Diagnostic methods and treatment options for focal cortical dysplasia.

Our inability to adequately treat many patients with refractory epilepsy caused by focal cortical dysplasia (FCD), surgical inaccessibility and failures are significant clinical drawbacks. The targeting of physiologic features of epileptogenesis in FCD and colocalizing functionality has enhanced completeness of surgical resection, the main determinant of outcome. Electroencephalography (EEG)-functional magnetic resonance imaging (fMRI) and magnetoencephalography are helpful in guiding electrode implantation and surgical treatment, and high-frequency oscillations help defining the extent of the epileptogenic dysplasia. Ultra high-field MRI has a role in understanding the laminar organization of the cortex, and fluorodeoxyglucose-positron emission tomography (FDG-PET) is highly sensitive for detecting FCD in MRI-negative cases. Multimodal imaging is clinically valuable, either by improving the rate of postoperative seizure freedom or by reducing postoperative deficits. However, there is no level 1 evidence that it improves outcomes. Proof for a specific effect of antiepileptic drugs (AEDs) in FCD is lacking. Pathogenic mutations recently described in mammalian target of rapamycin (mTOR) genes in FCD have yielded important insights into novel treatment options with mTOR inhibitors, which might represent an example of personalized treatment of epilepsy based on the known mechanisms of disease. The ketogenic diet (KD) has been demonstrated to be particularly effective in children with epilepsy caused by structural abnormalities, especially FCD. It attenuates epigenetic chromatin modifications, a master regulator for gene expression and functional adaptation of the cell, thereby modifying disease progression. This could imply lasting benefit of dietary manipulation. Neurostimulation techniques have produced variable clinical outcomes in FCD. In widespread dysplasias, vagus nerve stimulation (VNS) has achieved responder rates >50%; however, the efficacy of noninvasive cranial nerve stimulation modalities such as transcutaneous VNS (tVNS) and noninvasive (nVNS) requires further study. Although review of current strategies underscores the serious shortcomings of treatment-resistant cases, initial evidence from novel approaches suggests that future success is possible.

Functional impact of genetic variation on gene expression

Numerous links between genetic variants and phenotypes are known and genome-wide association studies dramatically increased the number of genetic variants associated with traits during the last decade. However, how changes in the DNA perturb the molecular mechanisms and impact on the phenotype of an organism remains elusive. Studies suggest that many traitassociated variants are in the non-coding region of the genome and probably act through regulation of gene expression. During my thesis I investigated how genetic variants affect gene expression through gene regulatory mechanisms. The first chapter was a collaborative project with a pharmaceutical company, where we investigated genome-wide copy number variation (CNVs) among Cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis) used in pharmaceutical studies, and associated them to changes in gene expression. We found substantial copy number variation and identified CNVs linked to tissue-specific expression changes of proximal genes. The second and third chapters focus on genetic variation in humans and its effects on gene regulatory mechanisms and gene expression. The second chapter studies two human trios, where the allelic effects of genetic variation on genome-wide gene expression, protein-DNA binding and chromatin modifications were investigated. We found abundant allele specific activity across all measured molecular phenotypes and show extended coordinated behavior among them. In the third chapter, we investigated the impact of genetic variation on these phenotypes in 47 unrelated individuals. We found that chromatin phenotypes are organized into local variable modules, often linked to genetic variation and gene expression. Our results suggest that chromatin variation emerges as a result of perturbations of cis-regulatory elements by genetic variants, leading to gene expression changes. The work of this thesis provides novel insights into how genetic variation impacts gene expression by perturbing regulatory mechanisms. -- De nombreux liens entre variations génétiques et phénotypes sont connus. Les études d'association pangénomique ont considérablement permis d'augmenter le nombre de variations génétiques associées à des phénotypes au cours de la dernière décennie. Cependant, comprendre comment ces changements perturbent les mécanismes moléculaires et affectent le phénotype d'un organisme nous échappe encore. Des études suggèrent que de nombreuses variations, associées à des phénotypes, sont situées dans les régions non codantes du génome et sont susceptibles d'agir en modifiant la régulation d'expression des gènes. Au cours de ma thèse, j'ai étudié comment les variations génétiques affectent les niveaux d'expression des gènes en perturbant les mécanismes de régulation de leur expression. Le travail présenté dans le premier chapitre est un projet en collaboration avec une société pharmaceutique. Nous avons étudié les variations en nombre de copies (CNV) présentes chez le macaque crabier (Macaca fascicularis) qui est utilisé dans les études pharmaceutiques, et nous les avons associées avec des changements d'expression des gènes. Nous avons découvert qu'il existe une variabilité substantielle du nombre de copies et nous avons identifié des CNVs liées aux changements d'expression des gènes situés dans leur voisinage. Ces associations sont présentes ou absentes de manière spécifique dans certains tissus. Les deuxième et troisième chapitres se concentrent sur les variations génétiques dans les populations humaines et leurs effets sur les mécanismes de régulation des gènes et leur expression. Le premier se penche sur deux trios humains, père, mère, enfant, au sein duquel nous avons étudié les effets alléliques des variations génétiques sur l'expression des gènes, les liaisons protéine-ADN et les modifications de la chromatine. Nous avons découvert que l'activité spécifique des allèles est abondante abonde dans tous ces phénotypes moléculaires et nous avons démontré que ces derniers ont un comportement coordonné entre eux. Dans le second, nous avons examiné l'impact des variations génétiques de ces phénotypes moléculaires chez 47 individus, sans lien de parenté. Nous avons observé que les phénotypes de la chromatine sont organisés en modules locaux, qui sont liés aux variations génétiques et à l'expression des gènes. Nos résultats suggèrent que la variabilité de la chromatine est due à des variations génétiques qui perturbent des éléments cis-régulateurs, et peut conduire à des changements dans l'expression des gènes. Le travail présenté dans cette thèse fournit de nouvelles pistes pour comprendre l'impact des différentes variations génétiques sur l'expression des gènes à travers les mécanismes de régulation.

Genetic associations at 53 loci highlight cell types and biological pathways relevant for kidney function.

Reduced glomerular filtration rate defines chronic kidney disease and is associated with cardiovascular and all-cause mortality. We conducted a meta-analysis of genome-wide association studies for estimated glomerular filtration rate (eGFR), combining data across 133,413 individuals with replication in up to 42,166 individuals. We identify 24 new and confirm 29 previously identified loci. Of these 53 loci, 19 associate with eGFR among individuals with diabetes. Using bioinformatics, we show that identified genes at eGFR loci are enriched for expression in kidney tissues and in pathways relevant for kidney development and transmembrane transporter activity, kidney structure, and regulation of glucose metabolism. Chromatin state mapping and DNase I hypersensitivity analyses across adult tissues demonstrate preferential mapping of associated variants to regulatory regions in kidney but not extra-renal tissues. These findings suggest that genetic determinants of eGFR are mediated largely through direct effects within the kidney and highlight important cell types and biological pathways.

Characterization of a MAF1 knockout mouse model

L'ARN polymérase 3 transcrit un petit groupe de gènes fortement exprimés et impliqués dans plusieurs mécanismes moléculaires. Les ARNs de transfert ou ARNt représentent plus ou moins la moitié du transcriptome de l'ARN polymérase 3. Ils sont directement impliqués dans la traduction des protéines en agissant comme transporteurs d'acides aminés qui sont incorporés à la chaîne naissante de polypeptides. Chez des levures cultivées dans un milieu jusqu'à épuisement des nutriments, Maf1 réprime la transcription par l'ARN polymérase 3, favorisant ainsi l'économie énergétique cellulaire. Dans un modèle de cellules de mammifères, MAF1 réprime aussi la transcription de l'ARN polymérase 3 dans des conditions de stress, cependant il n'existe aucune donnée quant à son rôle chez un mammifère vivant. Pendant mon doctorat, j'ai utilisé une souris délétée pour le gène Maf1 afin de connaître les effets de ce gène chez un mammifère. Etonnamment, la souris Maf1-­‐/-­‐ est résistante à l'obésité même si celle-­‐ci est nourrie avec une nourriture riche en matières grasses. Des études moléculaires et de métabolomiques ont montré qu'il existe des cycles futiles de production et dégradation des lipides et des ARNt, ce qui entraîne une augmentation de la dépense énergique et favorise la résistance à l'obésité. En plus de la caractérisation de la souris Maf1-­‐/-­‐, pendant ma thèse j'ai également développé une méthode afin de normaliser les données de ChIP-­‐sequencing. Cette méthode est fondée sur l'utilisation d'un contrôle interne, représenté ici par l'ajout d'une quantité fixe de chromatine provenant d'un organisme différent de celui étudié. La méthode a amélioré considérablement la reproductibilité des valeurs entre réplicas biologiques. Elle a aussi révélé des différences entre échantillons issus de conditions différentes. Une occupation supérieure de l'ARN polymérase 3 sur les gènes Pol 3 chez les souris Maf1 KO entraîne une augmentation du niveau de précurseurs d'ARNt, ayant pour effet probable la saturation de la machinerie de maturation des ARNt. En effet, chez les souris Maf1 KO, le pourcentage d'ARNt modifiés est plus faible que chez les souris type sauvage. Ce déséquilibre entre le niveau de précurseurs et d'ARNt matures entraîne une diminution de la traduction protéique. Ces résultats ont permis d'identifier de nouvelles fonctions pour la protéine MAF1, comme étant une protéine régulatrice à la fois de la transcription mais aussi de la traduction et en étant un cible potentielle au traitement à l'obésité. -- RNA polymerase III (Pol 3) transcribes a small set of highly expressed genes involved in different molecular mechanisms. tRNAs account for almost half of the Pol 3 transcriptome and are involved in translation, bringing a new amino into the nascent polypeptide chain. In yeast, under nutrient deprivation, Maf1 acts for cell energetic economy by repressing Pol 3 transcription. In mammalian cells, MAF1 also represses Pol 3 activity under conditions of serum deprivation or DNA damages but nothing is known about its role in a mammalian organism. During my thesis studies, I used a Maf1 KO mouse model to characterize the effects of Maf1 deletion in a living animal. Surprisingly, the MAF1 KO mouse developed an unexpected phenotype, being resistant to high fat diet-­‐induced obesity and displaying an extended lifespan. Molecular and metabolomics characterizations revealed futile cycles of lipids and tRNAs, which are produced and immediately degraded, which increases energy consumption in the Maf1 KO mouse and probably explains in part the protection to obesity. Additionally to the mouse characterization, I also developed a method to normalize ChIP-­‐seq data, based on the addition of a foreign chromatin to be used as an internal control. The method improved reproducibility between replicates and revealed differences of Pol 3 occupancy between WT and Maf1 KO samples that were not seen without normalization to the internal control. I then established that increased Pol 3 occupancy in the Maf1 KO mouse liver was associated with increased levels of tRNA precursor but not of mature tRNAs, the effective molecules involved in translation. The overproduction of precursor tRNAs associated with the deletion of Maf1 apparently overwhelms the tRNA processing machinery as the Maf1 KO mice have lower levels of fully modified tRNAs. This maturation defect directly impacts on translation efficiency as polysomic fractions and newly synthetized protein levels were reduced in the liver of the Maf1 KO mouse. Altogether, these results indicate new functions for MAF1, a regulator of both transcription and translation as well as a potential target for obesity treatment.

Profound hyperglycemia in knockout mutant mice identifies novel function for POU4F2/Brn-3b in regulating metabolic processes.

The POU4F2/Brn-3b transcription factor has been identified as a potentially novel regulator of key metabolic processes. Loss of this protein in Brn-3b knockout (KO) mice causes profound hyperglycemia and insulin resistance (IR), normally associated with type 2 diabetes (T2D), whereas Brn-3b is reduced in tissues taken from obese mice fed on high-fat diets (HFD), which also develop hyperglycemia and IR. Furthermore, studies in C2C12 myocytes show that Brn-3b mRNA and proteins are induced by glucose but inhibited by insulin, suggesting that this protein is itself highly regulated in responsive cells. Analysis of differential gene expression in skeletal muscle from Brn-3b KO mice showed changes in genes that are implicated in T2D such as increased glycogen synthase kinase-3β and reduced GLUT4 glucose transporter. The GLUT4 gene promoter contains multiple Brn-3b binding sites and is directly transactivated by this transcription factor in cotransfection assays, whereas chromatin immunoprecipitation assays confirm that Brn-3b binds to this promoter in vivo. In addition, correlation between GLUT4 and Brn-3b in KO tissues or in C2C12 cells strongly supports a close association between Brn-3b levels and GLUT4 expression. Since Brn-3b is regulated by metabolites and insulin, this may provide a mechanism for controlling key genes that are required for normal metabolic processes in insulin-responsive tissues and its loss may contribute to abnormal glucose uptake.