Assaying the regulatory potential of mammalian conserved non-coding sequences in human cells.

BACKGROUND: Conserved non-coding sequences in the human genome are approximately tenfold more abundant than known genes, and have been hypothesized to mark the locations of cis-regulatory elements. However, the global contribution of conserved non-coding sequences to the transcriptional regulation of human genes is currently unknown. Deeply conserved elements shared between humans and teleost fish predominantly flank genes active during morphogenesis and are enriched for positive transcriptional regulatory elements. However, such deeply conserved elements account for <1% of the conserved non-coding sequences in the human genome, which are predominantly mammalian. RESULTS: We explored the regulatory potential of a large sample of these 'common' conserved non-coding sequences using a variety of classic assays, including chromatin remodeling, and enhancer/repressor and promoter activity. When tested across diverse human model cell types, we find that the fraction of experimentally active conserved non-coding sequences within any given cell type is low (approximately 5%), and that this proportion increases only modestly when considered collectively across cell types. CONCLUSIONS: The results suggest that classic assays of cis-regulatory potential are unlikely to expose the functional potential of the substantial majority of mammalian conserved non-coding sequences in the human genome.

Experimental and computational approaches to quantitative proteomics: status quo and outlook.

Proteomics has come a long way from the initial qualitative analysis of proteins present in a given sample at a given time ("cataloguing") to large-scale characterization of proteomes, their interactions and dynamic behavior. Originally enabled by breakthroughs in protein separation and visualization (by two-dimensional gels) and protein identification (by mass spectrometry), the discipline now encompasses a large body of protein and peptide separation, labeling, detection and sequencing tools supported by computational data processing. The decisive mass spectrometric developments and most recent instrumentation news are briefly mentioned accompanied by a short review of gel and chromatographic techniques for protein/peptide separation, depletion and enrichment. Special emphasis is placed on quantification techniques: gel-based, and label-free techniques are briefly discussed whereas stable-isotope coding and internal peptide standards are extensively reviewed. Another special chapter is dedicated to software and computing tools for proteomic data processing and validation. A short assessment of the status quo and recommendations for future developments round up this journey through quantitative proteomics.

Identifying protein-coding genes in genomic sequences.

The vast majority of the biology of a newly sequenced genome is inferred from the set of encoded proteins. Predicting this set is therefore invariably the first step after the completion of the genome DNA sequence. Here we review the main computational pipelines used to generate the human reference protein-coding gene sets.

Error and attack tolerance of layered complex networks.

Many complex systems may be described by not one but a number of complex networks mapped on each other in a multi-layer structure. Because of the interactions and dependencies between these layers, the state of a single layer does not necessarily reflect well the state of the entire system. In this paper we study the robustness of five examples of two-layer complex systems: three real-life data sets in the fields of communication (the Internet), transportation (the European railway system), and biology (the human brain), and two models based on random graphs. In order to cover the whole range of features specific to these systems, we focus on two extreme policies of system's response to failures, no rerouting and full rerouting. Our main finding is that multi-layer systems are much more vulnerable to errors and intentional attacks than they appear from a single layer perspective.

Mapping of the genes coding for the two major vaccinia virus core polypeptides.

We have mapped the genes coding for two major structural polypeptides of the vaccinia virus core by hybrid selection and transcriptional mapping. First, RNA was selected by hybridization to restriction fragments of the vaccinia virus genome, translated in vitro and the products were immunoprecipitated with antibodies against the two polypeptides. This approach allowed us to map the genes to the left hand end of the largest Hind III restriction fragment of 50 kilobase pairs. Second, transcriptional mapping of this region of the genome revealed the presence of the two expected RNAs. Both RNAs are transcribed from the leftward reading strand and the 5'-ends of the genes are separated by about 7.5 kilobase pairs of DNA. Thus, two genes encoding structural polypeptides with a similar location in the vaccinia virus particle are clustered at approximately 105 kilobase pairs from the left hand end of the 180 kilobase pair vaccinia virus genome.

L'erreur en médecine ambulatoire: comment l'aborder. [Error in ambulatory medicine: how to deal with it?]

Medical errors compromise patient safety in ambulatory practice. These errors must be faced in a framework that reduces to a minimum their consequences for the patients. This approach relies on the implementation of a new culture without stigmatization and where errors are disclosed to the patients; this culture implies the build up of a system for reporting errors associated to an in-depth analysis of the system, looking for root causes and insufficient barriers with the aim to fix them. A useful education tool is the "critical situations" meeting during which physicians are encouraged to openly present adverse events and "near misses". Their analysis, with supportive attitude towards involved staff members, allows to reveal systems failures within the institution or the private practice.

A genetic isolation gradient of populations of the Balearic green toad (Bufo balearicus) follows rising eastward fragmentation of the rural landscapes on the island of Menorca.

We present the first approach to the genetic diversity and structure of the Balearic toad (Bufo balearicus Boettger, 1880) for the island of Menorca. Forty-one individ- uals from 21 localities were analyzed for ten microsatellite loci. We used geo-refer- enced individual multilocus genotypes and a model-based clustering method for the inference of the number of populations and of the spatial location of genetic dis- continuities between those populations.¦Only six of the microsatellites analyzed were polymorphic. We revealed a northwest- ern area inhabited by a single population with several well-connected localities and another set of populations in the southeast that includes a few unconnected small units with genetically significant differences among them as well as with the individ- uals from the northwest of the island. The observed fragmentation may be explained by shifts from agricultural to tourism practices that have been taking place on the island of Menorca since the 1960s. The abandonment of rural activities in favor of urbanization and concomitant service areas has mostly affected the southeast of the island and is currently threatening the overall geographic connectivity between the different farming areas of the island that are inhabited by the Balearic toad.

Isolation and characterization of 21 microsatellite markers in the barn owl (Tyto alba).

We report 21 new polymorphic microsatellite markers in the European barn owl (Tyto alba). The polymorphism of the reported markers was evaluated in a population situated in western Switzerland and in another from Tenerife, Canary Islands. The number of alleles per locus varies between two and 31, and expected heterozygosity per population ranges from 0.16 to 0.95. All loci are in Hardy-Weinberg equilibrium and no linkage disequilibrium was detected. Two loci exhibit a null allele in the Tenerife population.

Random measurement error and regression dilution bias.

Summary points: - The bias introduced by random measurement error will be different depending on whether the error is in an exposure variable (risk factor) or outcome variable (disease) - Random measurement error in an exposure variable will bias the estimates of regression slope coefficients towards the null - Random measurement error in an outcome variable will instead increase the standard error of the estimates and widen the corresponding confidence intervals, making results less likely to be statistically significant - Increasing sample size will help minimise the impact of measurement error in an outcome variable but will only make estimates more precisely wrong when the error is in an exposure variable

Evolutionary dynamics of coding and non-coding transcriptomes.

Gene expression changes may underlie much of phenotypic evolution. The development of high-throughput RNA sequencing protocols has opened the door to unprecedented large-scale and cross-species transcriptome comparisons by allowing accurate and sensitive assessments of transcript sequences and expression levels. Here, we review the initial wave of the new generation of comparative transcriptomic studies in mammals and vertebrate outgroup species in the context of earlier work. Together with various large-scale genomic and epigenomic data, these studies have unveiled commonalities and differences in the dynamics of gene expression evolution for various types of coding and non-coding genes across mammalian lineages, organs, developmental stages, chromosomes and sexes. They have also provided intriguing new clues to the regulatory basis and phenotypic implications of evolutionary gene expression changes.

Establishment of models to study mouse and human retinogenesis "in vitro" : isolation and characterization of retinal stem cells

SUMMARY IN FRENCH Les cellules souches sont des cellules indifférenciées capables a) de proliférer, b) de s'auto¬renouveller, c) de produire des cellules différenciées, postmitotiques et fonctionnelles (multipotencialité), et d) de régénérer le tissu après des lésions. Par exemple, les cellules de souches hematopoiétiques, situées dans la moelle osseuse, peuvent s'amplifier, se diviser et produire diverses cellules différenciées au cours de la vie, les cellules souches restant dans la moelle osseuse et consentant leur propriété. Les cellules souches intestinales, situées dans la crypte des microvillosités peuvent également régénérer tout l'intestin au cours de la vie. La rétine se compose de six classes de neurones et d'un type de cellule gliale. Tous ces types de cellules sont produits par un progéniteur rétinien. Le pic de production des photorécepteurs se situe autour des premiers jours postnatals chez la souris. A cette période la rétine contient les cellules hautement prolifératives. Dans cette étude, nous avons voulu analyser le phénotype de ces cellules et leur potentiel en tant que cellules souches ou progénitrices. Nous nous sommes également concentrés sur l'effet de certains facteurs épigéniques sur leur destin cellulaire. Nous avons observé que toutes les cellules prolifératives isolées à partir de neurorétines postnatales de souris expriment le marqueur de glie radiaire RC2, ainsi que des facteurs de transcription habituellement trouvés dans la glie radiaire (Mash1, Pax6), et répondent aux critères des cellules souches : une capacité élevée d'expansion, un état indifférencié, la multipotencialité (démontrée par analyse clonale). Nous avons étudié la différentiation des cellules dans différents milieux de culture. En l'absence de sérum, l'EGF induit l'expression de la β-tubulin-III, un marqueur neuronal, et l'acquisition d'une morphologie neuronale, ceci dans 15% des cellules présentes. Nous avons également analysé la prolifération de cellules. Seulement 20% des cellules incorporent le bromodéoxyuridine (BrdU) qui est un marqueur de division cellulaire. Ceci démontre que l'EGF induit la formation des neurones sans une progression massive du cycle cellulaire. Par ailleurs, une stimulation de 2h d'EGF est suffisante pour induire la différentiation neuronale. Certains des neurones formés sont des cellules ganglionnaires rétiniennes (GR), comme l'indique l'expression de marqueurs de cellules ganglionnaires (Ath5, Brn3b et mélanopsine), et dans de rare cas d'autres neurones rétiniens ont été observés (photorécepteurs (PR) et cellules bipolaires). Nous avons confirmé que les cellules souches rétiniennes tardives n'étaient pas restreintes au cours du temps et qu'elles conservent leur multipotencialité en étant capables de générer des neurones dits précoces (GR) ou tardifs (PR). Nos résultats prouvent que l'EGF est non seulement un facteur contrôlant le développement glial, comme précédemment démontré, mais également un facteur efficace de différentiation pour les neurones rétiniens, du moins in vitro. D'autre part, nous avons voulu établir si l'oeil adulte humain contient des cellules souches rétiniennes (CSRs). L'oeil de certains poissons ou amphibiens continue de croître pendant l'âge adulte du fait de l'activité persistante des cellules souches rétiniennes. Chez les poissons, le CSRs se situe dans la marge ciliaire (CM) à la périphérie de la rétine. Bien que l'oeil des mammifères ne se développe plus pendant la vie d'adulte, plusieurs groupes ont prouvé que l'oeil de mammifères adultes contient des cellules souches rétiniennes également dans la marge ciliaire plus précisément dans l'épithélium pigmenté et non dans la neurorétine. Ces CSRs répondent à certains critères des cellules souches. Nous avons identifié et caractérisé les cellules souches rétiniennes résidant dans l'oeil adulte humain. Nous avons prouvé qu'elles partagent les mêmes propriétés que leurs homologues chez les rongeurs c.-à-d. auto-renouvellement, amplification, et différenciation en neurones rétiniens in vitro et in vivo (démontré par immunocoloration et microarray). D'autre part, ces cellules peuvent être considérablement amplifiées, tout en conservant leur potentiel de cellules souches, comme indiqué par l'analyse de leur profil d'expression génique (microarray). Elles expriment également des gènes communs à diverses cellules souches: nucleostemin, nestin, Brni1, Notch2, ABCG2, c-kit et son ligand, aussi bien que cyclin D3 qui agit en aval de c-kit. Nous avons pu montré que Bmi1et Oct4 sont nécessaires pour la prolifération des CSRs confortant leur propriété de cellules souches. Nos données indiquent que la neurorétine postnatale chez la souris et l'épithélium pigmenté de la marge ciliaire chez l'humain adulte contiennent les cellules souches rétiniennes. En outre, nous avons développé un système qui permet d'amplifier et de cultiver facilement les CSRs. Ce modèle permet de disséquer les mécanismes impliqués lors de la retinogenèse. Par exemple, ce système peut être employé pour l'étude des substances ou des facteurs impliqués, par exemple, dans la survie ou dans la génération des cellules rétiniennes. Il peut également aider à disséquer la fonction de gènes ou les facteurs impliqués dans la restriction ou la spécification du destin cellulaire. En outre, dans les pays occidentaux, la rétinite pigmentaire (RP) touche 1 individu sur 3500 et la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) affecte 1 % à 3% de la population âgée de plus de 60 ans. La génération in vitro de cellules rétiniennes est aussi un outil prometteur pour fournir une source illimitée de cellules pour l'étude de transplantation cellulaire pour la rétine. SUMMARY IN ENGLISH Stem cells are defined as undifferentiated cells capable of a) proliferation, b) self maintenance (self-renewability), c) production of many differentiated functional postmitotic cells (multipotency), and d) regenerating tissue after injury. For instance, hematopoietic stem cells, located in bone marrow, can expand, divide and generate differentiated cells into the diverse lineages throughout life, the stem cells conserving their status. In the villi crypt, the intestinal stem cells are also able to regenerate the intestine during their life time. The retina is composed of six classes of neurons and one glial cell. All these cell types are produced by the retinal progenitor cell. The peak of photoreceptor production is reached around the first postnatal days in rodents. Thus, at this stage the retina contains highly proliferative cells. In our research, we analyzed the phenotype of these cells and their potential as possible progenitor or stem cells. We also focused on the effect of epigenic factor(s) and cell fate determination. All the proliferating cells isolated from mice postnatal neuroretina harbored the radial glia marker RC2, expressed transcription factors usually found in radial glia (Mash 1, Pax6), and met the criteria of stem cells: high capacity of expansion, maintenance of an undifferentiated state, and multipotency demonstrated by clonal analysis. We analyzed the differentiation seven days after the transfer of the cells in different culture media. In the absence of serum, EGF led to the expression of the neuronal marker β-tubulin-III, and the acquisition of neuronal morphology in 15% of the cells. Analysis of cell proliferation by bromodeoxyuridine incorporation revealed that EGF mainly induced the formation of neurons without stimulating massively cell cycle progression. Moreover, a pulse of 2h EGF stimulation was sufficient to induce neuronal differentiation. Some neurons were committed to the retinal ganglion cell (RGC) phenotype, as revealed by the expression of retinal ganglion markers (Ath5, Brn3b and melanopsin), and in few cases to other retinal phenotypes (photoreceptors (PRs) and bipolar cells). We confirmed that the late RSCs were not restricted over-time and conserved multipotentcy characteristics by generating retinal phenotypes that usually appear at early (RGC) or late (PRs) developmental stages. Our results show that EGF is not only a factor controlling glial development, as previously shown, but also a potent differentiation factor for retinal neurons, at least in vitro. On the other hand, we wanted to find out if the adult human eye contains retina stem cells. The eye of some fishes and amphibians continues to grow during adulthood due to the persistent activity of retinal stem cells (RSCs). In fish, the RSCs are located in the ciliary margin zone (CMZ) at the periphery of the retina. Although, the adult mammalian eye does not grow during adult life, several groups have shown that the adult mouse eye contains retinal stem cells in the homologous zone (i.e. the ciliary margin), in the pigmented epithelium and not in the neuroretina. These RSCs meet some criteria of stem cells. We identified and characterized the human retinal stem cells. We showed that they posses the same features as their rodent counterpart i.e. they self-renew, expand and differentiate into retinal neurons in vitro and in vivo (indicated by immunostaining and microarray analysis). Moreover, they can be greatly expanded while conserving their sternness potential as revealed by the gene expression profile analysis (microarray approach). They also expressed genes common to various stem cells: nucleostemin, nestin, Bmil , Notch2, ABCG2, c-kit and its ligand, as well as cyclin D3 which acts downstream of c-kit. Furthermore, Bmil and Oct-4 were required for RSC proliferation reinforcing their stem cell identity. Our data indicate that the mice postnatal neuroretina and the adult pigmented epithelium of adult human ciliary margin contain retinal stem cells. We developed a system to easily expand and culture RSCs that can be used to investigate the retinogenesis. For example, it can help to screen drugs or factors involved, for instance, in the survival or generation of retinal cells. This could help to dissect genes or factors involved in the restriction or specification of retinal cell fate. In Western countries, retinitis pigmentosa (RP) affects 1 out of 3'500 individuals and age-related macula degeneration (AMD) strikes 1 % to 3% of the population over 60. In vitro generation of retinal cells is thus a promising tool to provide an unlimited cell source for cellular transplantation studies in the retina.

Why human islets die? analysis of death signaling pathways during isolation and following cytokine treatments

RESUME Le diabète de type 1 se définit comme un désordre métabolique d'origine auto-immune qui aboutit à la destruction progressive et sélective de la cellule ß-pancréatique sécrétrice d'insuline. Cette maladie représente 10 % des cas de diabète enregistrés dans la population mondiale, et touche les jeunes de moins de 20 ans. Le traitement médical par insulinothérapie corrige le manque d'hormone mais ne prévient pas les nombreuses complications telles que les atteintes cardiaques, neurologiques, rénales, rétiniennes, et les amputations que la maladie provoque. Le remplacement de la cellule ß par transplantation d'îlots de Langerhans est une alternative prometteuse au traitement médical du diabète de type 1. Cependant la greffe d'îlots est encore un traitement expérimental et ne permet pas un contrôle efficace de la glycémie au long terme chez les patients transplantés, et les raisons de cet échec restent mal comprises. L'obstacle immédiat qui se pose est la purification d'un nombre suffisant d'îlots viables et la perte massive de ces îlots dans les premières heures suite à la greffe. Cette tendance presque systématique de la perte fonctionnelle du greffon immédiatement après la transplantation est connue sous le terme de « primary graft non-function » (PNF). En effet, la procédure d'isolement des îlots provoque la destruction des composantes cellulaires et non cellulaires du tissu pancréatique qui jouent un rôle déterminant dans le processus de survie de l'îlot. De plus, la transplantation elle-même expose les cellules à différents stress, notamment le stress par les cytokines inflammatoires qui encourage la mort cellulaire par apoptose et provoque par la suite le rejet de la greffe. L'ensemble de ces mécanismes aboutit a une perte de la masse d'îlot estimée a plus de 60%. Dans ce contexte, nous nous sommes intéressés à définir les voies majeures de stress qui régissent cette perte massive d'îlot par apoptose lors du processus d'isolement et suite à l'exposition immédiate aux cytokines. L'ensemble des résultats obtenus indique que plusieurs voies de signalisation intracellulaire sont recrutées qui s'activent de manière maximale très tôt lors des premières phases de l'isolement. La mise en culture des îlots deux jours permet aux voies activées de revenir aux taux de base. De ce fait nous proposons une stratégie dite de protection qui doit être 1) initiée aussitôt que possible lors de l'isolement des îlots pancréatiques, 2) devrait probablement bloquer l'activation de ces différentes voies de stress mis en évidence lors de notre étude et 3) devrait inclure la mise en culture des îlots purifiés deux jours après l'isolement et avant la transplantation. RESUME LARGE PUBLIC Le diabète est une maladie qui entraîne un taux anormalement élevé de sucre (glucose) dans le sang du à une insuffisance du pancréas endocrine à produire de l'insuline, une hormone qui régule la glycémie (taux de glucose dans le sang). On distingue deux types majeurs de diabètes; le diabète de type 1 ou juvénile ou encore appelé diabète maigre qui se manifeste souvent pendant l'enfance et qui se traduit par une déficience absolue en insuline. Le diabète de type 2 ou diabète gras est le plus fréquent, et touche les sujets de plus de 40 ans qui souffrent d'obésité et qui se traduit par une dysfonction de la cellule ß avec une incapacité à réguler la glycémie malgré la production d'insuline. Dans le diabète de type 1, la destruction de la cellule ß est programmée (apoptose) et est majoritairement provoquée par des médiateurs inflammatoires appelés cytokines qui sont produites localement par des cellules inflammatoires du système immunitaire qui envahissent la cellule ß-pancréatiques. Les cytokines activent différentes voies de signalisation parmi lesquelles on distingue celles des Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPKs) composées de trois familles de MAPKs: ERK1/2, p38, et JNK, et la voie NF-κB. Le traitement médical par injections quotidiennes d'insuline permet de contrôler la glycémie mais ne prévient pas les nombreuses complications secondaires liées à cette maladie. La greffe d'îlots de Langerhans est une alternative possible au traitement médical, considérée avantageuse comparée a la greffe du pancréas entier. En effet l'embolisation d'îlots dans le foie par injection intraportale constitue une intervention simple sans complications majeures. Néanmoins la technique de préparation d'îlots altère la fonction endocrine et cause la perte massive d'îlots pancréatiques. De plus, la transplantation elle-même expose la cellule ß à différents stress, notamment le stress par les cytokines inflammatoires qui provoque le rejet de greffon cellulaire. Dans la perspective d'augmenter les rendements des îlots purifiés, nous nous sommes intéressés à définir les voies majeures de stress qui régissent cette perte massive d'îlot lors du processus d'isolement et suite à l'exposition immédiate aux cytokines après transplantation. L'ensemble de ces résultats indique que le stress induit lors de l'isolement des îlots et celui des cytokines recrute différentes voies de signalisation intracellulaire (JNK, p38 et NF-κB) qui s'additionnent entre-elles pour altérer la fonction et la viabilité de l'îlot. De ce fait une stratégie doit être mise en place pour bloquer toute action synergique entre ces différentes voies activées pour améliorer la viabilité et la fonction de la cellule ß lors du greffon cellulaire. SUMMARY Type 1 diabetes mellitus (T1DM) is an autoimmune disease characterized by the progressive and selective destruction of the pancreatic ß-cells that secrete insulin, leading to absolute insulin deficiency. T1DM accounts for about 10% of all diabetes cases, affecting persons younger than 20 years of age. Medical treatment using daily exogenous insulin injection corrects hormone deficiency but does not prevent devastating complications such as heart attack, neuropathy, kidney failure, blindness, and amputation caused by the disease. Pancreatic islet transplantation (PIT) is one strategy that holds promise to cure patients with T1DM, but purified pancreatic islet grafts have failed to maintain long-term glucose homeostasis in human recipients, the reasons for this failure being still poorly understood. There is however a more immediate problem with islet grafting that is dependent upon poor islet recovery from donors and early islet loss following the first hours of grafting. This tendency of islet grafts to fail to function within a short period after transplantation is termed primary graft non-function (PNF). Indeed, the islet isolation procedure itself destroys cellular and non-cellular components of the pancreas that may play a role in supporting islet survival. Further, islet transplantation exposes cells to a variety of stressful stimuli, notably pro-inflammatory cytokines that encourage ß-cell death by apoptosis and lead to early graft failure. Altogether these mechanisms lead to an estimated loss of 60% of the total islet mass. Here, we have mapped the major intracellular stress signaling pathways that may mediate human islet loss by apoptosis during isolation and following cytokine attack. We found that several stress pathways are maximally activated from the earliest stages of the isolation procedure. Culturing islet for two days allow for the activated pathways to return to basal levels. We propose that protective strategies should 1) be initiated as early as possible during isolation of the islets, 2) should probably target the activated stress pathways that we uncovered during our studies and 3) should include culturing islets for two days post-isolation and prior transplantation.