Activation of p53 by nutlin-3a induces apoptosis and cellular senescence in human glioblastoma multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and aggressive primary brain tumor in adults. Despite concerted efforts to improve current therapies and develop novel clinical approaches, patient survival remains poor. As such, increasing attention has focused on developing new therapeutic strategies that specifically target the apoptotic pathway in order to improve treatment responses. Recently, nutlins, small-molecule antagonists of MDM2, have been developed to inhibit p53-MDM2 interaction and activate p53 signaling in cancer cells. Glioma cell lines and primary cultured glioblastoma cells were treated with nutlin-3a. Nutlin-3a induced p53-dependent G1- and G2-M cell cycle arrest and apoptosis in glioma cell lines with normal TP53 status. In addition, nutlin-arrested glioma cells show morphological features of senescence and persistent induction of p21 protein. Furthermore, senescence induced by nutlin-3a might be depending on mTOR pathway activity. In wild-type TP53 primary cultured cells, exposure to nutlin-3a resulted in variable degrees of apoptosis as well as cellular features of senescence. Nutlin-3a-induced apoptosis and senescence were firmly dependent on the presence of functional p53, as revealed by the fact that glioblastoma cells with knockdown p53 with specific siRNA, or cells with mutated or functionally impaired p53 pathway, were completely insensitive to the drug. Finally, we also found that nutlin-3a increased response of glioma cells to radiation therapy. The results provide a basis for the rational use of MDM2 antagonists as a novel treatment option for glioblastoma patients.

Activation of p53 by nutlin-3a induces apoptosis and cellular senescence in human glioblastoma multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and aggressive primary brain tumor in adults. Despite concerted efforts to improve current therapies and develop novel clinical approaches, patient survival remains poor. As such, increasing attention has focused on developing new therapeutic strategies that specifically target the apoptotic pathway in order to improve treatment responses. Recently, nutlins, small-molecule antagonists of MDM2, have been developed to inhibit p53-MDM2 interaction and activate p53 signaling in cancer cells. Glioma cell lines and primary cultured glioblastoma cells were treated with nutlin-3a. Nutlin-3a induced p53-dependent G1- and G2-M cell cycle arrest and apoptosis in glioma cell lines with normal TP53 status. In addition, nutlin-arrested glioma cells show morphological features of senescence and persistent induction of p21 protein. Furthermore, senescence induced by nutlin-3a might be depending on mTOR pathway activity. In wild-type TP53 primary cultured cells, exposure to nutlin-3a resulted in variable degrees of apoptosis as well as cellular features of senescence. Nutlin-3a-induced apoptosis and senescence were firmly dependent on the presence of functional p53, as revealed by the fact that glioblastoma cells with knockdown p53 with specific siRNA, or cells with mutated or functionally impaired p53 pathway, were completely insensitive to the drug. Finally, we also found that nutlin-3a increased response of glioma cells to radiation therapy. The results provide a basis for the rational use of MDM2 antagonists as a novel treatment option for glioblastoma patients.

TP53 induced glycolysis and apoptosis regulator (TIGAR) knockdown results in radiosensitization of glioma cells

Background and purpose: The TP53 induced glycolysis and apoptosis regulator (TIGAR) functions to lower fructose-2,6-bisphosphate (Fru-2,6-P2) levels in cells, consequently decreasing glycolysis and leading to the scavenging of reactive oxygen species (ROS), which correlate with a higher resistance to cell death. The decrease in intracellular ROS levels in response to TIGAR may also play a role in the ability of p53 to protect from the accumulation of genomic lesions. Given these good prospects of TIGAR for metabolic regulation and p53-response modulation, we analyzed the effects of TIGAR knockdown in U87MG and T98G glioblastoma-derived cell lines. Methods/results: After TIGAR-knockdown in glioblastoma cell lines, different metabolic parameters were assayed, showing an increase in Fru-2,6-P2, lactate and ROS levels, with a concomitant decrease in reduced glutathione (GSH) levels. In addition, cell growth was inhibited without evidence of apoptotic or autophagic cell death. In contrast, a clear senescent phenotype was observed. We also found that TIGAR protein levels were increased shortly after irradiation. In addition, avoiding radiotherapy-triggered TIGAR induction by gene silencing resulted in the loss of capacity of glioblastoma cells to form colonies in culture and the delay of DNA repair mechanisms, based in c-H2AX foci, leading cells to undergo morphological changes compatible with a senescent phenotype. Thus, the results obtained raised the possibility to consider TIGAR as a therapeutic target to increase radiotherapy effects. Conclusion: TIGAR abrogation provides a novel adjunctive therapeutic strategy against glial tumors by increasing radiation-induced cell impairment, thus allowing the use of lower radiotherapeutic doses.

Anàlisi de l'expressió de gens de proteïnes de cohesió cromosòmica en oòcits humans

Projecte de recerca elaborat a partir d’una estada al Mount Sinai School Mountain, Estats Units, entre abril i juliol del 2007. Les aneuploïdies cromosòmiques en humans constitueixen un problema genètic amb gran repercussió clínica i social. Afecten un 5% dels embarassos reconeguts clínicament i la seva incidència augmenta amb l’edat materna Les aneuploïdies estan íntimament lligades al procés d’oogènesi, que ha demostrat ser un procés que tendeix encara més a l’error a mesura que la dona envelleix. Estudis recents realitzats en ratolí han demostrat que la deficiència d’una proteïna de cohesió cromosòmica (SMC1b) provoca l’aparició d’aneuploïdies i que augmenta amb l’edat, similarment a la situació en la dona. Fins al moment, però, no hi ha estudis al respecte en l’espècie humana. Durant l’estada es va posar a punt una metodologia per analitzar l’expressió de SMC1b en oòcits humans, amb la finalitat de demostrar si la seva expressió disminueix a mesura que la dona envelleix, i pot explicar l’efecte de l’edat materna sobre la taxa d’aneuploïdies.

Organització nuclear dels gens que codifiquen per a les proteïnes làcties en cèlules epitelials mamàries en diferents estadis de desenvolupament

Estudi realitzat a partir d’una estada al Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), a França, entre 2006 i 2008. En el ultims anys, estudis realitzats en diferents tipus cel•lulars han pogut determinar l’importància de l’organització nuclear en el control i regulació gènica. S’han realizat diferents experiments per tal de determinar si la posició dels gens de les proteïnes làcties en el nucli interfàsic de cel•lules epitelials mamaries és important per regular la seva expressió. Els gens de les proteïnes de la llet s’expressen a la glàndula mamaria durant la lactació en resposta a les hormones lactogèniques (majoritàriament prolactina i glucocorticoids). Mitjançant la tècnica de FISH (fluorescent in situ hibridization) en 3D s’ha caracteritzat la localització nuclear del gens WAP (whey acidic protein) i les caseïnes en cèl•lules epitelials mamaries de ratolí (HC11) cultivades en l’absència i presencia d’hormones lactogèniques. En absència d’hormones, els dos gens estan distribuïts dins del nucli de forma no aleatòria, el gen WAP es troba localitzat en l’interior del nucli, mentre que les caseïnes es troben localitzades prop de la perifèria nuclear. L’estimulació hormonal indueix un canvi significatiu en la distància dels dos gens a la perifèria nuclear. Així mateix, la posició del locus de la caseïna en relació al seu territori cromosòmic (CT) 5 està correlacionada amb la inducció hormonal i per tant amb la seva activació transcripcional, mentre que la posició del gen WAP amb relació al seu CT11 sembla més determinada pel context cromosòmic del gen. Per últim, no s’han trobat diferencies en la localització dels gens en relació a l'heterocromatina del centròmer, descrit com a compartiment repressiu, entre les cèl•lules estimulades amb hormones i les que no. En els dos casos s’ha trobat un gran percentatge de gens que no estan associats als centròmers.

Manipulació genètica de vectors virals per a estratègies de teràpia gènica en malalties autoimmunes

Els tractaments actuals per a la Malaltia de Crohn es basen en l’administració de proteïnes recombinants amb capacitat immunosupressora. Aquests tractaments són sistèmics, crònics i causen el desenvolupament d’efectes secundaris severs com infeccions amb patògens oportunistes i una major incidència de tumors. Passar d’una administració sistèmica dels immunosupressors a una administració local sembla clau per evitar la severitat i el nombre de complicacions secundàries. Ha sigut descrit recentment que el subconjunt cel•lular Th-17 juga un paper central en moltes malalties autoimmunes en humans, com ara la Malaltia de Crohn, Escleroderma, Artritis reumatoide o Psoriasis. Per determinar com la via del Th-17 es veu afectada durant el desenvolupament i els estadis aguts de la malaltia, analitzarem una gran bateria de interleuquines/citoquines i els mecanismes intracel•lulars d’activació/inhibició de l’activitat de les cèl•lules del Sistema Immune. En un segon pas, clonarem els gens seleccionats relacionats amb la immunomodulació de la via del Th-17 en vectors recentment desenvolupats (adenovirus quimera 5/40 o diferents pseudotips d’AAVs ), ja que hipotitzem que una producció local d’immunomoduladors s’assolirà amb una eficiència major fent servir aquests vectors, evitant així els efectes secundaris. A aquests efectes, hem començat el projecte clonant els gens de la IL10 i del receptor transmembrenal de la IL23 en adenovirus i en genomes d’AAV.

Estudi descriptiu de Tumors Germinals Seminoma (TGS) en un centre de Referència. 15 anys d'experiència.

El tumor germinal seminoma (TGS) suposa un 50% de tots els tumors testiculars, i tot i l'excel•lent pronòstic a llarg plaç, està experimentant un increment de la incidència en un grup de la població d’entre 15-35 anys. L'Hospital de la Santa Creu i Sant Pau (HSCSP) juntament amb Fundació Puigvert són centre de referència en el maneig del TGS. La intenció el treball és reportar de manera descriptiva i retrospectiva l’experiència acumulada en aquest centre al llarg dels últims 15 anys. L'aportació d'aquest estudi pretén unir esforços per tal de disminuir tractaments innecessaris en gran part dels estadis I i intentar aportar més dades en favor del tractament adaptat al risc. En aquest sentit, ha de ser un motiu més per intentar validar factors pronòstics ferms en futurs estudis i poder posicionar la teràpia adaptada al risc en una situació protocolitzada i consensuada a nivell internacional.

Neuroendocrine Tumors (NETs): A population-based study of incidence and survival in Girona province, 1994-2004

Els tumors neuroendocrins (TNEs) són un grup de neoplàsies poc freqüents i heterogènies i amb un ampli espectre d’agressivitat. Hi ha molt poca informació epidemiològica a nivell mundial, l’objectiu d’aquest estudi ha estat el de reportar-ne les dades a la província de Girona. Hem inclòs tots els codis de la ICD-O3 que codifiquen un TNE, període 1994-2002. Hem identificat 698 tumors. Es reporten les dades tant de la casuística com les taxes d’incidència i supervivència de cada TNE per separat. Els resultats són consistents amb les publicacions europees. El fet d’haver reportat la incidència i la supervivència dels TNEs a Girona contribueix a un millor coneixement d’aquestes neoplàsies.

Morbiditat postoperatòria en pacients intervinguts d’un adenoma hipofisari: comparació dels tumors no funcionants i dels secretors d’hormona de creixement i corticotropa

La neurocirurgia és el tractament definitiu més utilitzat pels tumors hipofisaris. Objectiu: valorar les complicacions postquirúrgiques immediates(1º mes) i durant el 1º any dels adenomes hipofisaris secretors de GH, ACTH i no funcionants(NF) operats des del 2001. Metodologia: estudi observacional restrospectiu de 94 pacients (39H, 55D) amb edat a la cirurgia de 46,9±15,5 anys, intervinguts pels 2 mateixos neurocirurgians. Resultats: 40 pacients tenen alguna complicació immediata(42,5% dels NF, 37% GH i 48,5% ACTH) sense diferències en la freqüència de complicacions entre els 3 grups. Les complicacions més freqüents són: diabetis insípida transitòria(23,4%), fístula LCR(6,7%), sinusitis i meningitis(2,2%). Els secretors d'ACTH tenen una tendència a tenir més DI transitòria i sinusitis respecte els NF(p=0,071), mentre que els NF tendeixen a presentar més fístules LCR, meningitis i convulsions(p=0,08). En els GH, existeix major incidència de fístules LCR comparat amb els ACTH(p&0,05), sense diferències amb els NF. 10 pacients tenen complicacions al 1º any postquirúrgic(7,5% dels NF, 11,1% GH i 14,8% ACTH), destacant major incidència d'artromiàlgies i síndrome del túnel carpià en els ACTH comparat amb els altres 2 grups (p&0,05). Les variables més importants quan fem una predicció d'aparició de complicacions són: tipus de cirurgia utilitzada (més a craniotomies que als abordatges transesfenoidals) i presència d'extensió extraselar tumoral, sense ser significatiu(p=0,091). Conclusions: malgrat que els tumors d'ACTH són majoritàriament microdenomes(77,7%), i es presenten en pacients més joves, tendeixen a associar-se a major nombre de complicacions immediates i durant el primer any en comparació amb els NF i GH(97,5%, 81,4% macroadenomes respectivament).

“Unmixing” Tissue Gene Expression Signatures from Tumor Biopsies

Emergent molecular measurement methods, such as DNA microarray, qRTPCR, andmany others, offer tremendous promise for the personalized treatment of cancer. Thesetechnologies measure the amount of specific proteins, RNA, DNA or other moleculartargets from tumor specimens with the goal of “fingerprinting” individual cancers. Tumorspecimens are heterogeneous; an individual specimen typically contains unknownamounts of multiple tissues types. Thus, the measured molecular concentrations resultfrom an unknown mixture of tissue types, and must be normalized to account for thecomposition of the mixture.For example, a breast tumor biopsy may contain normal, dysplastic and cancerousepithelial cells, as well as stromal components (fatty and connective tissue) and bloodand lymphatic vessels. Our diagnostic interest focuses solely on the dysplastic andcancerous epithelial cells. The remaining tissue components serve to “contaminate”the signal of interest. The proportion of each of the tissue components changes asa function of patient characteristics (e.g., age), and varies spatially across the tumorregion. Because each of the tissue components produces a different molecular signature,and the amount of each tissue type is specimen dependent, we must estimate the tissuecomposition of the specimen, and adjust the molecular signal for this composition.Using the idea of a chemical mass balance, we consider the total measured concentrationsto be a weighted sum of the individual tissue signatures, where weightsare determined by the relative amounts of the different tissue types. We develop acompositional source apportionment model to estimate the relative amounts of tissuecomponents in a tumor specimen. We then use these estimates to infer the tissuespecificconcentrations of key molecular targets for sub-typing individual tumors. Weanticipate these specific measurements will greatly improve our ability to discriminatebetween different classes of tumors, and allow more precise matching of each patient tothe appropriate treatment

Estudi de la relació estructura-funció de les proteïnes CPT1

En aquest treball s’ha analitzat la relació estructura-funció dels enzims CPT1, o Carnitina palmitoïltransferasa 1, que catalitza la reacció de transesterificació dels àcids grassos de cadena llarga a acil-carnitines, per tal que puguin accedir a la matriu mitocondrial i ser oxidats. Aquest enzim es troba estrictament regulat per malonil-CoA, primer intermediari de la síntesi d’àcids grassos, establint-se així una regulació coordinada entre la formació i la degradació de grasses. S’han estudiat els tres isotips de CPT1 descrits fins al moment: CPT1A, CPT1B i CPT1C. Mitjançant l’expressió heteròloga de mutants de CPT1A de rata i CPT1B de porc en el llevat P. pastoris, s’ha estudiat l’efecte sobre la inhibició per malonil-CoA de petits canvis en la seva estructura, per tal de trobar una relació entre la seva funció enzimàtica i la disposició conformacional de la proteïna. Segons els resultats obtinguts, el residu Glu590 de CPT1A de rata estaria impedint la unió de l’inhibidor, mentre que el residu Met593 estaria afavorint aquesta unió. Els estudis amb l’enzim CPT1B de porc demostraren l’existència d’un determinant positiu per la sensibilitat al malonil-CoA en els primers 18 residus de la proteïna, i definiren la posició Glu17 com la responsable de l’alta afinitat a la carnitina i la baixa sensibilitat a la inhibició per malonil-CoA (8). Es clonà i caracteritzà la regió promotora del gen de CPT1C humana, amb la intenció d’analitzar la funcionalitat de putatius elements de resposta identificats in silico. Cap dels elements estudiats resultà ser funcional in vivo. A més, es demostrà que la manca d’activitat catalítica de la proteïna no és deguda a l’extensió C-terminal que presenta respecte els isotips A i B, tot i presentar un alt percentatge d’identitat de seqüència. S’ha amplificat una isoforma humana de CPT1C (Pubmed Acc. Num. AK299866), corresponent a la regió carboxiterminal de la proteïna, que es pretén utilitzar per obtenir el primer cristall de la part soluble d’una proteïna CPT1.     

Comparativa de dues eines de software pel desenvolupament de classificadors d'espectroscòpia de ressonància magnètica nuclear de tumors cerebrals humans

En aquest treball s’ha fet una avaluació comparativa dels resultats que es poden obtenir amb el software SpectraClassifier 1.0 (SC) desenvolupat al nostre grup de recerca, comparant‐lo amb l’SPSS, un programa estadístic informàtic estàndard, en un problema de classificació de tumors cerebrals humans amb dades d’espectroscopia de ressonància magnètica de protó (1H‐ERM). El interès d’aquesta avaluació comparativa radica en la documentació dels resultats obtinguts amb els dos sistemes quan en la correcció dels resultats obtinguts, així com ponderar la versatilitat i usabilitat dels dos paquets de software per a una aplicació concreta d’interès al treball del GABRMN. Per a aquest treball s’han utilitzat dades provinents de dos projecte europeus multicèntrics (INTERPRET i eTumour) en els quals vam participar. Les classes tumorals utilitzades (d’un total de 217 pacients) han sigut les majoritàries des del punt de vista epidemiològic: glioblastoma multiforme, metàstasi, astrocitomes de grau II, ligodendrogliomes de grau II, oligoastrocitomes de grau II i meningiomes de baix grau. Amb les dades d’aquests pacients s’han dissenyat classificadors basats en l’anàlisi discriminant lineal (LDA), s’han avaluat amb diferents mètodes matemàtics i s’han testat amb dades independents. Els resultats han estat satisfactoris, obtenint amb l’SC resultats més robusts amb dades independents respecte la classificació realitzada per l’SPSS.

Estudi de la interacció de tres complexos de Pt amb proteïnes i oligonucleòtids mitjançant ESI-MS

En aquest treball s’investiga la reactivitat de tres complexos de Pt, cisplatí, complex 1, [Pt(dmba)(aza-N1)(dmso)], complex 2, i [Pt(dmba)(N9-9AA)(PPh3)]+, complex 3; els quals presenten activitat antitumoral, amb diferents proteïnes i oligonucleòtids mitjançant espectrometria de masses (ESI-TOF MS). ). L’estudi del cisplatí, 1, droga molt coneguda i emprada avui en dia pel tractament de molts tipus de càncer, permet comparar la reactivitat dels nous complexos d’estudi, 2 i 3, els quals presenten un IC50 més baix que el cisplatí en algunes línies de cèl·lules tumorals.

ß-Catenin Regulation during the Cell Cycle: Implications in G2/M and Apoptosis

ß-catenin is a multifunctional protein involved in cell-cell adhesion and Wnt signal transduction. ß-Catenin signaling has been proposed to act as inducer of cell proliferation in different tumors. However, in some developmental contexts and cell systems ß-catenin also acts as a positive modulator of apoptosis. To get additional insights into the role of ß-Catenin in the regulation of the cell cycle and apoptosis, we have analyzed the levels and subcellular localization of endogenous ß-catenin and its relation with adenomatous polyposis coli (APC) during the cell cycle in S-phase¿synchronized epithelial cells. ß-Catenin levels increase in S phase, reaching maximum accumulation at late G2/M and then abruptly decreasing as the cells enter into a new G1 phase. In parallel, an increased cytoplasmic and nuclear localization of ß-catenin and APC is observed during S and G2 phases. In addition, strong colocalization of APC with centrosomes, but not ß-catenin, is detected in M phase. Interestingly, overexpression of a stable form of ß-catenin, or inhibition of endogenous ß-catenin degradation, in epidermal keratinocyte cells induces a G2 cell cycle arrest and leads to apoptosis. These results support a role for ß-catenin in the control of cell cycle and apoptosis at G2/M in normal and transformed epidermal keratinocytes.

Muscle protein waste in tumor-bearing rats is effectively antagonized by a beta 2-adrenergic agonist (clenbuterol). Role of the ATP-ubiquitin-dependent proteolytic pathway.

Tissue protein hypercatabolism (TPH) is a most important feature in cancer cachexia, particularly with regard to the skeletal muscle. The rat ascites hepatoma Yoshida AH-130 is a very suitable model system for studying the mechanisms involved in the processes that lead to tissue depletion, since it induces in the host a rapid and progressive muscle waste mainly due to TPH (Tessitore, L., G. Bonelli, and F. M. Baccino. 1987. Biochem. J. 241:153-159). Detectable plasma levels of tumor necrosis factor-alpha associated with marked perturbations in the hormonal homeostasis have been shown to concur in forcing metabolism into a catabolic setting (Tessitore, L., P. Costelli, and F. M. Baccino. 1993. Br. J. Cancer. 67:15-23). The present study was directed to investigate if beta 2-adrenergic agonists, which are known to favor skeletal muscle hypertrophy, could effectively antagonize the enhanced muscle protein breakdown in this cancer cachexia model. One such agent, i.e., clenbuterol, indeed largely prevented skeletal muscle waste in AH-130-bearing rats by restoring protein degradative rates close to control values. This normalization of protein breakdown rates was achieved through a decrease of the hyperactivation of the ATP-ubiquitin-dependent proteolytic pathway, as previously demonstrated in our laboratory (Llovera, M., C. García-Martínez, N. Agell, M. Marzábal, F. J. López-Soriano, and J. M. Argilés. 1994. FEBS (Fed. Eur. Biochem. Soc.) Lett. 338:311-318). By contrast, the drug did not exert any measurable effect on various parenchymal organs, nor did it modify the plasma level of corticosterone and insulin, which were increased and decreased, respectively, in the tumor hosts. The present data give new insights into the mechanisms by which clenbuterol exerts its preventive effect on muscle protein waste and seem to warrant the implementation of experimental protocols involving the use of clenbuterol or alike drugs in the treatment of pathological states involving TPH, particularly in skeletal muscle and heart, such as in the present model of cancer cachexia.