Function and regulation of the scaffold protein IB1/JIP-1 in the uro-genital tract.

RESUME Ce mémoire de thèse traite de l'étude de la « scaffold »protéine ou protéine «échafaud», « Islet-Brain1/ JNK Interacting Protein 1 » (IB1/JIP-1) dans la vessie et la prostate, deux organes importants de l'appareil uro-genital. Cette protéine, mise en évidence dans notre laboratoire à la fin des année 90, a été reconnue pour réguler la voie de signalisation des « Mitogen-Activated Protein Kinases » (MAPKs), et en particulier de la MAPK appelée c-Jun N-terminal Kinase (JNK). Le réseau de voie de signalisation permet aux cellules de percevoir les changements dans le milieu extracellulaire et de permettre une réponse appropriée à ces différents stimuli. La connaissance des voies de signalisation a permis de mettre en évidence leur rôle crucial tant dans l'homéostase des tissus sains que dans des processus pathologiques comme l'oncogenèse. Parmi une vingtaine de voie de signalisation, la voie de signalisation des «MAPKinases » est une des plus importantes et a été montrée pour participer à diverses fonctions cellulaires telles que la différentiation, la motilité, la division et la mort cellulaire. La voie de signalisation des « MAPKinases » est typiquement constituée d'un module de trois kinases qui s'activent séquentiellement par phosphorylation. On note la présence d'une MAPK, d'un activateur de MAPK et d'un activateur de l'activateur de MAPK. Une fois la MAPK activée, elle permettra la régulation de différentes cibles dont certain facteur de transcription. Chez les mammifères, il existe 3 grands groupes de MAPKs : the extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 (ERK 1/2) cascade, qui régule préférentiellement la croissance et la différentiation cellulaire, ainsi que les cascades JNK et p38 qui régulent préférentiellement la réponse à différents stress cellulaires telle que l'inflammation ou l'apoptose. JNK est activé par différents stress cellulaire telle que les cytokines inflammatoires. JNK est également requis au cours du développement embryonnaire et contribue à la mort (apoptose) ou à la prolifération cellulaire. Plusieurs études ont mis en évidence le rôle de JNK durant le processus tumoral, sans que son rôle soit clairement identifié. JNK pourrait avoir des fonctions différentes durant l'initiation puis de la progression tumorale. Chez les mammifères, les voies de signalisation intracellulaires forment un réseau complexe et elles interagissent entre elles, ce qui permet aux cellules une réponse adéquate aux multitudes de stimuli existants dans les organismes pluricellulaires. Parmi plusieurs mécanismes de régulation, les protéines dites « scaffold » ou «échafaud » jouent un rôle crucial dans l'homéostase de la voie de signalisation des «MAPKinase ». L'introduction revoit brièvement ces différents aspects, de la voie de signalisation des «MAPKinase et des connaissance sur IB1/JIP-1. Les premières études effectuées sur IB1/JIP-1 ont montré une expression relativement spécifique de cette protéine dans certains types de neurones ainsi que dans la cellule beta-sécrétrice d'insuline. IB1/JIP-1 régule la voie de signalisation JNK par interaction avec les différents composants du module, modifiant ainsi le spectre de substrats activés par JNK. La fonction précise de IB1/JIP-1 n'était pas encore élucidée, mais plusieurs travaux mettaient en lumière un rôle dans la régulation, et la sous-location cellulaire des composants de la voie de signalisation JNK, ainsi que dans la survie cellulaire à certain stress. Cette expression relativement spécifique est intrigante car elle suggère que sa présence serait nécessaire à une régulation spécifique de la MAPKinase JNK ou à certaines autres fonctions cellulaires également spécifiques de certains tissus. Le premier but de ce travail a consisté à mettre en évidence l'expression de IB1/JIP-1 dans l'appareil uro-génital et plus particulièrement dans la vessie et la prostate. Nos résultats ont montré que IB1/JIP-1 est spécifiquement exprimé au niveau de l'urothélium vésical, mais pas dans le muscle lisse. Il en est de même au niveau de la prostate où IB1/JIP-1 est exprimé spécifiquement au niveau de l'épithélium sécrétoire et absent au niveau du stroma fibro-musculaire. La vessie et la prostate sont des organes ou l'activité JNK pourrait être crucial tant dans l' homeostase tissulaire que dans le développement de pathologies bénignes ou malignes. La vessie et la prostate sont le siège fréquent de tumeur. La base pour le développement du cancer est complexe et implique plusieurs anomalies génétiques. Ce processus complexe lié au développement tumoral est encore loin d`être complètement élucidé, raison pour laquelle il est crucial de poursuivre l'étude des différents gènes pouvant être impliqué dans ces processus ou pouvant être utilisé comme outil thérapeutique. Dans l'urothelium de la vessie, la fonction de la MAPK JNK n'a été que très peu étudiée. Il existe quelques études, in vitro, suggérant une implication possible de cette voie de signalisation dans des processus telle que le développement ou la progression tumorale. Le chapitre 1 décrit une étude in vivo dans la vessie un modèle de stress mécanique, connu pour activer les MAPKinase. La dilatation vésicale, due à une obstruction urétrale, a mis en évidence une diminution de l'expression de IB1/JIP-1 ainsi qu'une activation de la MAPKinase JNK. Dans ce modèle, la régulation de IB1/JIP-1, par l'intermédiaire d'un vecteur viral, a permis de démontrer que IB1/JIP-1 régulait l'activité de JNK dans ce tissu. Pour poursuivre l'étude de cette fonction d' IB1/JIP-1 dans l'urothélium, nous avons investigué l'activité JNK dans des souris génétiquement modifiées et porteuse d'une délétion de 1 des 2 allèles du gène codant pour IB1/JIP-1, avec un contenu en IB1/JIP-1 diminué de moitié. L'activation de JNK est également augmentée dans l'urothelium au repos de ces souris, ce qui confirme la fonction régulatrice de JNK par IB1/JIP-1. Ces résultats ont permis de mettre en évidence un rôle critique de celle-ci dans l'homéostase de I`urothelium et suggère une nouvelle cible pour réguler la voie de signalisation dans ce tissu. En outre, la modulation des niveaux d'expression d'IB1/JIP-1 dans la vessie, in vivo, par l'intermédiaire de vecteurs viraux s'est révélée réalisable et indique un moyen élégant pour développer une thérapie génique dans cet organe. Un autre élément de ce travail de thèse, révélée au chapitre 2, a été d'étudier la régulation dans la vessie de rat de la communication intercellulaire de type « GAP ». Les cellules adjacentes partagent des ions, messagers secondaires et des petits métabolites par l'intermédiaire de canaux intercellulaire qui forment les jonctions de type « GAP ». Ce type de communications intercellulaire permet une activité cellulaire coordonnée, une caractéristique importante pour l'homéostase des organismes multicellulaire. Ce type de communication intercellulaire est formé de 2 demi-canaux appelés connexons. Chaque connexon est formé de six protéines appelées connexins (Cx). Il existe environ vingt connexines différentes nommées par leur poids moléculaire respectif. Les jonctions de type canaux "GAP" permettent aux cellules de communiquer avec les cellules voisines au quelles elles sont mécaniquement ou électriquement couplées. La vessie peut être particulièrement dépendante de la communication intercellulaire par les canaux « Gap » qui permettrait de coordonner la réponse de la musculature ainsi que de l'urothélium à l'augmentation de la pression transmurale du à l'accumulation d'urine, situation fréquemment observée dans le cadre de l'hyperplasie bénigne de la prostate. Dans la vessie de rat, la connexine26 est exprimée uniquement dans l'urothelium. La Cx26, a été montrée pour être un possible « tumor suppressor gene » dans le cancer de vessie. Une augmentation de la Cx26 ainsi que du couplage des cellules urothéliales a été démontré dans notre modèle de stress mécanique sur la vessie de rat et est dépendante de 2 éléments de réponses connues pour interagir avec AP-1. La régulation de IB1/JIP-1 a permis de montrer que celle-ci régulait l'activité JNK, ainsi que l'activité du facteur de transcription AP-1, composé de c-Jun lui-même cible de JNK. Cette réduction de l'activité de AP-1 est associée à une diminution de l'expression du transcipt de la Cx26. En résumé, la Cx26 pourrait être régulée par le complexe AP-1 lui-même dépendant du contenu en IB1/JIP-1. Dans le chapitre 3, l'étude de IB1/J1P-1 s'est portée sur la prostate. Cet organe, siège fréquent de pathologie telle que le cancer ou l'hyperplasie bénigne de la prostate, exprime IB1/JIP-1 au niveau de son épithélium sécrétoire. Cette expression est maintenue dans une lignée cellulaire humaine largement étudiée est reconnue comme un modèle adéquat de cellules tumorales de type androgène-sensible. IB1/JIP-1 a été investigué dans un modèle in vitro d'apoptose en réponse à un agent appelé N-(4-hydroxyphenyl)retinamide (4-HPR) qui induit une activation de la MAPK JNK ainsi que également un diminution du contenu en IB1/JIP-1. La surexpression de IB1/JIP-1 en utilisant à nouveau des virus comme vecteur a démontré que IB1/JIP-1 était capable de réguler l'activité de JNK ainsi que les taux d'apoptose. Dans le cancer de la prostate, certains travaux ont montré que la différentiation neuroendocrine des cellules tumorales est associée à la progression tumorale et à la perte de sensibilité aux androgènes. Ce travail a permis de dévoiler l'augmentation d'expression de IB1/JIP-1 dans un modèle de neurodifferentiation des cellules d'une lignée prostatique humaine (LNCaP). Les mécanismes qui permettent une expression spécifique de IB1/JIP-1 ont été partiellement investiguée dans notre laboratoire. Son promoteur humain contient un « Neuron Restricive Silencer Element » (NRSE) connu pour se lier a répresseur transcriptionel appelé « RE-1 Silencer Transcription Factor » ou « Neuron Restrictive Silencer Factor » (REST/NRSF). NRSF/REST est capable de réprimer l'expression de gènes neuronaux en dehors du système neuronal. Il prend part à la différentiation terminale des gènes neuronaux. Dans le chapitre 3, on observe que l'activité de REST/NRSF est diminuée dans les cellules LNCaP qui se transdifferencient de manière neuroendocrine, et que REST/NRSF est capable de moduler l'expression de ces gènes cibles dans ce type cellulaire. Ces travaux laissent suggérer que NRSF/REST participe à l'acquisition du phénotype neuroendocrinien et pourrait être une cible pour réguler ce phénomène. En conclusion, ce travail de thèse présente l'expression de IB1/JIP-1 dans 2 organes de l'appareil uro-génital ; la vessie et la prostate. La fonction de IB1/JIP-1 a été étudiée in vivo dans la vessie de rat, ce qui a mis en évidence sa fonction régulatrice de l'activité de la MAPKinase JNK, et de l'activité du facteur de transcription AP-1 ; ainsi que sa possible implication régulatrice de gène cible tel que la Connexin 26 (Cx26). AP-1 et la Cx26 pourraient jouer un rôle dans le processus oncologique, tant dans le control de l'invasion cellulaire ou le control de la croissance cellulaire. Dans la prostate, IB1/JIP-1 régule également l'activité JNK; crucial dans la transmission de certains stimulis pro-apoptotiques. Dans un modèle de transdifférenciation neuroendocrinienne, phénotype possiblement lié au caractère agressif du cancer de la prostate, l'expression de IB1/JIP-1 est augmenté, suggérant soit un rôle possible dans le développement du phénotype neuronal ou une implication dans une fonction anti-apoptotique. Ce travail a donc permis d'élargir nos connaissances sur la régulation et le control de la voie de signalisation des MAPKinases par IB1/JIP-1, qui pourrait avoir encore d'autres fonctions dans ces tissus.

Linking microtubules to the activation of CDC42 in fission yeast

Cell polarity is an essential property of most cell types and relies on a dynamic cytoskeleton of actin filaments and microtubules. In rod-shaped S. pombe cells microtubules are organized along the length of the cell and transport polarity factors to cell tips to regulate cell polarity. An important cell polarity factor is the protein Tea4, which is responsible for correct cell morphogenesis and bipolar growth. During my research I confirmed the known transport mechanism of Tea4 and I also showed alternative localization and anchoring mechanisms at the cell ends. Tea4 contains a conserved SH3 domain, the function of which was unknown and my results show that the SH3 domain of Tea4 is essential for Tea4 function in vivo. First, cells with tea4SH3 mutations show aberrant cell shapes and monopolar growth patterns similar to tea4A and in addition SH3 domain is important for proper localization of multiple cell polarity proteins. Second, I showed that Tea4 associates with Type 1 Phosphatase Dis2 through both its SH3 domain and an RVxF motif. Tea4 also binds the DYRK kinase Pomi through its SH3 domain. In addition Tea4 is proposed to promote the local dephosphorylation of Pomi by Dis2 to induce the formation of a cortical gradient from cell ends essential for cell size homeostasis. Polarized growth is also controlled by cell tip-localized Cdc42. This Rho- family GTPase is activated by the Guanine Exchange Factors Gef1 and Scd1 and inactivated by the Rho GTPase Activating Protein Rga4. In this study, I investigated the mechanisms of how Tea4 promotes Cdc42 activation. My work suggests that Tea4 promotes the local exclusion of Rga4, which in turn allows the accumulation of active Cdc42, which may result in growth. Exclusion of Rga4 by Tea4 is likely to be mediated by Dis2-dependent dephosphorylation. These results suggest a molecular pathway that links the microtubule- associated factor Tea4 with Cdc42 to promote cell polarization and morphogenesis. - La polarité cellulaire est une propriété essentielle de la plupart des types cellulaires et s'appuie sur une dynamique des cytosquelettes d'actine et de microtubules. Dans les cellules en forme de bâtonnet de S. pombe les microtubules sont alignés selon l'axe longitudinal de la cellule et les facteurs de polarité transportés aux extrémité cellulaires afin de réguler la polarité cellulaire. Un facteur important de polarité cellulaire est la protéine Tea4, qui est responsable de la morphogenèse des cellules et leur croissance bipolaire. Au cours de mes recherches, j'ai confirmé les mécanismes connus de transport de Tea4 et j'ai aussi mis en évidence d'autres mechanismes de localisation et d'ancrage de Tea4 aux extrémités cellulaires. Tea4 contient un domaine SH3 conservé, dont la fonction était inconnue et mes résultats montrent que le domaine SH3 est essentiel pour la fonction de Tea4 in vivo. Tout d'abord, les cellules avec des mutations tea4sm ont des formes aberrantes et leur croissance est monopolaire de manière similaire au mutant tea4A. De plus ce domaine SH3 est important pour la localisation correcte de plusieurs protéines de polarité cellulaire. Deuxièmement, j'ai montré que Tea4 s'associe avec la Phosphatase de Type-1 Dis2 par son domaine SH3 et un motif RVxF. Tea4 se lie également la kinase DYRK Pomi par son domaine SH3. De plus, Tea4 pourrait favoriser la déphosphorylation locale de Pomi par Dis2 afin d'induire la formation d'un gradient cortical de Pomi essentiel pour l'homéostasie de la longueur des cellules. La croissance polarisée est également contrôlée par la protéine Cdc42 localisée aux extrémités cellulaires. Cette GTPase de la famille de Rho GTPase est activée par les facteurs échange de guanine Gef1 et Scd1 et inactivée par la protéine "Rho GTPase activating" Rga4. Dans cette étude, j'ai étudié les mécanismes d' activation de Cdc42 par Tea4. Mes résultats suggèrent que Tea4 favorise l'exclusion locale de Rga4, ce qui permet l'accumulation de Cdc42 active, nécessaire à la croissance. L' exclusion de Rga4 par Tea4 est vraisemblablement médiée par une déphosphorylation Dis2- dépendente. Ces résultats suggèrent une voie moléculaire qui lie le facteur associé aux microtubules Tea4 à Cdc42 pour promouvoir la polarisation cellulaire et la morphogenèse. - Cell polarity is important for several essential biological functions such as generation of distinct cell fates during development and function of differentiated cells. Defective cell polarity has been related to uncontrolled cell division and subsequently to cancer initiation. Cell polarity depends on a functional cytoskeleton that consists of actin filaments and microtubules, which maintains cell shape, helps cellular motion, enables intracellular protein transport and plays a vital role in cell division. A component of cytoskeleton is microtubules that regulate cell polarization in diverse cell types. During my research, I worked with Schizosaccharomyces pombe, also named fission yeast, a powerful unicellular model organism that allows combination of genetic, biochemical and microscopic analysis for the proper study of cell polarity. Microtubule-associated protein Tea4 is transported to cell tips where it is thought to organize polarized growth. I showed that Tea4 and its evolutionarily conserved SH3 domain play an important role for maintenance of fission yeast cells shape and growth. Furthermore, Tea4 is responsible for the proper localization of multiple polarity proteins and acts as a mediator to control the local activity of an essential polarity regulator called Cdc42. Thus, my results provide a better understanding of the molecular mechanisms that regulate cell polarity. - La polarité cellulaire est importante pour plusieurs fonctions biologiques essentielles telles que la différenciation cellulaires au cours du développement et de la fonction de cellules différenciées. Les défauts de la polarité cellulaire ont été liés à des divisions cellulaires incontrôlées et à l'initiation de tumeur. La polarité cellulaire dépend d'un cytosquelette fonctionnel, qui maintient la forme des cellules, aide à la migration cellulaire, permet le transport intracellulaire des protéines et joue un rôle essentiel dans la division cellulaire. Un composant du cytosquelette est constitué de microtubules qui régissent la polarisation cellulaire dans divers types cellulaires. Au cours de mes recherches, j'ai travaillé avec Schizosaccharomyces pombe, appelé également levure fissipare, un modèle unicellulare puissant qui permet la combinaison de différentes d'approches expérimentales: génétiques, biochimiques et microscopiques pour l'étude de la polarité cellulaire. La protéine Tea4 associée aux microtubules est transportée aux extrémités cellulaires où elle organise la croissance polarisée. J'ai montré que Tea4 et son domaine conservé SH3 jouent un rôle important pour le maintien de la forme des cellules de levure et leur croissance. De plus, Tea4 est responsable de la localisation correcte de multiples facteurs de polarité et agit comme un médiateur pour contrôler l'activité locale d'un régulateur de polarité essentiel appelé Cdc42. Ainsi, mes résultats permettent de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui régulent la polarité cellulaire.

Semantic domains and supersens tagging for domain-specific ontology learning

In this paper we propose a novel unsupervised approach to learning domain-specific ontologies from large open-domain text collections. The method is based on the joint exploitation of Semantic Domains and Super Sense Tagging for Information Retrieval tasks. Our approach is able to retrieve domain specific terms and concepts while associating them with a set of high level ontological types, named supersenses, providing flat ontologies characterized by very high accuracy and pertinence to the domain.

The vasodilatory response of skin microcirculation to local heating is subject to desensitization

RAPPORT DE SYNTHESE Introduction : dans la présente étude, nous nous sommes intéressés à la vasodilatation cutanée induite par le réchauffement local (hyperémie thermique). Il est établi, qu'une partie de cette réponse vasculaire est médiée par l'oxyde nitrique (NO). De manière générale, les effets du NO peuvent être sujets à une désensibilisation, comme nous le démontre le phénomène bien connu de tolérance aux dérivés nitrés. Le but du présent travail était d'évaluer si une telle désensibilisation existe dans le cas de l'hyperémie thermique. Méthodes : nous avons donc examiné si une première stimulation thermique pouvait en atténuer une deuxième, induite plus tard sur le même site cutané à une intervalle de 2h ou 4h. Pour vérifier directement l'effet du réchauffement local sur la sensibilité de la microcirculation cutanée au NO, nous avons de plus appliqué un donneur de NO (nitroprussiate de sodium, SNP) par la technique d' iontophorèse, sur des sites cutanés préalablement soumis à un échauffement local 2h ou 4h auparavant. Nous avons examinés 12 sujets en bonne santé habituelle, de sexe masculin, non fumeurs, âgés de 18 à 30 ans, ne prenant aucune médication. Le flux sanguin dermique a été mesuré par imagerie laser Doppler (LDI, Moor Instruments) sur la face antérieur de l'avant-bras. Le réchauffement local de la peau a été effectué grâce a des petits anneaux métalliques thermo-contrôlés contenant de l'eau. La température était initialement de 34°C. Elle a été augmentée à 41 °C en une minute et maintenue à cette valeur durant 30 minutes. Cette manoeuvre a été répétée sur le même site cutané soit 2 h, soit 4h plus tard. Quant à l'iontophorèse de SNP, elle a été effectuée sur des sites ayant préalablement subi, 2h ou 4h auparavant, un échauffement unique appliqué selon la technique qui vient d'être décrite. Résultats : nous avons observé une atténuation de l'hyperémie thermique lorsque celleci était examinée 2h après un premier échauffement local. Lorsque l'intervalle était de 4h la réponse vasodilatatrice n'était pas réduite. Nous avons également observé une atténuation de la réponse vasodilatatrice au SNP lorsque celui-ci a était appliqué 2h, mais non 4h après un premier échauffement local. Conclusion :cette étude démontre que la réponse vasodilatatrice cutanée induite par l'échauffement local est bien sujette à désensibilisation, comme nous en avions formulé l'hypothèse. Ce phénomène est transitoire. Il est lié, au moins en partie, à une baisse de sensibilité de la microcirculation cutanée aux effets vasodilatateurs du NO.

Epidermal differentiation and carcinogenesis

Summary Skin, and more precisely the epidermis, plays a crucial role in our survival since it constitutes our first line of defense against our environment. A subtle equilibrium between proliferation and differentiation of keratinocytes, the main epidermal cell type, provides a continous self-renewal of the epidermis, maintaining the integrity of this protective barrier. It is now well established that pertubation of the normal balance between proliferation and differentiation can induce development of several diseases including cancer. The aim of my thesis was first to characterize new genes involved in the differentiation process of keratinocytes and the formation of the epidermis. We show that cornulin, encoded by the c1orf10 gene, is a new marker of epidermal differentiation, mainly expressed in the suprabasal layers of the epidermis. Structurally, cornulin belongs to the "fused genes" protein family and contains a functional calcium-binding domain as well as two repeated sequences of 60 amino acids, the function of which remain unknown. The second part of my work aimed to identify new proteins interacting with CYLD. When mutated, CYLD is responsible for cylindromatosis, a predisposition to benign tumors of skin appendages mainly located on the scalp. CYLD is implicated in the NF-κB signalling pathway. We have identified HBO1 and p30, two nuclear proteins, as potential CYLD partners. Since CYLD was described as a negative regulator of NF-icB-mediated transcription, we have tested the putative effect of HBO1 and p30 on the regulation of this signalling pathway. We have shown that only HBO1 is able to inhibit NF-κB-mediated transactivation. The mechanism of action of HBO1 is still under investigation but our results suggest that an unknown cofactor is involved in this process. Résumé La peau est cruciale à notre survie car elle est notre première ligne de défense contre notre environnement. L'épiderme qui forme cette barrière protectrice entre le corps et l'environnement extérieur est continuellement renouvelé suite aux agressions physiques, chimiques et biologiques répétées qu'il subit. Le but de ce renouvellement étant de garantir l'intégrité de cette barrière. Le keratinocyte est le principal type cellulaire trouvé dans l'épiderme. La formation d'une barrière active dépend essentiellement de la faculté des kératinocytes à proliférer et à se différencier. Il est aujourd'hui admis que tout déséquilibre entre l'activité de prolifération et de différenciation des kératinocytes est la cause du développement de plusieurs maladies, dont certains cancers. Le but de ce travail de thèse était, dans un premier temps d'identifier ou de caractériser de nouveaux gènes impliqués dans le processus de différenciation afin de mieux comprendre la formation de l'épiderme. Noús avons ainsi démontré que la cornulin, produit du gène c1orf10, est un nouveau marqueur de la différenciation épidermique, principalement exprimé dans les couches suprabasales de l'épiderme. D'un point de vue structural, nous avons montré que cette protéine appartient à la famille des « fused gene » et qu'elle possède un domaine de liaison au calcium qui est fonctionnel et deux séquences répétées de 60 acides aminés dont la fonction est encore inconnue. La seconde partie de cette thèse était dédiée à l'étude de la cylindromatose, une prédisposition génétique à la formation de tumeurs bénignes, principalement localisées sur la tête et due à des mutations du gène CYLD. Nous avons cherché de nouvelles protéines qui interagissent avec CYLD afin de mieux caractériser les voies de signalisation impliquées dans le développement de la maladie. Nous avons ainsi identifiés deux nouveaux partenaires potentiels de CYLD ; HBO1 et p30 CYLD ayant été décrit comme un régulateur négatif de la transcription médiée par NF-κB; nous avons testé l'implication de HBO1 et p30 au niveau de cette activité transcriptionnelle. Nous montrons que seul HBO1 est capable d'inhiber la transactivation d'un gène rapporteur régulé par NF-κB. Le mécanisme d'action de HBO1 n'est pas encore connu, néanmoins nos résultats suggèrent l'intervention d'un cofacteur qui reste à déterminer.

Characterization of the expression, regulation and function of Sorting Nexin 9 and Sorting Nexin 18

Summary : Sorting nexin (SNX) family members play important roles in intracellular protein and membrane trafficking, The membrane-tubulating SNX9 protein has been shown to interact with multiple components of the endocytic machinery and to participate in clathrin-mediated endocytosis of cell surface receptors. It has not been investigated if SNX9 may also participate in other protein sorting pathways that involve vesicular transport, specifically the biogenesis of lysosome-related organelles (LROs). Closely related to SNX9 is SNXl8, whose function is largely unknown. In this work, we have characterized the expression of SNX9 and SNXl8 in LRO-containing cells and investigated their role in protein trafficking during the formation of LROs. Our results indicate that SNX9 and SNXl8 are not essential for the formation of LROs, nor for the sorting of melanosomal proteins. We investigated how the level of intracellular SNX9 protein is regulated and found that it is a substrate of the ubiquitin ligase Itch, a member of the NEDD4 family of E3 ubiquitin ligases. Itch ubiquitylates SNX9 and regulates SNX9 levels by enhancing its degradation. Using ? truncated proteins we found that the interaction with SNX9 is mediated by the proline-rich domain of Itch, a domain distinct from the conventional WW recognition domain, and the SH3 domain of SNX9. Interaction with the PRD of Itch is essential for SNX9 ubiquitylation and degradation. We further showed that Itch binding is not affected by tyrosine phosphorylation of SNX9. Using lentivector-mediated siRNA techniques, we found that Itch regulates the level of melanosomal proteins, while knock-down of SNX9 does not alter their level. Interestingly, we revealed that silencing of SNXIS affects the amount of the melanosomal protein Melan-A, but also of SNX9, and that SNXl8 can interact with SNX9. Taken together, our results highlight that the pool of substrates of NEDD4 family E3 ligases extends to proteins containing SH3 domains and provide insight into the potential functions of SNXI8. Résumé : Les membres de la famille des Sorting Nexins (SNX) jouent des rôles importants dans le trafic intracellulaire de protéines et membranes. Il a été démontré que la protéine SNX9, qui génère les tubules membranaires, interagit avec plusieurs composants de la machinerie d'endocytose et participe à l'endocytose des récepteurs de surface mediée par la clathrine. Aucune étude n'a investigué si SNX9 pourrait aussi participer à d'autres voies de trafic de protéines tel que le transport vésiculaire, et plus particulièrement la biogenèse des organites lysosomaux ("lysosome-related organelles", LR©s). SNXl8 est similaire à SNX9, mais sa fonction est largement inconnue. Dans ce travail, nous avons caractérisé l'expression de SNX9 et SNX18 dans des cellules contenants des LROs et investigué leur rôle dans le trafic de protéines pendant la formation des LROS. Nos résultats indiquent que SNX9 et SNXI8 ne sont essentiels ni pour la formation des LR©s, ni pour le trafic de protéines mélanosomales. Nous avons examiné la régulation du niveau intracellulaire de la protéine SNX9 et avons trouvé qu'elle est un substrat de l'ubiquitine ligase Itch, un membre de la famille NEDD4 des ubiquitine ligases E3. Itch ubiquitine SNX9 et régule les niveaux de SNX9 en augmentant sa dégradation. En utilisant des protéines mutées nous avons découvert que l'interaction avec SNX9 est médiée par le domaine riche en proline de Itch, qui est différent du domaine conventionnel de reconnaissance WW, et par le domaine SH3 de SNX9. L'interaction avec le domaine riche en proline de Itch est essentielle pour l'ubiquitination et la dégradation de SNX9. De plus, nous avons montré que cette liaison n'est pas affectée par la phosphorylation des résidus tyrosine de SNX9. En utilisant des vecteurs lentiviraux exprimant des siARN, nous avons trouvé que Itch régule les niveaux de protéines mélanosomales, alors que l'extinction de l'expression de SNX9 ne change pas leurs niveaux. En autre, nous avons révélé que la diminution de SNXl8 affecte le niveau de la protéine mélanosomale Melan-A et de SNX9, et aussi que SNXl8 peut interagir avec SNX9. En résumé, nos résultats démontrent que l'ensemble des substrats de la famille NEDD4 des ubiquitine ligases E3 s'élargit aux protéines contenant des domaines SH3 et ouvrent des perspectives sur les fonctions potentielles de SNXl8.

LEVERAGING SANDBOX IMMERSIVE 3D VIRTUAL WORLDS TO DEVELOP DO-IT- YOURSELF TEACHING GAMES: IMPLEMENTATION TO MARKETING CASE STUDY TEACHING IN SECOND LIFE

Games are powerful and engaging. On average, one billion people spend at least 1 hour a day playing computer and videogames. This is even more true with the younger generations. Our students have become the < digital natives >, the < gamers >, the < virtual generation >. Research shows that those who are most at risk for failure in the traditional classroom setting, also spend more time than their counterparts, using video games. They might strive, given a different learning environment. Educators have the responsibility to align their teaching style to these younger generation learning styles. However, many academics resist the use of computer-assisted learning that has been "created elsewhere". This can be extrapolated to game-based teaching: even if educational games were more widely authored, their adoption would still be limited to the educators who feel a match between the authored games and their own beliefs and practices. Consequently, game-based teaching would be much more widespread if teachers could develop their own games, or at least customize them. Yet, the development and customization of teaching games are complex and costly. This research uses a design science methodology, leveraging gamification techniques, active and cooperative learning theories, as well as immersive sandbox 3D virtual worlds, to develop a method which allows management instructors to transform any off-the-shelf case study into an engaging collaborative gamified experience. This method is applied to marketing case studies, and uses the sandbox virtual world of Second Life. -- Les jeux sont puissants et motivants, En moyenne, un milliard de personnes passent au moins 1 heure par jour jouer à des jeux vidéo sur ordinateur. Ceci se vérifie encore plus avec les jeunes générations, Nos étudiants sont nés à l'ère du numérique, certains les appellent des < gamers >, d'autres la < génération virtuelle >. Les études montrent que les élèves qui se trouvent en échec scolaire dans les salles de classes traditionnelles, passent aussi plus de temps que leurs homologues à jouer à des jeux vidéo. lls pourraient potentiellement briller, si on leur proposait un autre environnement d'apprentissage. Les enseignants ont la responsabilité d'adapter leur style d'enseignement aux styles d'apprentissage de ces jeunes générations. Toutefois, de nombreux professeurs résistent lorsqu'il s'agit d'utiliser des contenus d'apprentissage assisté par ordinateur, développés par d'autres. Ceci peut être extrapolé à l'enseignement par les jeux : même si un plus grand nombre de jeux éducatifs était créé, leur adoption se limiterait tout de même aux éducateurs qui perçoivent une bonne adéquation entre ces jeux et leurs propres convictions et pratiques. Par conséquent, I'enseignement par les jeux serait bien plus répandu si les enseignants pouvaient développer leurs propres jeux, ou au moins les customiser. Mais le développement de jeux pédagogiques est complexe et coûteux. Cette recherche utilise une méthodologie Design Science pour développer, en s'appuyant sur des techniques de ludification, sur les théories de pédagogie active et d'apprentissage coopératif, ainsi que sur les mondes virtuels immersifs < bac à sable > en 3D, une méthode qui permet aux enseignants et formateurs de management, de transformer n'importe quelle étude de cas, provenant par exemple d'une centrale de cas, en une expérience ludique, collaborative et motivante. Cette méthode est appliquée aux études de cas Marketing dans le monde virtuel de Second Life.

Secretory IgA and intestinal epithelial cells at the interface between homeostasis regulation and protection against infection

RESUME DESTINE A UN LARGE PUBLICL'intestin est le siège d'intenses agressions de la part de l'ensemble des aliments ingérés, de bactéries agressives dites pathogènes mais également de bactéries dites commensales peuplant naturellement les surfaces intestinales muqueuses. Pour faire face, notre organisme arbore de nombreux niveaux de protections tant physiques, chimiques, mécaniques mais aussi immunitaires. La présence d'un type particulier de cellules, les cellules épithéliales (IEC) assurant une protection physique, ainsi que la production d'anticorps spécialisés par le système immunitaire appelés immunoglobulines sécrétoires A (SlgA) servent conjointement de première ligne de défense contre ces agressions externes. Néanmoins, comment le dialogue s'articule entre ces deux partenaires reste incomplet.Nous avons donc décidé de mimer ces interactions en modélisant les surfaces muqueuses par une monocouche de cellules différenciées en laboratoire. Des souches bactériennes isolées de l'intestin humain seules ou associées à des SlgA non-spécifiques ont été mises au contact de ce modèle cellulaire nous permettant de conclure quant à la présence effective d'une modulation du dialogue bactérie/lEC impliquant une activation de la réponse cellulaire vers un état de tolérance mutuelle. De façon surprenante, nous avons par ailleurs mis en évidence un type d'interaction nouveau entre ces anticorps et ces bactéries. Une étude biochimique nous a permis de détailler un nouveau rôle des SlgA médié par les sucres présents à leur surface dans le maintien d'une relation pacifique avec les commensaux perpétuellement présents, relations qualifiées d'homésostase intestinale.Le rôle protecteur des SlgA a par ailleurs été abordé pour avoir une meilleure appréhension de leur impact au niveau cellulaire lors d'infection par Shigella flexneri, bactérie causant la Shigellose, diarrhée sanglante responsable de la mort de plus d'un million de personnes chaque année. Basée sur le même modèle cellulaire, cette étude nous a permis de démontrer une nouvelle entrée de ce pathogène directement via les IEC. La présence d'anticorps spécifiques à la surface des bactéries restreint leur champs d'action contre les cibles intracellulaires identifiées que sont les filaments soutenant le squelette de la cellule, les fibres d'actine ainsi que les jonctions serrées, réseaux de protéines clés des interactions entre cellules. Cette ouverture au niveau cellulaire apporte un nouvel élan quant à la compréhension du rôle protecteur des SlgA lors d'attaques de l'intestin, protection semblant dépendante d'une agrégation des bactéries.Pour finir, nous avons mis en évidence la détection directe par les cellules de la présence d'anticorps libres dans l'intestin ajoutant une nouvelle réplique dans le dialogue complexe entre ces deux piliers de l'équilibre intestinal que sont les SlgA et les cellules épithéliales.RESUMELa muqueuse intestinale est dotée d'un réseau complexe de protections physico-chimiques, mécaniques ou immunologiques. Associées à un système immunitaire omniprésent, les cellules épithéliales intestinales {IEC) bordant la lumière intestinale ont la double tâche de protéger l'intérieur de l'organisme stérile contre l'invasion et la dissémination d'agents pathogènes, et de maintenir une relation pacifique avec la flore intestinale, rôles également joués par les immunoglobulines sécrétoires A (SlgA), anticorps les plus abondamment présents à la surface des muqueuses. Tant les IEC que les SlgA sont ainsi décrites comme convergeant vers le même objectif ; néanmoins, les rouages de leurs interactions restent largement inconnus.Pour répondre à cette question, des monocouches épithéliales reconstituées in vitro ont été incubées avec des souches commensales telles que des Lactobacillus ou des Bifodobacteria, seules ou complexées avec des SlgA non-spécifiques, nous permettant de décrypter l'influence des SlgA sur la détection des bactéries par les IEC, favorisant l'adhésion bactérienne et la cohésion cellulaire, augmentant l'activation de la voie NF-κΒ ainsi que la sécrétion de la cytokine thymic stromal lymphopoietin contrairement à celle de médiateurs pro-inflammatoires qui reste inchangée. Par ailleurs, une interaction Fab-indépendante est suggérée dans l'interaction SlgA/bactéries. Comme une interaction de faible affinité a été décrite comme prenant naturellement place au niveau de l'intestin, nous avons donc disséqué les mécanismes sous- jacents en utilisant un large spectre de bactérie associés à des protéines soit recombinantes soit isolées à partir de colostrum, mettant en évidence un rôle crucial des N-glycanes présents sur la pièce sécrétoire et soulignant une nouvelle propriété des SlgA dans l'homéostase intestinale.Intrinsèquement liés aux caractéristiques des SlgA, nous nous sommes également focalisés sur leur rôle protecteur lors d'infection par l'enteropathogène Shigella flexneri reproduites in vitro sur des monocouches polarisées. Nous avons tout d'abord démontré une nouvelle porte d'entrée pour ce pathogène directement via les IEC. L'agrégation des bactéries par les SlgA confère aux cellules une meilleure résistance à l'infection, retardant croissance bactérienne et entrée cellulaire, affectant par ailleurs leur capacité à cibler le cytosquelette et les jonctions serrées. La formation de tels cargos détectés de façon biaisée par les IEC apparaît comme une explication plausible au maintien de la cohésion cellulaire médiée par les SlgA.Enfin, le retrotransport des SlgA à travers les IEC a été abordé soulignant une participation active de ces cellules dans la détection de l'environnement extérieur, les impliquant possiblement dans l'activation d'un état muqueux stable.Conjointement, ces résultats indiquent que les SlgA représentent l'un des éléments-clés à la surface de la muqueuse et soulignent la complexité du dialogue établi avec l'épithélium en vue du maintien d'un fragile équilibre intestinal.ABSTRACTThe intestinal mucosa is endowed with a complex protective network melting physiochemical, mechanical and immunological features. Beyond the ubiquitous intestinal immune system, intestinal epithelial cells (IEC) lying the mucosal surfaces have also the dual task to protect the sterile core against invasion and dissemination of pathogens, and maintain a peaceful relationship with commensal microorganisms, aims also achieved by the presence of high amounts of secretory immunoglobulins A (SlgA), the most abundant immunoglobulin present at mucosal surfaces. Both IEC and SlgA are thus described to converge toward the same goal but how their interplay is orchestrated is largely unknown.To address this question, in vitro reconstituted IEC monolayers were first apically incubated with commensal bacteria such as Lactobacillus or Bifodobacteria strains either alone or in complexes with non-specific SlgA. Favoring the bacterial adhesion and cellular cohesion, SlgA impacts on the cellular sensing of bacteria, increasing NF-κΒ activation, and leading to cytokine releases restricted to the thymic stromal lymphopoietin and unaffected expression of pro-inflammatory mediators. Of main interest, bacterial recognition by SlgA suggested a Fab-independent interaction. As this low affinity, called natural coating occurs in the intestine, we further dissected the underlying mechanisms using a larger spectrum of commensal strains associated with recombinant as well as colostrum-derived proteins and pinpointed a crucial role of N-glycans of the secretory component, emphasizing an underestimated role of carbohydrates and another properties of SlgA in mediating intestinal homeostasis.As mucosal protection is also anchored in SlgA and IEC features, we focused on the cellular role of SlgA. Using IEC apical infection by the enteropathogen Shigella flexneri, we have first demonstrated a new gate of entry for this pathogen directly via IEC. Specific SlgA bacterial aggregation conferred to the cells a better resistance to infection, delaying bacterial growth and cellular entry, affecting their ability to damage both the cytoskeleton and the tight junctions. Formation of such big cargos differentially detected by IEC appears as a plausible explanation sustaining at the cellular level the antibody-mediated mucosal protection.Finally, SlgA retrotransport across IEC has been tackled stressing an active IEC sensing of the external environment possibly involved in the steady-state mucosal activation.All together, these results indicate that SlgA represents one of the pivotal elements at mucosal surfaces highlighting the complexity of the dialogue established with the epithelium sustaining the fragile intestinal balance.The Intestinal mucosa is endowed with a complex protective network melting physiochemical, mechanical and immunological features. Beyond the ubiquitous intestinal immune system, intestinal epithelial cells (IEC) lying the mucosal surfaces have also the dual task to protect the sterile core against invasion and dissemination of pathogens, and maintain a peaceful relationship with commensal microorganisms, aims also achieved by the presence of high amounts of secretory immunoglobulins A (SlgA), the most abundant immunoglobulin present at mucosal surfaces. Both IEC and SlgA are thus described to converge toward the same goal but how their interplay is orchestrated is largely unknown.To address this question, in vitro reconstituted IEC monolayers were first apically incubated with commensal bacteria such as Lactobacillus or Bifodobacteria strains either alone or in complexes with non-specific SlgA. Favoring the bacterial adhesion and cellular cohesion, SlgA impacts on the cellular sensing of bacteria, increasing NF-κΒ activation, and leading to cytokine releases restricted to the thymic stromal lymphopoietin and unaffected expression of pro-inflammatory mediators. Of main interest, bacterial recognition by SlgA suggested a Fab-independent interaction. As this low affinity, called natural coating occurs in the intestine, we further dissected the underlying mechanisms using a larger spectrum of commensal strains associated with recombinant as well as colostrum-derived proteins and pinpointed a crucial role of N-glycans of the secretory component, emphasizing an underestimated role of carbohydrates and another properties of SlgA in mediating intestinal homeostasis.As mucosal protection is also anchored in SlgA and IEC features, we focused on the cellular role of SlgA. Using IEC apical infection by the enteropathogen Shigella flexneri, we have first demonstrated a new gate of entry for this pathogen directly via IEC. Specific SlgA bacterial aggregation conferred to the cells a better resistance to infection, delaying bacterial growth and cellular entry, affecting their ability to damage both the cytoskeleton and the tight junctions. Formation of such big cargos differentially detected by IEC appears as a plausible explanation sustaining at the cellular level the antibody-mediated mucosal protection.Finally, SlgA retrotransport across IEC has been tackled stressing an active IEC sensing of the external environment possibly involved in the steady-state mucosal activation.All together, these results indicate that SlgA represents one of the pivotal elements at mucosal surfaces highlighting the complexity of the dialogue established with the epithelium sustaining the fragile intestinal balance.

PGE2-induced colon cancer growth is mediated by mTORC1

La mortalité du cancer colorectal reste importante malgré les nombreux progrès effectués dans la compréhension des mécanismes responsables à son développement. Dans ce contexte, il a été démontré qu'une enzyme appelée cyclooxygénase-2 (COX-2) joue un rôle important dans la pathogenèse du cancer colorectal. En effet, les métabolites produits par cette enzyme, en particulier la Prostaglandine E2 (PGE2), sont capables de directement stimuler la prolifération et la survie des cellules tumorales nécessaires à la progression tumorale. De plus, la PGE2 stimule également la formation de nouveaux vaisseaux sanguins indispensable à la croissance tumorale en induisant la formation du facteur de croissance vasculaire (VEGF). L'importance de COX- 2 dans le cancer colorectal ne se limite pas au niveau expérimental mais a aussi été démontré chez des patients où il a été prouvé que des inhibiteurs chimiques de COX-2 comme l'aspirine réduisaient le risque de développer un cancer colorectal. Il est donc important de caractériser et de comprendre les mécanismes par lesquels la COX-2 et les PGE2 participent au développement du cancer colorectal afin de générer de nouvelles approches thérapeutiques. Dans cette étude, nous avons observé qu'un complexe protéique intracellulaire appelé mTORC1 joue un rôle important dans la prolifération de cellules du cancer colorectal induite par la PGE2. En effet, nous avons trouvé que l'activité de mTORC1 était augmentée après stimulation des cellules tumorales par la PGE2. Nous avons également trouvé que cette stimulation était médiée par un type spécifique de récepteurs de la PGE2 appelé EP4. L'inhibition de mTORC1 par des composés chimiques ou par interférence de RNA bloque la prolifération cellulaire induite par la PGE2. De même, la production du facteur de croissance endothéliale (VEGF) par la PGE2 est bloquée par les inhibiteurs de mTORC1. Nos résultats montrent donc que mTORC1 est un intermédiaire cellulaire important dans la croissance tumorale induite par la PGE2 ainsi que dans la production de VEGF. mTORC1 représente de ce fait une cible thérapeutique intéressante dans le cancer colorectal qui mérite d'être évaluée dans des études cliniques.

Role of Staphylococcus aureus surface proteins in experimental endocarditis

Résumé Le staphylocoque doré est un pathogène responsable d'une grande variété de maladies chez l'être humain. Il est extrêmement bien équipé de facteurs de virulence, dont les adhésines. Jusqu'à présent, 21 protéines liant des composants de tissus de l'hôte ("microbial surface components reacting with adherence matrix molecules, MSCRAMM") ont été identifiées, par exemple le "clumping factor" A (CIfA) ou la "fibronectin-binding protein" A (FnBPA). Néanmoins, pour la plupart de ces protéines, leur rôle dans la pathogénie des infections à staphylocoque doré reste à être élucidé. Le but de cette thèse est de contribuer à ce processus. Premièrement, les "MSCRAMM" CIfA, CIfB, FnBPA, FnBPB, Cna, SpA, Pls, SdrC, SdrD, SdrE, SasD, SasE, SasF, SasG, Sasl, SasJ et SasK ont été exprimés dans une bactérie substitut, Lactococcus lactis, et testés pour leurs propriétés adhésives et leur pathogénicité dans un modèle d'endocardite expérimentale (voir chapitre 1). Cette technique a préalablement été utilisée avec succès et a l'avantage d'éviter le contexte complexe des redondances et systèmes de régulations propres au staphylocoque doré. Les résultats montrent que, de tous les facteurs de virulence testés, seuls CIfA et FnBPA sont d'importance primordiale dans le développement d'endocardite expérimentale. En ce qui concerne l'internalisation dans les cellules endothéliales, seulement FnPBA et FnBPB en sont capables. En outre, l'adhérence à chacun des ligands testés (fibrinogène, fibronectine, kératine, élastine, collagène, et les caillots de fibrine et plaquettes) est très spécifique et est médiée par une ou plusieures adhésines provenant du staphylocoque doré. Par conséquence, ces protéines pourraient représenter des cibles potentielles pour de futures thérapies anti-adhésives contre le staphylocoque doré. Deuxièmement, l'expression des facteurs de virulence décrits dans le chapitre 1 par les souches recombinantes de lactocoques a été vérifiée par une nouvelle méthode utilisant la spectrométrie de masse (voir chapitre 2). L'expression de toutes ces protéines par les souches recombinantes a pu être confirmée. Cette méthode pourrait être de grande valeur dans la vérification de la présence de protéines quelconques dans toutes sortes d'applications. Troisièmement, deux facteurs de virulence du staphylocoque, CIfA et une forme tronquée de FnBPA, ont été exprimés de façon simultanée dans une souche recombinante de lactocoque (voir chapitre 3}. Contrairement à une souche exprimant la FnBPA entière, une souche exprimant la forme tronquée de FnPBA, qui ne contient plus le domaine capable de lier le fibrinogène, perd complètement sa capacité d'infecter dans le modèle d'endocardite expérimentale. Par contre, il est montré que, en cas de complémentation de la forme tronquée de FnPBA avec le domaine de liaison au fibrinogène de CIfA dans la souche double recombinante, le phénotype intégral de FnBPA est récupéré. En conséquence, les facteurs de virulence sont capables de coopérer dans le but de la pathogénie des infections à staphylocoque doré. Summary Staphylococcus aureus is a human pathogen causing a wide variety of disease. It is extremely well equipped with both secreted and surface-attached virulence factors, which can act as adhesins to host tissues. In total, twenty-one microbial surface components reacting with adherence matrix molecules (MSCRAMMs) have been identified, so far. These include well-characterized adhesins such as clumping factor A (CIfA) or fibronectin-binding protein A (FnBPA). However, for most of them their potential role in the pathogenesis of staphylococcal infections remains to be elucidated. This has been attempted in this thesis work. Firstly, the staphylococcal MSCRAMMs CIfA, CIfB, FnBPA, FnBPB, Cna, SpA, Pls, SdrC, SdrD, SdrE, SasD, SasE, SasF, SasG, Sasl, SasJ, and SasK have been expressed in a surrogate bacterium, Lactococcus lactis, and tested for their in vitro adherence properties and their pathogenicity in the rat model of experimental endocarditis (see chapter 1). This model has successfully been used previously, and has the advantage of bypassing the complex S. aureus background of redundancies and differential regulation. Here, it is shown that of the seventeen tested potential virulence factors, only CIfA and FnBPA are critical for the pathogenesis of experimental endocarditis in rats, while internalization into bovine endothelial cells is mediated exclusively by FnBPA and FnBPB. In addition, the adherence to specific host ligands (fibrinogen, fibronectin, keratin, elastin, collagen, and fibrin-platelet clots) is highly specific and mediated by one or few staphylococcal adhesins, respectively. Thus, these surface proteins may represent potential targets for an anti-adhesive strategy against S. aureus infections. Secondly, the expression of the staphylococcal proteins by L. lactis recombinants described in chapter 1 was tested by a novel method using mass spectrometry (see chapter 2). The expression of all the staphylococcal proteins by the respective recombinant lactococcal strain could be confirmed. This method may prove to be of great value in the confirmation of the presence of any given protein in various experimental settings. Thirdly, two staphylococcal virulence factors, CIfA and a truncated form of FnBPA, were expressed simultaneously in one recombinant lactococcal strain (see chapter 3). In contrast to a recombinant strain expressing full-length FnPBA, a recombinant strain expressing a truncated FnPBA, lacking the domain capable of binding fibrinogen, completely lost infectivity in experimental endocarditis. However, it is shown that the complementation of the truncated form of FnBPA with the fibrinogenbinding domain of CIfA in a double recombinant strain results in the recovery of the complete phenotype of full-length FnBPA. Thus, virulence factors can cooperate in the pathogenesis of staphylococcal infections.

Signalling pathways in skin homeostasis

SUMMARY The results presented here contribute to a better understanding of the crucial molecular relationships and signalling cues exchanged by several fundamental cell types (epidermal keratinocytes, dermal fibroblasts, immune and endothelial cells) of the skin. Importantly we provide evidence to directly implicate Wnt/ß-catenin signalling as a putative player in different cell types (keratinocytes and neutrophils) in mediation of the cutaneous inflammatory response (Fart A). Finally we highlight the importance of several molecules, specifically expressed in the hair follicle stem cell niche to the morphogenesis and homeostasis of the hair follicle (Part B). PART A Currently the body of work pertaining to Wnt signalling and immune cells largely focuses on Wnt signalling in the development of these cells. The data presented here suggests a novel mechanism in which Wnt signalling appears to modulate immune cell recruitment to the skin. Keratinocytes are major contributors to early inflammatory responses by the release of chemokines which recruit immune cells. The resultant inflammatory response is a dynamic process of sequentially infiltrating immune cells governed by a network of growth factors, chemokines and cytokines. In wild type mice the response is typified by a rapid and substantial infiltration of neutrophils followed at later time points by macrophages and Tcells. The expression of the canonical Wnt pathway activating ligand, Wnt3a, is able to induce a strong neutrophil infiltration in the dermis. This response originates in keratinocytes, as it is abrogated upon keratinocyte-specific ablation of ß-catenin. Notably, this suggests that the crucial cross talk between these resident cells and recruited immune cells is, in part, mediated by Wnt signalling. In corroboration of this role of Wnt-mediated recruitment of neutrophils, expression of the Wnt inhibitory ligand sFRPI during acute inflammation results in a dramatic 'dampening' of immune cell infiltration in particular of neutrophil chemoattraction. Importantly, an intrinsic Wnt signalling pathway is essential for neutrophil chemoattraction in response to inflammatory stimuli. There is a marked reduction of neutrophil infiltration in mice grafted with a ß-catenin deficient bone marrow upon TPA induced cutaneous inflammation. Additionally, neutrophils lacking Wnt/ß-catenin fail to respond to IFNγ, an early inflammatory cue, in vitro. In combination, these data indicate a potent function of Wnt signalling in immune cell recruitment and the modulation of the inflammatory response. PART B Tissue specific stem cells form the cellular base on which tissue homeostasis and repair of adult tissue relies. The maintenance of this stem cell pool is highly dependent on the immediate environment or niche. We have identified three genes, the fibroblast growth factor receptor 1 (FGFR1), serpin protease inhibitor (serpin F1) and the haematopoietic cell phosphatase (Hcph) to be specifically expressed in a small population of stromal cells which are in close contact to bulge stem cells. These specialized stromal cells might represent an essential mesenchymal component of the skin stem cell niche and may regulate stem cell proliferation and differentiation. Multiple FGFR1 isoforms are generated through alternate transcript splicing and are able to interact with both FGFs and cell adhesion molecules. Two predominant forms of the receptor are FGFR1-α and FGFR1-ß. Expression of a dominant negative form of the alpha isoform prevents hair follicle morphogenesis altogether. Given that FGFR1-ß signals principally through the FGF ligands, this data indicates that FGF signalling is dispensable for follicle morphogenesis. Moreover the loss of follicular morphogenesis upon suggests a requirement for signalling via cell adhesion molecule association with the receptor as FGFR1 α has a greater affinity for these molecules. The expression of the second candidate niche gene serpin f1, lead to the complete ablation of hair follicle morphogenesis. The serpin f1 product, pigment-epithelial derived factor (PEDF) has potent anti-angiogenic effects. Immunohistochemical analysis using CD31, a endothelial cell marker, revealed that although these cells are present, they have are disorganised and do not form vessels. Interestingly, endothelial cells have been found to contribute to the neuronal stem cell niche and our results suggest a similar mechanism in the skin. SHP1, the Hcph gene product, is a phosphatase which acts in the haematopoetic system. Motheaten mice carrying spontaneous mutations in the Hcph gene have patchy alopecia in their skin and severe defects in their haematopoietic system. However the haematopoietic rescue of the mouse does not result in normal follicular homeostasis. Additionally, ablation of Hcph in either the dermal or keratinocyte compartments of the skin produces hair follicles with abberant morphologies. This data indicates that although SHP1 is not essential for hair follicle morphogenesis it is required in both epidermal and dermal compartments to maintain follicular morphology. RÉSUMÉ PARTIE A Jusqu'à présent, les travaux dédiés à l'étude de la voie de signalisation Wnt dans le système immunitaire se sont essentiellement concentrés sur son rôle dans le développement des cellules immunitaires. Les données présentées ici suggèrent fortement et de manière nouvelle, l'existence d'un mécanisme par lequel la voie de signalisation Wnt/ß-caténine module le recrutement de cellules immunitaires dans un tissu périphérique, la peau, et ainsi la réponse inflammatoire cutanée. La réponse inflammatoire cutanée est un processus dynamique d'infiltration séquentielle de diverses cellules immunitaires, orchestré par un réseau de facteurs de croissance, chémokines et cytokines. Les kératinocytes sont des contributeurs majeurs à la réponse inflammatoire précoce par la libération de chémokines qui permettent ensuite de recruter les cellules immunitaires. Dans des souris sauvages, la réponse est d'abord caractérisée par une infiltration rapide et substantielle de neutrophiles, suivie par celle des macrophages et des lymphocytes T. L'expression d'un ligand activateur de le voie canonique de signalisation Wnt (après injection infra-dermique de fibroblastes sur-exprimant Wnt-3a) induit une infiltration dermique très marquée de neutrophiles. De plus, la réponse est éliminée en l'absence de ß-caténine spécifiquement dans les kératinocytes, indiquant que ces cellules sont à l'origine de la réponse. De manière remarquable, ceci suggère qu'une signalisation cruciale entre ces cellules résidentes de la peau et les cellules immunitaires recrutées est, au moins en partie, médiée par la voie Wnt. Corroborant ce rôle de la voie Wnt/ß-caténine dans le recrutement des neutrophiles, l'expression d'un ligand inhibiteur de la voie (sFRP1) résulte au cours d'une inflammation aigüe en une réduction spectaculaire de l'infiltration des cellules immunitaires en général, et des neutrophiles en particulier. De manière importante, la voie de signalisation Wnt est intrinsèquement requise pour la chémoattraction des neutrophiles en réponse à un stimulus inflammatoire. En effet, suite à une inflammation cutanée induite par un ester de phorbol (TPA), une réduction notable de l'infiltration des neutrophiles est observée dans des souris préalablement greffées avec de la moelle osseuse constituée de cellules déficientes en ß-caténine. De plus, in vitro, les neutrophiles sans ß-caténine ne répondent pas à une stimulation par l'interféron γ, qui est pourtant un signal inflammatoire établi in vivo. En conclusion, nos données indiquent que la voie de signalisation Wnt/ß-caténine joue une fonction active dans le recrutement des cellules immunitaires vers un organe périphérique, la peau, ainsi que dans la modulation, à plusieurs niveaux, de la réponse inflammatoire cutanée. PARTIE B Les cellules souches tissu-spécifiques forment la base cellulaire sur laquelle repose l'homéostase et la réparation tissulaires chez l'adulte. La maintenance de ce réservoir de cellules souches est hautement dépendante de leur environnement cellulaire immédiat, encore appelé «niche des cellules souches». Dans la peau, ces cellules stromales spécialisées représentent un compartiment mésenchymateux essentiel de la niche des cellules souches en régulant leurs prolifération et différentiation. Nous avons identifié trois gènes, le «récepteur 1 àux facteurs de croissance des fibroblastes » (Fgfr1 ), l' «inhibiteur de protéase à sérine » (serpinf1 ou pedf) et la « phosphatase des cellules hématopoiétiques » (Hcph ou Ptpn6), comme spécifiquement exprimés par une petite population de cellules stromales qui sont étroitement associées aux cellules souches de la peau (localisées au niveau du bombement du follicule pileux). Pour analyser leur fonction dans ce contexte, nous avons utilisé un test de reconstitution complète de peau murine en combinaison à des. transductions géniques basées sur l'utilisation de lentivirus. Ce test repose sur le mélange de deux compartiments cellulaires, épidermique (kératinocytes) et dermique (fibroblastes), greffés sur une zone ouverte de peau du dos d'une souris pour ensemble reconstituer la peau. Des isoformes multiples de FGFR1 sont générées par épissage alternatif de transcrits et sont capables d'interagir à la fois avec les FGFs (facteurs de croissance des fibroblastes) et les molécules d'adhésion cellulaires. Les deux formes prédominantes du récepteur, FGFR1-α et FGFR1-ß, ne différent que par le «domaine ressemblant aux immunoglobulines 1 » (immunoglobulin-like 1 domain), absent de FGFR1-ß. De plus, FGFR1-ß a une affinité plus grande pour les FGFs et plus faible pour les molécules d'adhésion cellulaires telles que la Ncadhérine (connue pour activer FGFR). La sur-expression de l'une ou l'autre des formes n'empêche pas la morphogenèse folliculaire mais conduit à la formation de follicules aberrants. Toutefois, une différence phénotypique majeure est observée lorsqu'une forme «Dominant-Négatif » (DN) est exprimée dans le compartiment dermique. La sur-expression de FGFR1-ß DN conduit en effet à la formation de follicules petits et tronqués, avec des gaines épithéliales et un bulbe élargis ainsi qu'une petite papille dermique. Par contre, l'expression de FGFR1-α DN abolit complètement la morphogenèse folliculaire. Etant donné que la signalisation par FGFR1-ß est principalement dépendante des ligands FGFs, ces données indiquent que la signalisation par ceux-cì est non-nécessaire à la morphogenèse folliculaire. De plus, l'abolition du processus par la sur-expression de FGFR1-a DN suggëre une signalisation nécessaire entre le récepteur FGFR1 et une ou des molécules d'adhésion cellulaire. L'expression de notre second candidat comme gène spécifique de la niche des cellules souches de la peau, serpinf1, prévient la morphogenèse folliculaire. Seules de petites structures ressemblant à des cystes sont observées après reconstitution de la peau. De plus, dans ces transplants, aucune cellule CD34-positive (marqueur des cellules souches) n'est retrouvée associé à ces cystes. Le produit du gène serpin f1, le «facteur dérivé d'épithélium pigmentaire » (PEDF) est un puissant facteur anti-angiogénique. Nous avons donc analysé la vascularisation des transplants par immunohistochirnies utilisant CD31, un marqueur des cellules endothéliales. Nos résultats révèlent que les cellules endothéliales sont bien présentes, mais de manière désorganisée et ne formant pas de vaisseaux. De manière intéressante, les cellules endothéliales contribuent activement à la niche des cellules souches neuronales, et nos résultats suggèrent donc l'existence possible d'un mécanisme similaire dans la peau. SHP1, le produit du gène Hcph, est une phosphatase quì agit dans le système hématopoiétique. Les souris « motheaten »qui portent des mutations spontanées du gène ont une alopécie inégale au niveau de la peau et de sévères troubles du système hématopoiétique. Pour s'assurer que le phénotype observé au niveau de la peau n'est pas une conséquence d'un défaut du système hématopoiétique, nous avons transplanté des souris Hcph -/- avec de la moelle osseuse sauvage afin de restaurer la fonction de SHP 1 dans le système hématopoiétique. Toutefois, le défaut de morphologie folliculaire est maintenu. De plus, l'ablation d'Hcph dans le compartiment dermique ou épidermique d'essais de reconstitution de peau conduit à la production de follicules pileux avec des morphologies aberrantes. Ces données indiquent que SHP1 n'est pas essentiel à la morphogenèse folliculaire mais est toutefois requis à la fois dans les compartiments épidermiques et dermiques pour la maintenance de la forme du follicule.

Role of pparß in irradiation mediated intestinal damage

Les récepteurs activés proliférateurs de peroxisomes (PPARs) appartiennent à la grande famille des récepteurs nucléaires et ont été impliqué dans plusieurs processus physiologiques. Parmi les trois isotypes PPAR, PPARβ est bien connu pour son rôle dans les décisions déterminant le destin des cellules, notamment dans les processus de prolifération, de différentiation et d'apoptose. Ce rôle a particulièrement été souligné comme protecteur dans les contextes de survie cellulaire et de cicatrisation. Il est fortement exprimé dans l'intestin grêle. Notre groupe a déjà rapporté sa présence importante dans les cryptes duodénales, où se trouvent les cellules souches intestinales. Précédemment, nous avons aussi fait remarquer le rôle de PPARβ dans la differentiation des cellules de Paneth, par la régulation négative de la signalisation Ihh de l'épithélium intestinal. Malgré sa capacité de figurer parmi les tissus du corps qui se régénèrent le plus rapidement, l'épithélium intestinal est particulièrement sensible aux attaques cytotoxiques, surtout celles dues à la radiothérapie des cancers abdomino-pelviens. Cela peut donner lieu à des lésions gastro-intestinal en tant qu'effet indésirable d'une exposition aiguë et chronique à l'irradiation. En raison du rôle protecteur de PPARβ le but de cette étude était de comprendre les voies de signalisation moléculaires régulées par PPARβ qui sont impliquées dans les réponses des cellules intestinales aux dommages causés par l'irradiation.Afin de déchiffrer les mécanismes moléculaires sous-jacents, un modèle in-vitro d'une lignée cellulaire - HT-29 a été utilisée. Il n'y a cependant pas de preuve d'un effet protecteur de PPARβ dans divers contextes d'endommagement cellulaire testés in-vitro. Ceci contraste avec les observations in-vivo qui indiquent que l'irradiation provoque une létalité supérieure dans les souris PPARβ-/- par rapport aux souris PPARβ+/+, entre autre correlée avec une apoptose augmentée des cellules souches intestinales à 4h après irradiation. En plus, le décès plus important de cellules mésenchymateuses a été observé dans les souris PPARβ-/-, 8 jours après irradiation. Moins nombreuses, ces cellules se sont également détachées de la matrice extracellulaire reliant l'épithélium et le mésenchyme. Nous stipulons qu'in-vivo, PPARβ participe au dialogue entre le mésenchyme et l'épithélium, ce qui est concordant avec le délai observé lors de la réparation tissulaire. Ce dialogue entre l'épithélium et le mésenchyme, n'existe pas de la même manière in-vitro. Il en résulte donc un défaut de réponse mésenchymale médiée par PPARβ, d'où le paradoxe entre les conditions in-vivo et in-vitro.Ces observations indiquent l'implication possible de PPARβ dans les lesions actiniques, en tant que conséquence naturelle de la radiothérapie de patients avec un cancer. Les mécanismes précis de l'action de PPARβ nécessitent une exploration approfondie de son rôle physiologique dans ce contexte.

Zugang zu geistigem Eigentum nach europäischem Kartellrecht : eine Darstellung der rechtlichen, technischen und wirtschaftlichen Grundlagen für die Offenlegung von Softwareschnittstellen anhand des Microsoft-Verfahrens

Résumé sous forme de thèses 1. La présente thèse de doctorat traite de la problématique des licences obligatoires en droit communautaire de la concurrence. Plus précisément, il s'agit d'examiner si et sous quelles conditions le refus de licencier un droit de propriété intellectuelle par une entreprise peut constituer un abus d'une position dominante selon l'article 82 du Traité CE. L'étude fait notamment référence aux marchés de haute technologie et ici à la décision Microsoft, qui a été publiée par la Commission européenne en mars 2004 et qui porte, dans sa deuxième partie, sur la possibilité de rendre interopérables différents composants, via des informations appelées interfaces. 2. La question d'une licence obligatoire ne se pose que si l'information recherchée est protégée par un droit de propriété intellectuelle et si cette information ne peut être obtenue par d'autres moyens. C'est pourquoi la première partie de l'étude examine deux sujets importants concernant l'interopérabilité: d'une part la méthode de décompilation permet-elle d'obtenir des interfaces de logiciel, d'autre part, les interfaces sont-elles protégées par le droit d'auteur. 3. En ce qui concerne la décompilation des programmes d'ordinateur, l'étude démontre que cette méthode ne permet pas de rendre interopérables différents programmes d'ordinateur de manière efficace. Le droit européen a légalisé cette méthode, après des débats publics très vifs, par l'article 6 de la directive concernant la protection juridique des programmes d'ordinateur (91/250/CEE). Il semble néanmoins que la lutte pour un tel droit de décompilation a été vaine :Tout d'abord, l'article 6 est rédigé d'une façon très complexe et autorise une décompilation seulement selon des conditions très restrictives. En plus, la décompilation en elle-même est un travail très complexe qui peut durer des années et qui ne garantit pas de trouver les informations recherchées. 4. En outre, une réglementation de décompilation n'existe jusqu'à présent que dans le domaine du droit d'auteur, tandis qu'une règlementation pour la protection juridique des brevets fait défaut. La question concernant la protection juridique des brevets pour les inventions mises en rouvre par ordinateur restera aussi dans le futur sans réponse, étant donné que le Parlement européen a rejeté une telle proposition de directive en juillet 2005. Ceci est regrettable, parce que la proposition de directive prévoyait explicitement un droit de décompilation. La Commission européenne projette, cependant, de réexaminer les dispositions de décompilation relatives au droit d'auteur. Dans ce contexte, il devrait notamment être examiné si les dispositions de décompilation de l'article 6 de la directive des programmes d'ordinateur sont satisfaisantes afin de garantir une (certaine) interopérabilité. 5. Un réexamen de la directive concernant la protection juridique des programmes d'ordinateur pourrait aussi servir à clarifier l'existence et l'étendue de la protection d'interfaces. L'article 1, paragraphe 2, 2ième phrase se réfère dans ce contexte uniquement à un principe reconnu en droit international du droit d'auteur, dénommé «dichotomie d'idée/d'expression» : seul l'expression individuelle est protégée, mais pas l'idée en tant que telle. La rédaction de l'article devrait ainsi préciser qu'une spécification d'une interface constitue toujours une idée, qui ne peut pas être protégée, alors que l'implémentation de l'interface dans un programme d'ordinateur représente son expression et devrait ainsi bénéficier d'une protection selon le droit d'auteur. Or, dans la plupart des cas, la spécification d'une interface est suffisante pour rendre interopérables différents programmes d'ordinateur. 6. La Commission dans sa décision Microsoft a pourtant supposé que les interfaces recherchées par les concurrents de Microsoft pouvaient être protégées par des droits de propriété intellectuelle. En effet, le seul moyen à disposition pour ceux qui veulent rendre interopérables leur programme d'ordinateur et avec celui d'une entreprise dominante est le recours à l'article 82 CE. Ici, la question qui se pose est celle de savoir si le refus de fournir des interfaces constitue un abus d'une position dominante et donc mène à l'octroi d'une licence obligatoire. 7. Dans le contexte des licences obligatoires selon l'article 82 CE, il est courant d'invoquer la relation de conflit entre la propriété intellectuelle et le droit de la concurrence. Or, l'étude démontre que ces deux institutions de droit poursuivent le même but, à savoir l'encouragement au bien-être des consommateurs en stimulant l'innovation. Les objectifs convergent notamment si on définit la concurrence plutôt en tant que concept dynamique. Par conséquent, des restrictions temporaires à la concurrence peuvent être acceptées, si ceci mène à la création de la concurrence à long terme. Pourtant, des conflits potentiels persistent, étant donné qu'on ne peut pas argumenter que chaque restriction à la concurrence effectuée par le titulaire d'un droit de propriété intellectuelle mène à l'incitation de l'innovation à long terme. 8. En réfutant ce dernier argument, l'étude démontre que les droits de propriété intellectuelle ne peuvent pas être généralement exemptés de l'application du droit de la concurrence. Notamment, selon l'état actuel de la jurisprudence, il ne peut être soutenu qu'il existe un noyau dur spécifique du droit de la propriété intellectuelle, qui ne devrait pas être affecté par le droit de la concurrence. L'ordonnance d'une licence obligatoire peut être justifiée sur la base de l'article 82 CE, dans la mesure où la balance d'intérêts démontre un effet positif au bien-être des consommateurs résultant d'une telle licence. En même temps, les droits individuels du propriétaire d'un droit de propriété intellectuelle sont à respecter, surtout la liberté contractuelle et la protection de la propriété. 9. Le droit de la liberté contractuelle et le droit de la propriété sont atteints, si le propriétaire d'un droit, de nature matérielle ou immatérielle, n'a exercé son droit de propriété que pour lui-même, exclusivement, sans jamais avoir démontré la volonté de s'acquitter de ses droits. C'est donc surtout pour protéger ces deux principes de droit que la présente étude fait une distinction majeure entre le refus de contracter et la rupture d'une relation contractuelle. 10. Le premier cas est traité de manière détaillée sous le chapitre de la doctrine des facilités essentielles (EFD). Selon la position prise ici, cette constellation est caractérisée par l'obligation du propriétaire de contracter et ainsi d'établir des relations d'affaires avec ses concurrents. Or, un principe selon lequel les entreprises en position dominante sont obligées d'encourager la concurrence, n'existe pas en droit communautaire. Il est toutefois nécessaire de pouvoir imposer une telle obligation, notamment dans les cas où la concurrence sur un marché ne peut être mise en oeuvre à long terme par un autre moyen et où cette ouverture du marché n'entraîne pas d'obstacles à l'innovation. 11. La constellation particulière des facilités essentielles exige néanmoins un contrôle plus prudent que dans les cas constituant une rupture de relation d'affaires. Cette exigence a été respectée sur base des conditions que l'arrêt Bronner a établit concernant l'essentialité d'une facilité. Même si l'établissement en question remplit toutes les conditions afin d'être qualifié d'essentiel, l'ordonnance d'un accès obligé doit encore passer l'examen d'une balance d'intérêts. Celle-ci mène encore plus rarement à l'octroi d'une licence dans les cas où la facilité est protégée par un droit de propriété intellectuelle. Des exceptions à cette règle existent si le droit de la propriété intellectuelle n'a pas été obtenu par des moyens basés sur le mérite ou si la fonction d'incitation à l'innovation est en doute. 12. L'affaire IMS Health présente un tel cas exceptionnel. La structure recherchée par les concurrents de IMS remplissait, au moment de l'examen de l'affaire par la Commission européenne, tous les critères d'un standard de facto. En outre, au moment du développement de la structure, celle-ci ne bénéficiait pas d'une protection de droit immatérielle. Une telle protection ne lui a été accordée que depuis la transposition de la directive concernant la protection juridique des bases de données en droit d'auteur allemand. Par conséquent, IMS ne pouvait avoir entrepris des investissements dans la construction de la structure, afin de profiter ultérieurement de la protection du droit d'auteur. Ceci affaiblit la présomption selon laquelle l'utilisation exclusive du droit aurait dû être préservée afin de ne pas faire obstacle à l'innovation. 13. Le cas européen de Microsoft se distingue de cette constellation. Les conditions qui ont mené à la décision de la Commission européenne quant à l'attribution d'interopérabilité et ainsi à une licence obligatoire d'interfaces, ont été présenté de manière détaillée dans cette étude. Elles fournissent les meilleures preuves que les «circonstances exceptionnelles », qui ont été déterminantes dans l'affaire Magill de la Cour de justice, à savoir «l'empêchement de la création d'un nouveau produit », le «manque de justification objective » et «l'empêchement de toute concurrence sur un marché en aval distinct », ne peuvent constituer une énumération exhaustive pour l'ordonnance d'une licence obligatoire. 14. En effet, dans l'affaire Microsoft, l'intersection progressive d'interopérabilité entre les systèmes d'exploitation étrangers à Microsoft et des systèmes d'exploitation de Microsoft n'a pas empêché la création de nouveaux produits. Le marché en question, celui des systèmes d'exploitation pour serveur de groupe de travail, avait été créé par l'entreprise Novell. Par conséquent, quand Microsoft a accédé à ce marché, d'autres entreprises en situation d'offre s'y trouvaient déjà avec leurs produits. Il s'en suit que, en 'exigeant de Microsoft des interfaces correspondantes, il s'agissait d'assurer l'interopérabilité avec les produits de Microsoft, et surtout avec l'omniprésent système d'exploitation pour ordinateur PC, afin de maintenir des produits déjà existants sur le marché, et notamment des produits «pionniers »qui avaient pris le risque d'exploiter le marché des systèmes d'exploitation pour serveur de groupe de travail. 15. Une autre circonstance exceptionnelle que celle d'un nouveau produit empêché donne l'impulsion à la thèse qu'une intersection progressive aux interfaces de Microsoft constitue un abus d'une position dominante selon l'article 82 CE : celle du transfert du pouvoir de marché. L'intégration verticale d'une entreprise en position dominante sur un marché qui n'a jusqu'à ce jour été que fourni par celle-ci, et qui rompt des relations contractuelles avec des entreprises agissant sur ce marché, afin d'évincer de la concurrence, constitue un cas de type connu de l'abus, reconnue pour la première fois dans l'arrêt Commercial Solvents de la CJCE: L'entreprise en position dominante utilise son pouvoir sur un marché initial et stratégiquement important et se sert ainsi des avantages, qui ne peuvent être conciliés avec le concept de concurrence par le mérite. 16. Il doit être de même si le bien en question bénéficie d'un droit immatériel, et qu'il s'agit ainsi d'un arrêt d'une licence. En effet, les fonctions, en principe supposées, d'incitation et de mérite, perdent de leur importance si le bien en question a déjà fait objet d'une licence: Il ne peut pas alors être argumenté que le propriétaire d'un droit immatériel doit l'utiliser exclusivement lui-même, afin de profiter des fruits de son mérite. Cet argument particulier de la prise en compte de l'effet d'incitation et de mérite perd d'autant plus de sa pertinence, si l'entreprise en cause ne fournit pas sur le marché dérivé une innovation, mais ne sert juste qu'à vendre un produit déjà préexistant. 17. Dans le domaine de licence de propriété intellectuelle obligatoire selon l'article 82 CE, les juridictions européennes n'ont jusqu'à présent uniquement eu à décider sur des constellations de cas, dans lesquelles le droit n'avait pas été l'objet d'une licence antérieure. Avec le cas Microsoft, le Tribunal de Première Instance a maintenant la possibilité de décider d'une distinction importante à faire en droit de la concurrence entre, d'une part, les cas dans lesquels un droit de propriété intellectuelle n'a pas encore été l'objet d'une licence et de l'autre, ceux dans lesquels il s'agit d'une rupture de licence.

On the transcriptional role of NLRC5 and the function of NLRC5-driven MHC class I expression in the immune system

Major histocompatibility complex (MHC) molecules are of crucial importance for the immune system to recognize and defend the body against external attacks. Foreign antigens are presented by specialized cells, called antigen presenting cells, to T lymphocytes in the context of MHC molecules, thereby inducing T cell activation. In addition, MHC molecules are essential for Natural Killer (NK) cell biology, playing a role in NK cell education and activation. Recently, the NOD-like receptor (NLR) family member NLRC5 (NLR caspase recruitment domain containing protein 5) was found to act as transcriptional regulator of MHC class I, in particular in T and NK cells. Its role in MHC class I expression is however minor in dendritic cells (DCs). This raised the question of whether inflammatory conditions, which augment the levels of NLRC5 in DCs, could increase its contribution to MHC class I expression. Our work shows that MHC class I transcript and intracellular levels depend on NLRC5, while its role in MHC class I surface expression is instead negligible. We describe however a general salvage mechanism that enables cells with low intracellular MHC class I levels to nevertheless maintain relatively high MHC class I on the cell surface. In addition, we lack a thorough understanding of NLRC5 target gene specificity and mechanism of action. Our work delineates the unique consensus sequence in MHC class I promoters required for NLRC5 recruitment and pinpoints conserved features conferring its specificity. Furthermore, through genome-wide analyses, we confirm that NLRC5 regulates classical MHC class I genes and identify novel target genes all encoding non-classical MHC class I molecules exerting an array of functions in immunity and tolerance. We finally asked why a dedicated factor co-regulates MHC class I expression specifically in T and NK lymphocytes. We show that deregulated NLRC5 expression affects the education of NK cells and alters the crosstalk between T and NK cells, leading to NK cell-mediated killing of T lymphocytes. Altogether this thesis work brings insights into molecular and physiological aspects of NLRC5 function, which might help understand certain aspects of immune responses and disorders. -- Les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) sont essentielles au système immunitaire pour l'initiation de la réponse immunitaire. En effet, l'activation des lymphocytes T nécessite la reconnaissance d'un antigène étranger présenté par les cellules présentatrices d'antigènes sur une molécule du CMH. Les molécules du CMH ont également un rôle fondamental pour la fonction des cellules Natural Killer (NK) puisqu'elles sont nécessaires à leur processus d'éducation et d'activation. Récemment, NLRC5 (NLR caspase recruitment domain containing protein 5), un membre de la famille des récepteurs de type NOD (NLRs), a été décrit comme un facteur de transactivation de l'expression des gènes du CMH de classe I. A l'état basai, cette fonction transcriptionnelle est essentielle dans les lymphocytes T et NK, alors que ce rôle reste mineur pour l'expression des molécules du CMH de classe I dans les cellules dendritiques (DCs). Dans des conditions inflammatoires, l'expression de NLRC5 augmente dans les DCs. Notre travail démontre que, dans ces conditions, les transcrits et les niveaux intracellulaires des molécules du CMH de classe I augmentent aussi d'une façon dépendante de NLRC5. A contrario, le rôle de NLRC5 sur les niveaux de molécules de surface reste minoritaire. Cette observation nous a conduits à l'identification d'un mécanisme général de compensation qui permet aux cellules de maintenir des niveaux relativement élevés de molécules de CMH de class I à leur surface malgré de faibles niveaux intracellulaires. De plus, il semblait nécessaire de s'orienter vers une approche plus globale afin de déterminer l'étendue de la fonction transcriptionnelle de NLRC5. Par une approche du génome entier, nous avons pu décrire une séquence consensus conservée présente dans les promoteurs des gènes du CMH de classe I, sur laquelle NLRC5 est spécifiquement recruté. Nous avons pu également identifier de nouveaux gènes cibles codant pour des molécules de CMH de classe I non classiques impliqués dans l'immunité et la tolérance. Finalement, nous nous sommes demandé quel est l'intérêt d'avoir un facteur transcriptionnel, en l'occurrence NLRC5, qui orchestre l'expression du CMH de classe I dans les lymphocytes T et NK. Nous montrons que la dérégulation de l'expression de NLRC5 affecte l'éducation des cellules NK et conduit à la mort cellulaire des lymphocytes T médiée par les cellules NK. Dans l'ensemble ce travail de thèse contribue à la caractérisation du rôle de NLRC5, tant au niveau moléculaire que physiologique, ce qui présente un intérêt dans le cadre de la compréhension de certains aspects physiopathologique de la réponse immunitaire.

T cells at the site of autoimmune inflammation show increased potential for trogocytosis

Les lymphocytes T CD4+ sont connus pour leur potentiel d'acquisition de fragments membraneux de cellules présentatrices d'antigène (CPA) dans un processus nommé trogocytose. Ce phénomène est observé lors de l'interaction entre le lymphocyte T CD4+ antigène-spécifique et la CPA lors de la présentation de l'antigène en question, et dépend donc de la spécificité du lymphocyte T CD4+. L'identification des lymphocytes T CD4+ sujets à la trogocytose en co-culture avec des CPA chargées d'un antigène connu permet d'enrichir des lymphocytes T antigène-spécifiques sans connaître leur spécificité exacte ou leur profil de production de cytokines. Dans cette étude, nous avons donc cherché à évaluer l'utilité de cette méthode dans l'identification de la spécificité des lymphocytes T effecteurs et régulateurs lors de l'inflammation auto-immune avec des spécificités souvent inconnues. La trogocytose a démontré son efficacité dans la détection de lymphocytes T réactifs à la protéine basique de myéline in vitro ainsi qu'ex vivo après immunisation. Cependant, le potentiel de la trogocytose à identifier des lymphocytes T régulateurs antigène-spécifiques est limité par le fait que les lymphocytes T régulateurs Foxp3+ montrent un taux élevé de manière constitutive de trogocytose comparé aux lymphocytes T Foxp3-, Un taux localement élevé de trogocytose lors d'un état inflammatoire (observé au niveau des lymphocytes T effecteurs et régulateurs isolés du système nerveux central enflammé) empêche l'utilisation de la trogocytose dans l'évaluation de la réactivité antigénique de cellules extraites d'un site inflammatoire. Nos résultats montrent la possibilité d'enrichir des lymphocytes T conventionnels antigène- réactifs en périphérie par détection au moyen de la trogocytose. Nous avons aussi montré les limitations de cette méthode dans sa capacité d'identifier des lymphocytes T effecteurs et régulateurs antigène- réactifs extraits de sites inflammatoires. Le potentiel de trogocytose élevé dans les sites d'inflammation soulève la question de la signification biologique de ce phénomène dans l'inflammation, dans la suppression médiée par les lymphocytes T régulateurs et dans le maintien de la tolérance immunologique dans des états de santé variables.