement activée par ces trois substances. Dans un second temps, nous avons voulu déterminer I implication de chacune de ces voies de signalisation dans l'augmentation de l'expression de la protéine MCT2 observée après stimulation à la NA, à l'insuline et à l'IGF-1. Pour ce faire, nous avons utilisé des inhibiteurs spécifiques de chacune de ces voies. (Vous avons observé que les inhibiteurs des voies PI3 kinase et mTOR (LY294002 et rapamycin respectivement), prévenaient fortement l'augmentation de l'expression de MCT2 induite par la NA, l'insuline ou (IGF-1. A l'inverse, les inhibitions de la MAP kinase .kinase MEK ainsi que de la MAP kinase p38 (par l'utilisation des inhibiteurs spécifiques PD98059 et SB202190 respectivement) n'ont eu qu'un léger effet dans ces mêmes conditions. Ces résultats suggèrent que la NA, 'l'insuline et I~GF-1 régulent l'expression de la protéine MCT2 par un mécanisme commun impliquant probablement la voie Akt/PKB et l'activation de la traduction via mTOR. En conclusion, considérant l'implication de la NA, de l'insuline et de I`IGF-1 dans la plasticité synaptique, le contrôle traductionnel étroit exercé par ces substances sur l'expression de MCT2 pourrait être un moyen d'alimenter en substrats énergétiques autres que le glucose les synapses activées et également d'adapter l'approvisionnement en substrats énergétiques au niveau d'activité. Résumé « grand public » Le cerveau est un organe qui réalise des tâches complexes nécessitant un apport important en énergie. La principale source d'énergie du cerveau est le glucose. Bien que le cerveau ne représente que 2% de la masse corporelle, il consomme à lui seul plus de 25% du glucose et 20% de l'oxygène provenant de la circulation sanguine. La nécessité d'un tel apport en énergie réside dans la nature -même du fonctionnement des milliards de neurones qui utilisent des signaux électriques et chimiques pour communiquer entre eux. Hormis l'utilisation massive du glucose comme source d'énergie, le cerveau est capable de consommer d'autres substrats énergétiques dans certaines conditions physiologiques ou pathologiques. Les monocarboxylates (lactate, pyruvate et corps cétoniques) font partie de ces autres sources d'énergie. Contrairement au glucose, les monocarboxylates ne diffusent pas facilement de la circulation sanguine vers les neurones. Afin de pouvoir être consommés par les neurones, ils doivent être transportés par un système adapté. Ce sont des transporteurs appelés transporteurs aux monocarboxylates ou MCT qui permettent le passage de ces substrats énergétiques du sang vers les neurones. Le but de ce travail de thèse a été de comprendre comment est régulée l'expression de MCT2, l'un de ces transporteurs exprimé spécifiquement à la surface des neurones. Cette étude nous a permis de mettre en évidence que le neurotransmetteur noradrénaline ainsi que les hormones insuline et IGF-1 (insulinlike growth factor-1) sont capables d'induire une augmentation d'expression de MCT2 à la surface des neurones en culture. Nous avons ensuite voulu déterminer par quels mécanismes de signalisation ces substances agissent sur l'expression de MCT2. Nous avons pu observer que la surexpression de la protéine MCT2 est due à une augmentation d'activité traductionnelle (la traduction étant une des étapes qui permet la synthèse des protéines) induite par le biais d'une voie de signalisation particulière. En conclusion, lorsque la noradrénaline, l'insuline ou 17GF-1 agissent sur les neurones, la traduction de la protéine MCT2 est activée et on observe une augmentation de l'expression de MCT2. Ce mécanisme pourrait permettre d'augmenter l'apport énergétique au niveau des neurones en augmentant le nombre de transporteurs pour les substrats énergétiques que sont les monocarboxylates. D'un point de vue physiologique, cette régulation d'expression pourrait jouer un rôle primordial dans des situations d'apprentissage et de mémorisation. Sur le plan pathologique, cela pourrait permettre de prévenir les dommages causes aux neurones dans certains cas d'atteintes cérébrales.

Correlation between plasma concentration of cilazapril and haemodynamic and hormonal effects in healthy man.

1. The haemodynamic and humoral effects of cilazapril, a new angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitor, were evaluated in normotensive healthy volunteers. 2. Single oral doses of 1.25, 2.5, 5 and 10 mg of cilazapril inhibited ACE by greater than or equal to 90% and induced the expected pattern of changes of the renin-angiotensin-aldosterone-system. 3. Cilazapril had a long duration of action, since some ACE inhibition was still present 72 h after drug intake. 4. Cilazapril administered intravenously at doses of 5 and 20 micrograms kg-1 for 24 h did not produce any significant effects. 5. During repeated administration of cilazapril for 8 days, no accumulation of cilazaprilat was observed and the clinical tolerance was excellent. 6. In normal volunteers, cilazapril administered orally acts as a potent inhibitor of converting enzyme.

Hypertension artérielle pulmonaire primitive et maladie de Basedow [Primary pulmonary hypertension arterial and Basedow disease].

We report a case of a fifty year old woman with Graves' disease with positive AntiTPO antibodies and positive AntiTSH receptor antibodies, who was hospitalized with a right cardiac failure. A pulmonary hypertension was discovered on echocardiography. After adequate antithyroid therapy, the right cardiac failure regressed rapidly and pulmonary pressure normalised. An autoimmune process has often been proposed to explain the association between pulmonary hypertension and hyperthyroidism. We report the arguments supporting this autoimmune etiopathogenesis. We also discuss an other hypothesis based on a direct effect of thyroid hormones on the pulmonary circulation and the effects of high cardiac output associated with hyperthyroidism.