Decreased specific CD8+ T cell cross-reactivity of antigen recognition following vaccination with Melan-A peptide.

The aim of T cell vaccines is the expansion of antigen-specific T cells able to confer immune protection against pathogens or tumors. Although increase in absolute cell numbers, effector functions and TCR repertoire of vaccine-induced T cells are often evaluated, their reactivity for the cognate antigen versus their cross-reactive potential is rarely considered. In fact, little information is available regarding the influence of vaccines on T cell fine specificity of antigen recognition despite the impact that this feature may have in protective immunity. To shed light on the cross-reactive potential of vaccine-induced cells, we analyzed the reactivity of CD8(+) T cells following vaccination of HLA-A2(+) melanoma patients with Melan-A peptide, incomplete Freund's adjuvant and CpG-oligodeoxynucleotide adjuvant, which was shown to induce strong expansion of Melan-A-reactive CD8(+) T cells in vivo. A collection of predicted Melan-A cross-reactive peptides, identified from a combinatorial peptide library, was used to probe functional antigen recognition of PBMC ex vivo and Melan-A-reactive CD8(+) T cell clones. While Melan-A-reactive CD8(+) T cells prior to vaccination are usually constituted of widely cross-reactive naive cells, we show that peptide vaccination resulted in expansion of memory T cells displaying a reactivity predominantly restricted to the antigen of interest. Importantly, these cells are tumor-reactive.

Dissecting TCR-MHC/peptide complex interactions with A2/peptide multimers incorporating tumor antigen peptide variants: crucial role of interaction kinetics on functional outcomes.

Soluble peptide/MHC-class-I (pMHC) multimers have recently emerged as unique reagents for the study of specific interactions between the pMHC complex and the TCR. Here, we assessed the relative binding efficiency of a panel of multimers incorporating single-alanine-substituted variants of the tumor-antigen-derived peptide MAGE-A10(254-262) to specific CTL clones displaying different functional avidity. For each individual clone, the efficiency of binding of multimers incorporating MAGE-A10 peptide variants was, in most cases, in good although not linear correlation with the avidity of recognition of the corresponding variant. In addition, we observed two types of discrepancies between efficiency of recognition and multimer binding. First, for some peptide variants, efficient multimer binding was detected in the absence of measurable effector functions. Some of these peptide variants displayed antagonist activity. Second, when comparing different clones we found clear discrepancies between the dose of peptide required to obtain half-maximal lysis in CTL assays and the binding efficiency of the corresponding multimers. These discrepancies, however, were resolved when the differential stability of the TCR/pMHC complexes was determined. For individual clones, decreased recognition correlated with increased TCR/pMHC off-rate. TCR/pMHC complexes formed by antagonist ligands displayed off-rates faster than those of TCR/pMHC complexes formed with weak agonists. In addition, when comparing different clones, the efficiency of multimer staining correlated better with relative multimer off-rates than with half-maximal lysis values. Altogether, the data presented here reconcile and extend our previous results on the impact of the kinetics of interaction of TCR with pMHC complexes on multimer binding and underline the crucial role of TCR/pMHC off-rates for the functional outcome of such interactions.

The role of interleukin-2 in memory CD8 cell differentiation.

The current literature on the role of interleukin (IL)-2 in memory CD8+ T-cell differentiation indicates a significant contribution of IL-2 during primary and also secondary expansion of CD8+ T cells. IL-2 seems to be responsible for optimal expansion and generation of effector functions following primary antigenic challenge. As the magnitude of T-cell expansion determines the numbers of memory CD8+ T cells surviving after pathogen elimination, these event influence memory cell generation. Moreover, during the contraction phase of an immune respons where most antigen-specific CD8+ T cells disappear by apoptosis, IL-2 signals are able to rescu CD8+ T cells from cell death and provide a durable increase in memory CD8+ T-cell counts. At the memory stage, CD8+ T-cell frequencies can be boosted by administration of exogenous IL-2 Significantly, only CD8+ T cells that have received IL-2 signals during initial priming are able t mediate efficient secondary expansion following renewed antigenic challenge. Thus, IL-2 signals during different phases of an immune response are key in optimizing CD8+ T-cell functions, thereby affecting both primary and secondary responses of these T cells.

Analysis of antiviral immunity in primary and chronic infections

Several evidences in humans underscored the contribution of CD4 and CD8 T-cell responses in controlling viral and bacterial infections. However, CD4 and CD8 Τ cells have distinct and specific effector functions leading to a hierarchical importance in responding to different types of pathogens. In this context, the present work aimed to investigate distinct CD8 T-cell features potentially influencing T-cell efficacy against viral infection. To achieve this-objective, CD8 Τ cells derived from HIV-infected patients and healthy donors harbouring virus-specific immune responses or immunized with an HTV vaccine candidate were studied. In particular, we performed a comprehensive cross-sectional and longitudinal analysis to characterize the function, the phenotype and the functional avidity of HIV-specific CD8 Τ cells during acute (PHI) and chronic infection and, in particular, we investigated immunological parameters potentially associated with the functional avidity of HIV-specific CD8 Τ cells. In addition, we studied the expression pattern of co-inhibitory molecules and the influence of CD 160 on the functions of CD8 Τ cells in absence of chronic infections. From these analyses we observed that the functional avidity of HIV-specific CD8 T- cell responses was significantly lower in acute than in chronic infection, but was not different between chronic progressive and non-progressive patients. Functional avidity remained low after several years of antiretroviral therapy in PHI patients, but increased in patients experiencing a virus rebound following treatment interruption in association with a massive renewal of the global CD8 complementarity-determining region 3 of the TCR. The functional avidity was also directly associated to T-cell exhaustion. In individuals with no sign of HIV or Hepatitis A, Β or C virus infection, CD8 Τ cells expressed higher levels of co-inhibitory molecules than CD4 Τ cells and this was dependent on the stage of T-cell differentiation and activation. The expression of CD 160 impaired the proliferation capacity and IL-2 production of CD8 Τ cells and was reduced upon CD8 T-cell activation, entitling CD 160 as unique marker of CD8 T-cell exhaustion. The CD 160 blockade restored the proliferation capacity of virus-specific CD8 Τ cells providing a potential new target for immunotherapy. All together, these results expand our knowledge regarding the interplay between the immune system and the viruses. - De nombreuses études chez l'Homme ont mis en évidence la contribution des réponses cellulaires Τ CD4 et CD8 dans le contrôle des infections virales et bactériennes. En particulier, les lymphocytes Τ ont différentes fonctions effectrices spécifiques qui leur confèrent un rôle clé lors d'infections par différents pathogènes. Ce travail vise à étudier différentes caractéristiques des cellules Τ CD8 affectant l'efficacité des réponses cellulaires contre les virus. Pour atteindre cet objectif nous avons étudié les cellules Τ CD8 provenant de patients infectés par le VIH et de donneurs sains avec des réponses immunitaires naturelles ou vaccinales contre des virus. Nous avons effectué plusieurs analyses transversales et longitudinales des fonctions, du phénotype et de l'avidité fonctionnelle des lymphocytes Τ CD8 spécifiques au VIH au cours d'infections aiguës et chroniques; en particulier, nous avons étudié les paramètres immunologiques qui pourraient être associés à l'avidité fonctionnelle. De plus, nous avons investigué le profil d'expression des principales molécules co-inhibitrices et en particulier le rôle du CD 160 dans les fonctions des lymphocytes Τ CD8. Sur la base de ces analyses, nous avons constaté que l'avidité fonctionnelle des cellules Τ CD8 spécifiques au VIH était significativement plus faible lors infections aiguës que lors d'infections chroniques, mais n'était, par contre, pas différente entre les patients avec des infections chroniques progressives et non progressives. L'avidité fonctionnelle reste faible après plusieurs années de traitement antirétroviral, mais augmente chez les patients subissant un rebond viral, et donc exposés à des hautes virémies, suite à l'interruption du traitement. Cette augmentation d'avidité des lymphocytes Τ CD8, liée à un épuisement fonctionnel accru, était quantitativement directement associée à un renouvellement massif du TCR. Indépendamment de l'infection par le VIH, les cellules Τ CD8 expriment des niveaux plus élevés de molécules co-inhibitrices (PD-1, 2B4 et CD 160) par rapport aux cellules Τ CD4 et ceci dépend de leur stade de différenciation et d'activation. En particulier, CD 160 semble être un marqueur clé d'épuisement cellulaire des cellules Τ CD8, et donc une nouvelle cible potentielle pour l'immunothérapie, car a) son expression réduit la capacité proliférative et la production d'IL-2 b) CD 160 diminue suite à 1'activation et c) le blocage de CD 160 redonne la capacité proliférative aux cellules Τ CD8 spécifiques aux virus. - Le système immunitaire est un ensemble de cellules, tissus et organes indispensables pour limiter l'entrée des pathogènes à travers la peau et les muqueuses. Parmi les différentes cellules composant le système immunitaire, les cellules Τ CD4 et CD8 sont fondamentales pour le contrôle des infections virales et bactériennes. Les moyens pour combattre les différents pathogènes peuvent être cependant très variables. Les cellules Τ CD8, qui sont indispensables pour la lutte contre les virus, peuvent avoir différents niveaux de sensibilité; les cellules qui répondent à de faibles quantités d'antigène ont une forte sensibilité. Suite à une première infection virale, les cellules Τ CD8 ont une sensibilité plus faible que lors d'expositions répétées au même virus. En effet, la réexposition au pathogène induit une augmentation de sensibilité, grâce au recrutement et/ou à l'expansion de cellules Τ dotées d'une sensibilité plus élevée. Les cellules Τ CD8 avec une plus haute sensibilité semblent être caractérisées par une perte de fonctionnalité (épuisement fonctionnel associé à une haute expression de molécules dites inhibitrices). En absence d'infection, la fonction des molécules inhibitrices n'est pas encore clairement définie. Les cellules Τ CD8 montrent un niveau d'expression plus élevé de ces molécules par rapport aux cellules Τ CD4. Ceci dépend de l'état des cellules. Parmi ces molécules, le CD160 est associé à l'incapacité des cellules à proliférer et à produire de l'IL-2, une protéine importante pour la prolifération et la survie cellulaire. L'incapacité des cellules exprimant le CD 160 à proliférer en réponse à des virus peut être restaurée par le blocage fonctionnel du récepteur CD 160. Cette étude étoffe notre connaissance du rôle des cellules Τ CD8 ainsi que des conséquences induites par leur épuisement fonctionnel. Ces informations sont fondamentales pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques et vaccinales.

High frequency of functionally active Melan-a-specific T cells in a patient with progressive immunoproteasome-deficient melanoma.

Tumor-reactive T cells play an important role in cancer immunosurveillance. Applying the multimer technology, we report here an unexpected high frequency of Melan-A-specific CTLs in a melanoma patient with progressive lymph node metastases, consisting of 18 and 12.8% of total peripheral blood and tumor-infiltrating CD8+ T cells, respectively. Melan-A-specific CTLs revealed a high cytolytic activity against allogeneic Melan-A-expressing target cells but failed to kill the autologous tumor cells. Loading of the tumor cells with Melan-A peptide reversed the resistance to killing, suggesting impaired function of the MHC class I antigen processing and presentation pathway. Mutations of the coding region of the HLA-A2 binding Melan-A26-35 peptide or down-regulation of the MHC class I heavy chain, the antigenic peptide TAP, and tapasin could be excluded. However, PCR and immunohistochemical analysis revealed a deficiency of the immunoproteasomes low molecular weight protein 2 and low molecular weight protein 7 in the primary tumor cells, which affects the quantity and quality of generated T-cell epitopes and might explain the resistance to killing. This is supported by our data, demonstrating that the resistance to killing can be partially reversed by pre-exposure of the tumor cells to IFN-gamma, which is known to induce the immunoproteasomes. Overall, this is the first report of an extremely high frequency of tumor-specific CTLs that exhibit competent T-cell-effector functions but fail to lyse the autologous tumor cells. Immunotherapeutic approaches should not only focus on the induction of a robust antitumor immune response, but should also have to target tumor immune escape mechanisms.

Characterization of CD4+ CD25+ T cells in solid organ transplant recipients

Although important progresses have been achieved in the therapeutic management of transplant recipients, acute and chronic rejections remain the leading causes of premature graft loss after solid organ transplantation. This, together with the undesirable side effects of immunosuppressive drugs, has significant implications for the long-term outcome of transplant recipients. Thus, a better understanding of the immunological events occurring after transplantation is essential. The immune system plays an ambivalent role in the outcome of a graft. On one hand, some T lymphocytes with effector functions (called alloreactive) can mediate a cascade of events eventually resulting in the rejection, either acute or chronic, of the grafted organ ; on the other hand, a small subset of T lymphocytes, called regulatory T cells, has been shown to be implicated in the control of these harmful rejection responses, among other things. Thus, we focused our interest on the study of the balance between circulating effectors (alloreactive) and regulatory T lymphocytes, which seems to play an important role in the outcome of allografts, in the context of kidney transplantation. The results were correlated with various variables such as the clinical status of the patients, the immunosuppressive drugs used as induction or maintenance agents, and past or current episodes of rejection. We observed that the percentage of the alloreactive T lymphocyte population was correlated with the clinical status of the kidney transplant recipients. Indeed, the highest percentage was found in patients suffering from chronic humoral rejection, whilst patients on no or only minimal immunosuppressive treatment or on sirolimus-based immunosuppression displayed a percentage comparable to healthy non-transplanted individuals. During the first year after renal transplantation, the balance between effectors and regulatory T lymphocytes was tipped towards the detrimental effector immune response, with the two induction agents studied (thymoglobulin and basiliximab). Overall, these results indicate that monitoring these immunological parameters may be very useful for the clinical follow-up of transplant recipients ; these tests may contribute to identify patients who are more likely to develop rejection or, on the contrary, who tolerate well their graft, in order to adapt the immunosuppressive treatment on an individual basis.

Mammalian target of rapamycin complex 1 orchestrates invariant NKT cell differentiation and effector function.

Invariant NKT (iNKT) cells play critical roles in bridging innate and adaptive immunity. The Raptor containing mTOR complex 1 (mTORC1) has been well documented to control peripheral CD4 or CD8 T cell effector or memory differentiation. However, the role of mTORC1 in iNKT cell development and function remains largely unknown. By using mice with T cell-restricted deletion of Raptor, we show that mTORC1 is selectively required for iNKT but not for conventional T cell development. Indeed, Raptor-deficient iNKT cells are mostly blocked at thymic stage 1-2, resulting in a dramatic decrease of terminal differentiation into stage 3 and severe reduction of peripheral iNKT cells. Moreover, residual iNKT cells in Raptor knockout mice are impaired in their rapid cytokine production upon αGalcer challenge. Bone marrow chimera studies demonstrate that mTORC1 controls iNKT differentiation in a cell-intrinsic manner. Collectively, our data provide the genetic evidence that iNKT cell development and effector functions are under the control of mTORC1 signaling.

The biology of cancer stem cells : part 1: nuclear translocation of CD44 : part 2: IMP2 in glioblastoma cancer stem cells

SummaryCancer stem cells (CSC) are poorly differentiated, slowly proliferating cells, with high tumorigenic potential. Some of these cells, as it has been shown in leukemia, evade chemo- and radiotherapy and recapitulate the tumor composed of CSC and their highly proliferative progeny. Therefore, understanding the molecular biology of those cells is crucial for improvement of currently used anti-cancer therapies.This work is composed of two CSC-related projects. The first deals with CD44, a frequently used marker of CSC; the second involves Imp2 and its role in CSC bioenergetics. PART 1. CD44 is a multifunctional transmembrane protein involved in migration, homing, adhesion, proliferation and survival. It is overexpressed in many cancers and its levels are correlated with poor prognosis. CD44 is also highly expressed by CSC and in many malignancies it is used for CSC isolation.In the present work full-lenght CD44 nuclear localization was studied, including the mechanism of nuclear translocation and its functional role in the nucleus. Full-length CD44 can be found in nuclei of various cell types, regardless of their tumorigenic potential. For nuclear localization, CD44 needs to be first inserted into the cell membrane, from which it is transported via the endocytic pathway. Upon binding to transportinl it is translocated to the nucleus. The nuclear localization signal recognized by transportinl has been determined as the first 20 amino acids of the membrane proximal intracellular domain. Nuclear export of CD44 is facilitated by exportin Crml. Investigation of the function of nuclear CD44 revealed its implication in de novo RNA synthesis.PART 2. Glioblastoma multiforme is the most aggressive and most frequent brain malignancy. It was one of the first solid tumors from which CSC have been isolated. Based on the similarity between GBM CSC and normal stem cells expression of an oncofetal mRNA binding protein Imp2 has been investigated.Imp2 is absent in normal brain as well as in low grade gliomas, but is expressed in over 75% GBM cases and its expression is higher in CSC compared to their more differentiated counterparts. Analysis of mRNA transcripts bound by Imp2 and its protein interactors revealed that in GBM CSC Imp2 may be implicated in mitochondrial metabolism. Indeed, shRNA mediated silencing of protein expression led to decreased mitochondrial activity, decreased oxygen consumption and decreased activity of respiratory chain protein complex I. Moreover, lack of Imp2 severely affected self-renewal and tumorigenicity of GBM CSC. Experimental evidence suggest that GBM CSC depend on mitochondrial oxidative phosphorylation as an energy producing pathway and that Imp2 is a novel regulator of this pathway.RésuméLes cellules cancéreuses souches sont des cellules peu différentiées, à proliferation lente et hautement tumorigénique. Ces cellules sont radio-chimio résistantes et sont capable reformer la tumeur dans sont intégralité, reproduisant l'hétérogénéité cellulaire présent dans la tumeur d'origine. Pour améliorer les therapies antitumorales actuelles il est crucial de comprendre les mécanismes moléculaires qui caractérisent cette sous-population de cellules hautement malignes.Ce travail de thèse se compose de deux projets s'articulant autour du même axe :Le CD44 est une protéine multifonctionnelle et transmembranaire très souvent utilisée comme marqueur de cellules souches tumorales dans différents cancers. Elle est impliquée dans la migration, l'adhésion, la prolifération et la survie des cellules. Lors de ce travail de recherche, nous nous sommes intéressés à la localisation cellulaire du CD44, ainsi qu'aux mécanismes permettant sa translocation nucléaire. En effet, bien que principalement décrit comme un récepteur de surface transmembranaire, le CD44 sous sa forme entière, non clivée en peptides, peut également être observé à l'intérieur du noyau de diverses cellules, quel que soit leur potentiel tumorigénique. Pour passer ainsi d'un compartiment cellulaire à un autre, le CD44 doit d'abord être inséré dans la membrane plasmique, d'où il est transporté par endocytose jusqu'à l'intérieur du cytoplasme. La transportai permet ensuite la translocation nucléaire du CD44 via une « séquence signal » contenue dans les 20 acides aminés du domaine cytoplasmique qui bordent la membrane. A l'inverse, le CD44 est exporté du noyau grâce à l'exportin Crml. En plus des mécanismes décrits ci-dessus, cette étude a également mis en évidence l'implication du CD44 dans la synthèse des ARN, d'où sa présence dans le noyau.Le glioblastome est la plus maligne et la plus fréquente des tumeurs cérébrales. Dans ce second projet de recherche, le rôle de IMP2 dans les cellules souches tumorales de glioblastomes a été étudié. La présence de cette protéine oncofoetale a d'abord été mise en évidence dans 75% des cas les plus agressifs des gliomes (grade IV, appelés glioblastomes), tandis qu'elle n'est pas exprimée dans les grades I à III de ces tumeurs, ni dans le cerveau sain. De plus, IMP2 est apparue comme étant davantage exprimée dans les cellules souches tumorales que dans les cellules déjà différenciées. La baisse de l'expression de IMP2 au moyen de shRNA a résulté en une diminution de l'activité mitochondriale, en une réduction de la consommation d'oxygène ainsi qu'en une baisse de l'activité du complexe respiratoire I.L'inhibition de IMP2 a également affecté la capacité de renouvellement de la population des cellules souches tumorales ainsi que leur aptitude à former des tumeurs.Lors de ce travail de thèse, une nouvelle fonction d'un marqueur de cellules souches tumorales a été mise en évidence, ainsi qu'un lien important entre la bioénergétique de ces cellules et l'expression d'une protéine oncofoetale.

The role of Notch receptor signaling in T helper 17 cell differentiation

Antigenic recognition by naive CD4+ T cells induces their proliferation and differentiation into functionally distinct T helper (Th) cell. Each CD4+ Th cell subset expresses specific transcription factors and produces signature cytokines that coordinate immune responses against encountered pathogens. Among the factors influencing CD4+ Th cell differentiation, Notch signaling pathway has been reported to play a role in the differentiation and function of multiple CD4+Thcell subsets. Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-to-cell signaling cascade involved in many cell fate decision processes. How Notch signaling modulates the differentiation of CD4+ Th cell subsets and whether Notch signaling alone is sufficient or not for the differentiation of CD4+ Th cells is still a matter of debate. Th17 cells are a distinct subset of CD4+ Th cells. They play a role in the control of extracellular bacterial and fungal infections and may lead to inflammatory and autoimmune diseases if not properly regulated. Th17 cells are defined by the expression of RAR-related orphan receptor (ROR)a and RORyT transcription factors and their secretion of IL-17A, IL-17F cytokines. The involvement of Notch signaling in Th17 cell differentiation has mostly been studied in vitro. However, neither the experimental conditions when Notch signaling might be involved in Th17 cell differentiation in vitro and in vivo nor the precise role of Notch in this process remain clear. To better define how Notch signaling impacts Th17 differentiation, we used mice with T cell specific ablation of Notchl and Notch2 (N1 N2ACD4Cre) or of Notch transcriptional repressor RBP- JK (RBP-J ACD4Cre). We show that impaired Notch signaling in T cells, when TCR activating signal were reduced, increased RORyT and IL-17 mRNA levels during in vitro Th17 cell differentiation. Following immunization with OVA in CFA, an adjuvant that induces mostly Th17 cell response, increased IL-17A mRNA and intracellular IL-17A levels were observed in draining lymph nodes of Notch-deficient CD4+T cells. Our data suggest that Notch limited Th17 cell differentiation. Despite high levels of IL-17 mRNA and intracellular IL-17 proteins observed in Notch-deficient T cells, their release of Th17 cytokines ex vivo was markedly decreased, indicating a role for Notch signaling. During the second part of this thesis, we observed that the impact of Notch on Th17 cell differentiation and effector functions was context-dependent using different in vivo experimental models, in which Th17 cells and IL-17A were reported to contribute in the disease development. Collectively, our data reveal that Notch signaling controls the fine-tuning of Th17 cell differentiation and effector functions by limiting their differentiation but promoting selectively cytokine release through Notch-dependent mechanisms that still need to be defined. -- Lors d'une réponse immunitaire et grâce à la reconnaissance antigénique, les lymphocytes CD4+ T naïfs prolifèrent, puis se différencient en CD4+ T auxiliaires ("T helper" ou Th) fonctionnellement distincts. Chaque sous-population de lymphocytes CD4+ T auxiliaires exprime des facteurs de transcription et des cytokines spécifiques qui coordonnent la réponse immunitaire contre les pathogènes rencontrés. Parmi les facteurs influençant la différenciation des lymphocytes CD4+ T auxiliaires, la voie de signalisation Notch a été identifiée comme ayant un rôle dans la différenciation et la fonction des différents sous-types de cellules CD4+ T auxiliaires. La voie de signalisation Notch est une voie évolutivement conservée, qui est impliquée dans la signalisation entre les cellules et dans de nombreux processus de décisions cellulaires. La manière dont la voie de signalisation Notch régule la différenciation des lymphocytes CD4+ T en sous-types de cellules CD4+ auxiliaires, mais également la question de savoir si la voie de signalisation Notch est capable ou non d'induire la différenciation des cellules CD4+T auxiliaires, restent à débattre. Les cellules T auxiliaires 17 (Th17) sont un sous-type distinct de cellules CD4+T. Elles jouent un rôle important dans la défense immunitaire contre des pathogènes tels que les bactéries extracellulaires et les champignons. Une dérégulation de la réponse des cellules Th17 peut conduire à des inflammations mais également à des maladies auto-immunes. Les cellules Th17 sont définies par l'expression de leurs facteurs de transcription RAR-related orphan receptor (ROR)a, RORyT et par la sécrétion de cytokines comme IL-17A, IL-17F. Le rôle de la voie de signalisation Notch dans la différenciation des cellules Th17 a principalement été démontré in vitro. Malgré tout, ni les conditions expérimentales dans lesquelles cette voie pourrait être impliquée dans la différenciation des cellules Th17 in vitro et in vivo, mais également ni la fonction exacte de Notch dans ces processus, ne sont des questions résolues. Afin de mieux définir comment la voie de signalisation Notch est impliquée dans la différenciation des cellules Th17, nous avons utilisé des souris avec une déficience spécifique dans les cellules T des récepteurs Notchl et Notch2 (N1N2ACD4Cre) ou du répresseur transcriptionnel de Notch RBP-JK (RBP-J ACD4Cre). Nous avons montré que lorsque la voie de signalisation Notch est déficiente, les niveaux d'ARN messager (ARNm) de RORyT et de IL-17A sont augmentés dans les cellules Th17 pendant la différenciation in vitro, en présence de niveaux réduits des signaux activant les cellules T CD4+. Une augmentation dans les niveaux d'ARNm de IL-17A et de IL-17A intracellulaire au niveau protéinique a été observée dans les cellules T CD4+ Notch déficientes, au niveau des ganglions drainants après immunisation avec l'OVA dans le CFA, un adjuvant induisant une réponse des cellules Th17. Nos résultats suggèrent que Notch pourrait réguler négativement l'expression de IL-17A au niveau transcriptionnel mais également protéinique. Malgré une augmentation de IL-17A au niveau de l'ARNm et protéinique dans les cellules CD4+ T Notch déficientes, paradoxalement la sécrétion de IL-17A mais également de cytokines associées aux fonctions effectrices des cellules Th17 sont profondément diminuées 6X vivo, suggérant un rôle de la voie de signalisation Notch dans ce processus. Dans la deuxième partie de ce travail de thèse, nous avons observé que l'impact de Notch dans la différenciation des cellules Th17 et dans leurs fonctions effectrices était dépendant du contexte dans d'autres modèles expérimentaux in vivo, où les cellules Th17 et l'IL-17A ont été identifiées comme ar-.riCociêSM dans le développement ds la pathologie. En résumé, nous avons montré que la voie de la signalisation Notch contrôle la régulation précise de la différenciation des cellules Th17 en limitant leur différenciation, mais en promouvant sélectivement leur relâchement en cytokines associés aux cellules Th17 par l'intermédiaire de mécanismes dépendant de Notch, qui restent toujours à déterminer. -- Lors d'une réponse immunitaire et grâce à la reconnaissance antigénique, les lymphocytes CD4+ T naïfs prolifèrent, puis se différencient en CD4+ T auxiliaires ("T helper" ou Th) fonctionnellement distincts. Chaque sous-population de lymphocytes T auxiliaires exprime des facteurs de transcription et des cytokines spécifiques qui coordonnent une réponse immunitaire contre différents pathogènes. Les mécanismes liés à la différenciation des lymphocytes CD4+ T auxiliaires sont complexes et régulés. Une mauvaise régulation de la différenciation des lymphocytes CD4+ T auxiliaires peut conduire à des maladies auto-immunes, mais également à des processus inflammatoires. Parmi les facteurs influençant la différenciation des lymphocytes T auxiliaires, la voie de signalisation Notch a été identifiée comme ayant un rôle dans la différenciation et la fonction des différents sous-types de cellules CD4+ T auxiliaires. La voie de signalisation Notch est une voie évolutivement conservée, qui est impliquée dans la signalisation entre les cellules, mais également dans de nombreux processus de décisions cellulaires. Quelle est l'implication de la voie de signalisation Notch dans la différenciation des lymphocytes CD4+ en sous-types de cellules CD4+T auxiliaires et comment cette voie agit dans ce processus, sont des questions débattues. Les cellules T auxiliaires 17 (Th17) sont une sous-population distincte de lymphocytes CD4+. Elles jouent un rôle important dans la défense immunitaire contre les bactéries extracellulaires et les champignons. Une dérégulation de la réponse des cellules Th17 a été associée à des maladies auto-immunes et à l'inflammation. Les cellules Th17 sont définies par l'expression du facteur de transcription RAR-related orphan receptor (ROR)yT et des cytokines comme IL-17A, IL-17F. Le rôle de la voie de signalisation Notch dans la différenciation des cellules Th17 a été principalement démontré dans des études expérimentales in vitro. Malgré tout, les conditions expérimentales exactes dans lesquelles la voie de signalisation de Notch pourrait être impliquée dans la différenciation des cellules Th17, mais également le rôle de Notch dans ce processus ne sont pas encore clairement élucidés. Afin de mieux définir comment la voie de signalisation Notch est impliquée dans la différenciation des cellules Th17, nous avons utilisé des souris avec une déficience spécifique dans les cellules T des récepteurs Notchl et Notch2 (N1 N2ACD4Cre) ou du répresseur transcriptionnel de Notch RBP-JK (RBP-JACD4CRE). Nous avons montré que lorsque la voie de signalisation Notch est déficiente, les niveaux d'ARN messager (ARNm) de RORyT et de IL-17 sont augmentés dans les cellules Th17 pendant leur différenciation in vitro. Cet effet de Notch sur la transcription apparaît être facultatif lorsque les conditions environnementales sont en excès in vitro. Après immunisation avec un adjuvant qui induit principalement une réponse des cellules Th17, nous avons observé que les niveaux de ARNm de IL-17A et aussi de IL-17A intracellulaire au niveau protéinique étaient augmentés dans les ganglions drainants dans les cellules CD4+ Notch déficientes. Ces résultats suggèrent que Notch pourrait réguler négativement l'expression de IL- 17 au niveau transcriptionnel mais également protéinique. Malgré des niveaux plus élevés de IL- 17 ARNm et aussi IL-17A intracellulaire dans les cellules T Notch déficientes, le relâchement en cytokines Th17 est profondément diminué indiquant un rôle de la voie de signalisation Notch dans ces processus de sécrétion. Dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons observé que le rôle de Notch dans ia différenciation dss cellules Ti,17 et dans leurs fonctions effectrices était dépendant du contexte dans d'autres modèles expérimentaux, qui ont été rapportés comme une réponse induisant des cellules Th17. En résumé, nos données montrent que la voie de la signalisation Notch contrôle la régulation précise de la différenciation des cellules Th17 en limitant leur différenciation mais en promouvant sélectivement le relâchement en cytokines associées aux cellules Th17 par des mécanismes dépendant de Notch qui restent toujours à déterminer. Par conséquent, l'inhibition de la voie de signalisation Notch pourrait être utilisée dans des situations inflammatoires ou d'auto-immunité où la réponse des cellules Th17 est exacerbée.

Mammalian Target of Rapamycin Complex 2 Controls CD8 T Cell Memory Differentiation in a Foxo1-Dependent Manner.

Upon infection, antigen-specific naive CD8 T cells are activated and differentiate into short-lived effector cells (SLECs) and memory precursor cells (MPECs). The underlying signaling pathways remain largely unresolved. We show that Rictor, the core component of mammalian target of rapamycin complex 2 (mTORC2), regulates SLEC and MPEC commitment. Rictor deficiency favors memory formation and increases IL-2 secretion capacity without dampening effector functions. Moreover, mTORC2-deficient memory T cells mount more potent recall responses. Enhanced memory formation in the absence of mTORC2 was associated with Eomes and Tcf-1 upregulation, repression of T-bet, enhanced mitochondrial spare respiratory capacity, and fatty acid oxidation. This transcriptional and metabolic reprogramming is mainly driven by nuclear stabilization of Foxo1. Silencing of Foxo1 reversed the increased MPEC differentiation and IL-2 production and led to an impaired recall response of Rictor KO memory T cells. Therefore, mTORC2 is a critical regulator of CD8 T cell differentiation and may be an important target for immunotherapy interventions.

Combined clonotyping and gene signatures of individual tumor-reactive CD8 T-cells define their functional relevance following peptide vaccination in melanoma patients

Novel cancer vaccines are capableto efficiently induce and boost humantumor antigen specific T-cells. However,the properties of these CD8T-cells are only partially characterized.For in depth investigation ofT-cells following Melan-A/MART-1peptide vaccination in melanoma patients,we conducted a detailed prospectivestudy at the single cell level.We first sorted individual human naiveand effector CD8 T-cells from peripheralblood by flow cytometry, andtested a modified RT-PCR protocolincluding a global amplification ofexpressed mRNAs to obtain sufficientcDNAfromsingle cells.We successfullydetected the expression ofseveral specific genes of interest evendown to 106-fold dilution (equivalentto 10-5 cell). We then analyzed tumor-specific effector memory (EM)CD8T-cell subpopulations ex vivo, assingle cells from vaccinated melanomapatients. To elucidate the hallmarksof effective immunity the genesignatures were defined by a panel ofgenes related to effector functions(e.g. IFN-, granzyme B, perforin),and individual clonotypes were identifiedaccording to the expression ofdistinct T-cell receptors (TCR). Usingthis novel single cell analysis approach,we observed that T-cell differentiationis clonotype dependent,with a progressive restriction in TCRBV clonotype diversity from EMCD28pos to EMCD28neg subsets. However,the effector function gene imprintingis clonotype-independent,but dependent on differentiation,since it correlates with the subset oforigin (EMCD28pos or EMCD28neg). We also conducted a detailedcomparative analysis after vaccinationwith natural vs. analog Melan-Apeptide. We found that the peptideused for vaccination determines thefunctional outcome of individualT-cell clonotypes, with native peptideinducing more potent effector functions.Yet, selective clonotypic expansionwith differentiation was preservedregardless of the peptide usedfor vaccination. In summary, the exvivo single cell RT-PCR approach ishighly sensitive and efficient, andrepresents a reliable and powerfultool to refine our current view of molecularprocesses taking place duringT-cell differentiation.

The murine model of infection with Leishmania major and its importance for the deciphering of mechanisms underlying differences in Th cell differentiation in mice from different genetic backgrounds.

Mice from the majority of inbred strains are resistant to infection by Leishmania major, an obligate intracellular protozoan parasite of macrophages in the mammalian host. In contrast, mice from BALB strains are unable to control infection and develop progressive disease. In this model of infection, genetically determined resistance and susceptibility have been clearly shown to result from the appearance of parasite-specific CD4+ T helper 1 or T helper 2 cells, respectively. This murine model of infection is considered as one of the best experimental systems for the study of the mechanisms operating in vivo at the initiation of polarised T helper 1 and T helper 2 cell maturation. Among the several factors influencing Th cell development, cytokines themselves critically regulate this process. The results accumulated during the last years have clarified some aspects of the role played by cytokines in Th cell differentiation. They are providing critical information that may ultimately lead to the rational devise of means by which to tailor immune responses to the effector functions that are most efficient in preventing and/or controlling infections with pathogens.

Regulatory T cell defects are associated with autoimmunity in Wiskott-Aldrich Syndrome protein deficient mice

Abstract : The Wiskott-Aldrich Syndrome (WAS) is an X-linked recessive human primary immunodeficiency. It is caused by mutations in the gene encoding the hermatopoietic specific regulator of the actin cytoskeleton Wiskott-Aldrich Syndrome Protein (WASP). Importantly, a majority of affected patients develop autoimmunity including an inflammatory bowel disease (IBD)-like disease. WASP deficient mice share many similarities with the human WAS. One of these similarities is the spontaneous development of colitis. I have focused my dissertation studies on the pathogenesis of colitis in WASP deficient mice. Prior work from our laboratory had shown that lymphocytes were required and that CD4+ T cells sufficient for colitis development. This colitis was associated with a predominant Th2-cytokine skewing. I have contributed in exploring whether the Th2 cytokine IL-4 plays a role in disease maintenance. Using two approaches to neutralize IL-4, we found that this cytokine plays a role in disease maintenance. Natural CD4*CD25*Foxp3* regulatory T cells (nTreg cells) have been implicated in the pathogenesis of several autoimmune disorders. We found that WASP deficient mice have reduced nTreg cell numbers in peripheral lymphoid organs. This was associated with functional defects in suppressing T cell proliferation and preventing colitis induced by transfer of naïve T cells into SCID recipient, which lack lymphocytes. WASP deficiency affected homing of nTreg cells to lymphoid compartments, IL-2-mediated activation and secretion of the immunomodulatory cytokine IL-10. Finally, we could prevent colitis onset via adoptive transfer of WT nTreg cells prior to colitis development. This suggests that nTreg cells dysfunction is one of the mechanisms underlying colitis development in WASP deficient mice. Future directions will aim at deciphering the role of other immune cell types, the bacterial flora, and various cytokines in colitis development in this murine model of colitis. In addition, we believe that colitis in WASP deficient mice could serve as a useful tool to evaluate nTreg cells manipulation as novel therapeutic approach for IBD.

From the Cover: Nanoparticle conjugation of antigen enhances cytotoxic T-cell responses in pulmonary vaccination.

The ability of vaccines to induce memory cytotoxic T-cell responses in the lung is crucial in stemming and treating pulmonary diseases caused by viruses and bacteria. However, most approaches to subunit vaccines produce primarily humoral and only to a lesser extent cellular immune responses. We developed a nanoparticle (NP)-based carrier that, upon delivery to the lung, specifically targets pulmonary dendritic cells, thus enhancing antigen uptake and transport to the draining lymph node; antigen coupling via a disulfide link promotes highly efficient cross-presentation after uptake, inducing potent protective mucosal and systemic CD8(+) T-cell immunity. Pulmonary immunization with NP-conjugated ovalbumin (NP-ova) with CpG induced a threefold enhancement of splenic antigen-specific CD8(+) T cells displaying increased CD107a expression and IFN-γ production compared with immunization with soluble (i.e., unconjugated) ova with CpG. This enhanced response was accompanied by a potent Th17 cytokine profile in CD4(+) T cells. After 50 d, NP-ova and CpG also led to substantial enhancements in memory CD8(+) T-cell effector functions. Importantly, pulmonary vaccination with NP-ova and CpG induced as much as 10-fold increased frequencies of antigen-specific effector CD8(+) T cells to the lung and completely protected mice from morbidity following influenza-ova infection. Here, we highlight recruitment to the lung of a long-lasting pool of protective effector memory cytotoxic T-cells by our disulfide-linked antigen-conjugated NP formulation. These results suggest the reduction-reversible NP system is a highly promising platform for vaccines specifically targeting intracellular pathogens infecting the lung.

Pulmonary Sarcoid-like Granulomatosis after Multiple Vaccinations of a Long-term Surviving Patient with Metastatic Melanoma.

Autoimmune side effects are frequent in patients with cancer treated with immune checkpoint-targeting antibodies, but are rare with cancer vaccines. Here, we present a case report on a patient with metastatic melanoma who developed pulmonary sarcoid-like granulomatosis following repetitive vaccinations with peptides and CpG. Despite multiple metastases, including one lesion in the brain, the patient is alive and well more than 13 years after the diagnosis of metastatic disease. The strongly activated tumor-specific CD8(+) T cells showed robust long-term memory and effector functions. It is possible that long-term survival and adverse autoimmune events may become more common for vaccines inducing robust anticancer immune responses as were present in this patient. Cancer Immunol Res; 2(12); 1148-53. ©2014 AACR.