Integrating the theme approach with aspectual scenarios

Dissertação de Mestrado em Engenharia Informática

Tolerância à vancomicina em Enterococcus faecalis: papel de proteínas hipotéticas

Dissertação apresentada para a obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

Diversidade genética do vírus da Hepatite C circulante numa população de utilizadores de drogas injectáveis de Lisboa

Dissertação apresentada para a obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

Modelo de sistemas de informação técnica baseado numa plataforma SIG

Dissertação apresentada como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciência e Sistemas de Informação Geográfica

Refinamento de diagramas de classes: análise e verificação

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Informática

Parâmetros associados a sibilância recorrente após bronquite aguda

RESUMO Introdução: a bronquiolite aguda afecta 30 a 60% das crianças saudáveis até ao terceiro aniversário. Destas, 50% evoluem para sibilância recorrente, com consequências pessoais, familiares e sociais relevantes. Objectivos: identificação de parâmetros clínicos e laboratoriais associados à sibilância recorrente em crianças saudáveis. A detecção da actividade local de quatro citocinas intervenientes nas vias imunológicas Th1 ou Th2 permitiu, gualmente, o estudo do respectivo comportamento em função dos referidos parâmetros. Material e Métodos: estudo prospectivo de coorte, efectuado no serviço de urgência pediátrica do HSFX no Inverno 2004/2005. Recrutada amostra de conveniência de 188 lactentes de idade inferior a 24 meses e diagnóstico de bronquiolite aguda. Excluídos portadores de doença crónica, ex-prematuros e os doentes sujeitos a corticoterapia nas duas semanas anteriores. A todos foi feito questionário padronizado, exame clínico e estratificação da gravidade através de índice validado. Na mucosa nasal, foram pesquisados Ag víricos e estudada a expressão génica de quatro citocinas - representativas da via Th1 (IFN-g e IL-12) ou Th2 (IL-4 e IL-13). Esta determinação foi efectuada por RT-PCR, no Laboratório de Biologia Molecular do Centro de Histocompatibilidade do Sul. Durante o seguimento, em consulta de pneumologia pediátrica até à idade de 36 meses, foram excluídos os seguintes casos: patologia anatómica ou funcional que justificasse sibilância recorrente, valores totais de IgE elevados, Phadiatop® positivo ou défice de IgG, IgA ou IgM. Os resultados foram estudados por estatística descritiva, análise univariada e multivariada. Foi considerado com significado estatístico, em todas as análises, o valor de p < 0,05. Resultados: das 188 crianças recrutadas, foram excluídas 36 (principalmente por identificação de outras causas de sibilância recorrente). Da amostra final de 152 doentes, 76 (50%) foram considerados sibilantes e 76 não sibilantes. Os seguintes parâmetros à entrada relacioram-se com a evolução para sibilância recorrente: idade inferior a 6 meses (OR: 3,8; IC95% 1,8-9,1); exposição ao fumo de tabaco na vida intrauterina (OR: 2,5; IC95% 1,2-5,2) ou após o nascimento (OR: 2,4; IC95% 1,0-5,8); atopia materna (OR: 4,0; IC95% 1,5-10,3); maior gravidade (OR: 1,2; IC95% 1,1-1,4); apirexia (OR: 4,7; IC95% 1,8-11,8); identificação de vírus (OR: 3,5; IC95% 1,4-8,7); predomínio imunitário de tipo Th2 em lactentes com idade superior a seis meses (OR:1,3; IC95% 1,0-1,7). Verificou-se predomínio Th1 na mucosa nasal das crianças com irmãos ou que frequentavam o infantário (OR: 3,1; IC95% 1,4-6,5); nas amamentadas (OR: 1,2; IC95% 1,1-1,4) e naquelas em que se identificaram Ag víricos (OR: 4,0; IC95% 1,3-11,9). O contacto com fumo de tabaco no domicílio foi o determinante mais importante de predomínio Th2 (OR: 2,3; IC95% 1,1-4,7). Discussão e Conclusões: Foram considerados factores de risco para sibilância recorrente em lactentes saudáveis: idade inferior no momento do primeiro episódio de bronquiolite; exposição passiva (antenatal ou pós-natal) ao fumo de tabaco;antecedentes maternos de atopia; primeiro episódio com maior gravidade, sem febre e com dentificação de Ag víricos nas secreções nasais. Os resultados do presente estudo reforçam as recomendações usuais de aleitamento materno, limitação de contactos sociais em lactentes e evicção tabágica durante a gravidez e após o nascimento.

Fisioterapia : influência na qualidade de vida da mulher com cancro da mama : contributo para a qualidade do serviço em oncologia

RESUMO - O cancro da mama é uma preocupação da saúde pública a nível mundial, pela sua incidência, mortalidade e custos económicos associados. As terapias utilizadas no seu tratamento, embora eficazes, conduzem a alterações de todas as dimensões da Qualidade de Vida (QdV) da mulher com cancro da mama. A garantia de uma qualidade de serviço prestado deve ser uma prioridade das organizações de saúde, sendo a QdV uma medida de resultado. Partindo do pressuposto que em Portugal existe uma diferença potencial na forma como as mulheres com cancro da mama recebem o apoio por parte da fisioterapia, importa saber se a fisioterapia tem ou não influência na QdV da mulher com cancro da mama, o que, no caso de ser afirmativo, poderá constituir uma mais-valia para a qualidade do serviço prestado em oncologia. O Objectivo deste trabalho é construir um modelo de análise no sentido de responder à questão inicial de investigação: “Será que a fisioterapia contribui para a melhoria da Qualidade de Vida das mulheres com cancro da mama submetidas a cirurgia e outras terapias oncológicas?”. Neste sentido o trabalho de projecto dividiu-se por etapas. Inicialmente foi realizado um enquadramento teórico, através de uma revisão de literatura e da realização de entrevistas exploratórias, permitindo desta forma ter um conhecimento actual das temáticas que definem as variáveis e o objecto de estudo. Na etapa seguinte, foi feita uma análise crítica sobre o conhecimento actual do tema em estudo, que permitiu definir as variáveis a estudar, escolher o instrumento de medida a utilizar, ter conhecimento dos procedimentos a seguir. Após a definição do objectivo geral (avaliar se a fisioterapia tem influência na QdV das mulheres submetidas a cirurgia e outras terapias oncológicas) e dos objectivos específicos, iniciou-se o delineamento da metodologia tida como adequada para responder às questões de investigação levantadas (tipo de estudo, as variáveis, a unidade de análise, os métodos e técnicas de recolha de dados, os procedimentos e a metodologia de tratamento de dados). No âmbito do trabalho de projecto está definida a colocação em campo de um caso de estudo efectivo que permita dar um contributo real no delineamento da metodologia. Neste trabalho optou-se pela realização de um estudo piloto, que se enquadra nos procedimentos da metodologia e que teve por objectivo retirar algumas conclusões sobre: a aplicabilidade do instrumento de medida; os tempos definidos para a recolha de dados; as características sociodemográficas e clínicas da amostra; as questões de investigação levantadas. O estudo piloto consistiu num estudo pré-experimental, com uma amostra de 35 indivíduos, submetidos a cirurgia a cancro da mama e a outras terapias oncológicas. Foram avaliadas as dimensões do bem-estar físico e actividades quotidianas, bem-estar psicológico, relações sociais, sintomas e características sociodemográficas/clínicas, no início do tratamento individual de fisioterapia e no momento de alta. Utilizou-se como instrumento de medida o questionário EORTC QLQ–30 e o seu questionário complementar EORTC QLQ–23. Tendo sido construída uma ficha para recolha de dados sociodemográficos e clínicos. A significância estatística foi aceite para valores de p<0,05. Para comparação entre grupos e evolução dentro de cada grupo aplicou-se o teste t-student e o teste de Mann-Whitney. A análise dos resultados do estudo piloto permitiu verificar que: - O instrumento de medida proposto (questionário EORTC QLQ30 e BR23) mostrou ser de fácil aplicação, não tendo existido dificuldade por parte das doentes no seu preenchimento. Não houve problemas no cálculo dos scores e na sua interpretação; - Parte considerável das mulheres com cancro da mama será submetida a protocolos que se poderão prolongar por vários meses após a cirurgia (ex: QT+RT+HT). Esta realidade leva-nos a propor que sejam realizados vários momentos de avaliação, para que possam ser avaliadas as dimensões da QdV ao longo dos diferentes protocolos de tratamentos. Pensamos que o ideal seria a realização de 4 momentos de avaliação (3 a 4 semanas após a cirurgia, 3 meses, 6 meses e 9 meses após cirurgia). Sugerimos também que o estudo proposto seja realizado com uma amostra de maior dimensão; - O estudo piloto como recorreu a uma metodologia pré-experimental (ausência de grupo de controlo e apenas dois momentos de avaliação), não permite a consistência dos resultados; no entanto os resultados obtidos podem constituir um indicador de que a fisioterapia tem influência nas diferentes dimensões da QdV da mulher com cancro da mama submetida a cirurgia e a outras terapias oncológicas, podendo constituir uma mais-valia para a qualidade do serviço prestado em oncologia. Os resultados do estudo piloto permitiram redefinir a metodologia tida como adequada para responder à questão de investigação inicial. Apresentamos de seguida a mesma: Estudo quase-experimental, sendo a amostra constituída por dois grupos de 60 mulheres cada, submetidas a cirurgia a cancro da mama e a outras terapias oncológicas. O grupo experimental será submetido a tratamentos individuais de fisioterapia. Serão avaliadas as dimensões do bem-estar físico e actividades quotidianas, bem-estar psicológico, relações sociais e sintomas. A recolha de dados será realizada 3 semanas, 3 meses, 6 meses e 9 meses após a cirurgia. Como instrumento de medida será utilizado o questionário EORTC QLQ–30 e o seu questionário complementar EORTC QLQ–23, serão também recolhidos dados sociodemográficos e clínicos. A significância estatística será aceite para valores de p<0,05. Para comparação entre grupos e evolução dentro de cada grupo serão utilizados testes paramétricos e não paramétricos. A realização de um estudo que seguisse a metodologia acima referida permitiria uma maior consistência dos resultados, podendo eventualmente existir a confirmação de que a fisioterapia pode ter influência na QdV da mulher submetida a cirurgia a cancro da mama e a outras terapias oncológicas. A evidência de que a fisioterapia tem influência na QdV da mulher com cancro da mama, e o facto de a QdV ser um indicador da qualidade do serviço prestado em oncologia, poderão constituir um agente facilitador para a mudança na gestão de recursos humanos em organizações de saúde com a valência de oncologia, levando a uma alteração dos padrões de prática na área da fisioterapia em oncologia em Portugal, que poderá conduzir a uma melhor qualidade de serviço prestado ao doente oncológico. ----- ABSTRACT - Breast Cancer is a worldwide public health concern due to the incidence, mortality and economic costs associated. Although effective, therapies used in its treatment lead to changes in all Quality of Life (QoL) dimensions of a woman suffering from Breast Cancer. QoL is an outcome measure, and the insurance of quality of care provided should be a priority to health organizations. Taking into consideration that in Portugal there is a potential difference in the way women with Breast Cancer are provided with physical therapy, it is important to know whether physical therapy does or does not influence the QoL of women with breast cancer. If it does, it will lead to a health care quality improvement to cancer patients. The goal of the following study is to build an analysis model in order to answer the initial investigation question: “Does Physical Therapy contribute to enhance the Quality of Life of women with breast cancer who underwent surgery and other oncology treatments?” The project was divided in different stages. Initially, a literature revision was elaborated and exploratory interviews were held, which allowed an actual knowledge of the themes that define the variables and the object of study. The next stage included a critical analysis of the theme, which allowed the definition of variables of study, the choice of instrument of measure and the acquisition of some knowledge on how to proceed. After the definition of the general goal (to evaluate the influence of physical therapy on the QoL of women with breast cancer who underwent surgery and other oncology treatments) and specific goals, the choice of a right methodology took place, in order to answer the investigation questions (type of study, variables, unit analysis, methods and techniques on data collection, procedures and data treatment). In the scope of the project, it is decided to put out on the field an effective case-study which assures a real contribution on the choice of te methodology. In this particular work, there was a pilot study, included in the methodology procedures, with the goal of obtaining conclusions on the applicability of the instrument of measure; the length of time to collect data, the socio-demographic and clinical characteristics of the sample; the investigation questions. The pilot study consisted on a one group pretest-postest design, with a sample of 35 individuals who underwent surgery and other oncology treatments. Dimensions such as physical well-being and everyday life activities, psychological well-being, social relationships, symptoms and socio-demographical/clinical characteristics were assessed at the beginning of physical therapy individual treatment and at the moment of release. The instrument of measure used was the EORTC QLQ–30 questionnaire and its complementary questionnaire EORTC QLQ–23. A chart was made in order to collect socio-demographic and clinical data. Statistic significance was accepted for values of p<0,05. To compare between groups and to detect the evolution within each group, the t-student test and the Mann-Whitney test were applied. The outcome analysis of the pilot study allowed to verify that: - The instrument of measure proposed (EORTC QLQ30 and BR23) was easy to apply, and the subjects did not show any difficulty in filling it up. There was also no problem on calculating the scores or interpreting them; - A considerable part of the women with breast cancer will be submitted to protocols that may occur throughout several months after surgery (e.g., QT+RT+HT). This reality leads us to suggest several moments of assessment of the QoL dimensions in various moments of the different protocol treatments. We consider that the ideal number of evaluations would be 4 (3/4 weeks, 3 months, 6 months and 9 months after surgery). We also suggest the use of a larger sample; - Since the pilot study resorted to a one group pretest-postest design (there is an absence of control group and only two moments of assessment), there is no consistency of outcome. However, the results obtained indicate that physical therapy influences the dimensions of QoL on women with breast cancer who underwent surgery and other oncology treatments, which may be an asset to the quality of care provided to cancer patients. The outcome of the pilot study allowed to redefine the methodology given as adequate to answer the initial investigation question. Our suggestion is as follows: quasi-experimental design, with a sample of 120 subjects (2 groups of 60 women) with breast cancer who underwent surgery and other oncology treatments. The experimental group will be submitted to individual treatments of physical therapy. Dimensions such as physical well-being and everyday life activities, psychological well-being, social relationships and symptoms will be assessed. The collection of data will occur at 3 weeks, 3 months, 6 months and 9 months after surgery. The instrument of measure is the EORTC QLQ–30 questionnaire and its complementary questionnaire EORTC QLQ–23, and social-demographic and clinical information will also be collected. The statistic significance will be accepted for values of p<0,05. Parametric and non-parametric tests will be used to compare between groups and to detect the evolution within each group. Carrying out a study that followed the methodology discussed above would allow a better consistency of results, possibly enabling the confirmation that physical therapy influences the QoL of women with breast cancer who underwent surgery and other oncology treatments. The evidence that physical therapy influences the QoL of women with breast cancer, and the fact that QoL is an indicator of quality of care provided to cancer patients, may work as a facilitating agent in the change of human resources management in health organizations associated to oncology, which will lead to a change in oncology physical therapy practice patterns in Portugal, guiding to a health care quality improvement to cancer patients.

Flaviviruses in mosquitoes from Southern Portugal, 2009-2010

Os flavivírus são vírus pertencentes à família Flaviviridae, género Flavivirus. Estes formam um grande grupo caraterizado pela sua ampla distribuição e diversidade genética. Os flavivírus são, na sua maioria, transmitidos por artrópodes vectores incluíndo agentes patogénicos para humanos e animais que podem potencialmente provocar grandes epidemias e causar elevadas taxas de mortalidade e morbidade. Nos últimos anos, tem-se registado uma grande expansão a nível da distribuição geográfica dos flavivirus e diversidade dos seus hospedeiros. O vírus do Nilo Ocidental tem sido continuamente detectado em toda a Europa recentemente, e também isolado de mosquitos colhidos no Sul de Portugal, onde já foram registados casos humanos e animais. O principal objectivo deste trabalho é o rastreio de flavivírus em mosquitos colhidos em duas regiões do Sul de Portugal, onde os mesmos foram anteriormente detectados. As colheitas de mosquitos foram realizadas em 24 locais em zonas húmidas nos districtos de Faro e Setúbal, através de armadilhas luminosas tipo CDC com CO2 e aspiradores mecânicos manuais para colheita de mosquitos em repouso em abrigos de animais. Os mosquitos colhidos foram agrupados por lotes contendo aproximadamente 50 espécimens cada, e rastreados para a presença de flavivírus por heminested RT-PCR, direccionado à amplificação de um pequeno fragmento do gene NS5 usando oligonucleótidos degenerados específicos para flavivírus. Entre Abril e Outubro de 2009 e 2010 foram colhidos no total 36273 mosquitos pertencentes às seguintes espécies: Anopheles algeriensis, An.atroparvus, Aedes berlandi, Ae.caspius, Ae.detritus, Coquillettidia richiardii, Culex laticinctus, Cx.pipiens, Cx.theileri, Cx.univittatus, Culiseta annulata, Cs.longiareolata, Cs.subochrea, e Uranotaenia unguiculata. As espécies mais abundantes foram Ae.caspius, Cx.theileri e Cx.pipiens, respectivamente. Contudo, as densidades de mosquitos foram variáveis de acordo com o método de colheita e área de amostragem. As densidades de mosquitos colhidos em 2010 foram quatro vezes superior às registadas no ano anterior. No total foram analisados 745 lotes dos quais 31% testaram positivos para a presença de sequências de flavivirus. As espécies que apresentaram taxas de positividade mais elevadas foram: An.algeriensis com uma Taxa Mínima de Infecção (TMI) de 56/1000 no Algarve em 2009, Cs.annulata TMI =22/1000 no Algarve em 2010, Cx.theileri e Cx.pipiens em Setúbal em 2010, TMI =20/1000. An. atroparvus, Ae. caspius, Ae. detritus e Cx. univittatus também produziram lotes positives. No geral, a positividade foi maior no Algarve. Análise das sequências virais obtidas revelou homologia das nossas sequências virais com sequências de referência de flavivírus específicos de mosquitos depositadas em bases de dados de acesso livre. A análise filogenética reflectiu a variabilidade genética dos flavivírus e revelou a relação genética das nossas sequências com as de outros flavivírus, especialmente os específicos de insectos. Tendo em consideração os anteriores isolamentos do vírus do Nilo Ocidental, o aumento acentuado nas densidades de mosquitos, o aumento de temperaturas que se tem vindo a registar, os casos recentes de transmissão de flavivírus por toda a Europa e o padrão desconhecido e imprevisível dos surtos destes vírus, os programas contínuos de vigilância epidemiológica têm-se revelado uma ferramenta indispensável para a Saúde Pública.

Epidemiological characterization, antimicrobial resistance and virulence mechanisms of human and animal streptococci

Dissertação para obtenção do Grau de Doutor em Biologia

Sífilis congénita : caracterização da infecção e avaliação de técnicas laboratoriais para o seu diagnóstico

RESUMO: Um dos maiores problemas da sífilis é a infecção intra-uterina do feto, que pode resultar em morte fetal com aborto espontâneo. Os objectivos desta tese foram comparar os cinco testes serológicos para o diagnóstico de sífilis congénita e optimizar e aplicar a várias amostras clínicas, colhidas de indivíduos com suspeita de infecção por Treponema pallidum, uma técnica de PCR-Multiplex e uma técnica de PCR em tempo real. Na globalidade dos soros estudados obtiveram-se os seguintes resultados: o RPR reactivo em 87/517; TPHA reactivo em 135/517; e EIA reactivo em 127/517. A pesquisa de anticorpos específicos de tipo IgM foi efectuada em 33 soros sendo estudada pelas técnicas de imunofluorescência indirecta e de westernblot. Quanto aos resultados obtidos pelas duas técnicas, o teste FTA-Abs-IgM demonstrou reactividade em 3/33, enquanto que a técnica de westernblot-M, apresentou reactividade em 18/33. Para a avaliação de uma técnica de PCR-TR, foram estudadas 318 amostras de 236 indivíduos classificados, com base em critérios clínicos e laboratoriais, em diferentes estádios de infecção por Treponema pallidum e em indivíduos sem infecção por aquele microrganismo. Relativamente a estas técnicas foi possível observar amplificação de ADN de Treponema pallidum em 133/318 pela técnica de PCR-TR e 90/318 pela técnica de PCR-Multiplex. Mediante os resultados obtidos e de outros estudos efectuados parece poder concluir-se que o teste EIA é o mais indicado para o rastreio da infecção por Treponema pallidum, devendo um resultado reactivo por esta técnica, ser confirmado com a realização de um teste não treponémico (RPR). Relativamente ao diagnóstico de infecção congénita, o teste westernblot para pesquisa de anticorpos específicos de tipo IgM, parece ser o mais apropriado. A técnica PCR-TR, parece ser a mais indicada, pois apresenta uma maior sensibilidade e especificidade que a PCR-Multiplex.----------------- ABSTRACT:The syphilis major problem is the intrauterine infection of the fetus, which may result in fetal death with spontaneous abortion. The objectives of this thesis were to compare the five serological tests for the diagnosis of congenital syphilis and optimize and apply several clinical samples taken from individuals suspected of infection with Treponema pallidum, a PCR-Multiplex and real-time PCR. In all sera studied were obtained the following results: the RPR reactive in 87/517; reactive TPHA in 135/517, and 127/517 in reactive EIA. The search for specific IgM antibodies was performed on 33 sera that were studied by indirect immunofluorescence and westernblot. The results obtained by both techniques, the test FTA-Abs-IgM showed reactivity in 3/33, while the technique westernblot-M, showed reactivity in 18/33. For an RT-PCR evaluation, we studied 318 samples from 236 individuals classified based on clinical and laboratory criteria at different stages of infection by Treponema pallidum and in individuals without infection by that organism. For these techniques it was possible to observe ADN amplification of Treponema pallidum in 133/318 by RT-PCR and 90/318 by PCR-Multiplex. Based on obtained results and in other studies seems that we can conclude that the EIA test is the most suitable for Treponema pallidum screening infection, and a reactive result by this technique, should be confirmed with the realization of a non-treponemal test (RPR). For the congenital infection diagnosis, testing for antibodies westernblot specific IgM appears to be the most appropriate. The RT-PCR seems to be the most suitable, since it has a higher sensitivity and specificity than the PCR-Multiplex.

The role of microRNAs in amyotrophic lateral sclerosis

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

Diversidade genética e resistência natural ao Maraviroc em estirpes do vírus da imunodeficiência humana Tipo 1 (HIV-1) em circulação em utilizadores de drogas por via endovenosa na Grande Lisboa

RESUMO: O maraviroc (MVC) é o único anti-retroviral antagonista do co-receptor CCR5 licenciado e interage com as ansas transmembranares de CCR5, induzindo uma alteração da sua conformação e impedindo a interacção com gp120. O MVC é activo apenas contra estirpes R5 de HIV-1, sendo utilizado em terapia de recurso. Neste trabalho, foi estudada a diversidade genética da região C2V3C3 do gene env de estirpes de HIV-1 de oxicodependentes por via endovenosa da Grande Lisboa, pesquisando-se também a presença de polimorfismos genéticos naturais. Foram utilizadas 52 amostras de plasma e para 35 destas foi amplificado por RT-nested PCR um produto de 565 pb. A análise filogenética revelou a seguinte distribuição de genótipos: 23 B (incluindo, provavelmente, 2 CRF14_BG), 8 A, 3 G e 1 F1. Após tradução, e por comparação com a sequência consenso B, verificou-se uma elevada frequência de polimorfismos genéticos, sendo encontradas algumas “assinaturas de aminoácidos” relativas aos subtipos não-B. Realizou-se ainda uma pesquisa de locais de N-glicosilação e a previsão da utilização de co-receptores (abordagem genotípica), com recurso às regras 11/25 e da carga líquida da ansa V3 e aos programas PSSM e geno2pheno[coreceptor]. Observou-se uma conservação genérica do número de locais de N-glicosilação e foram identificadas 5 sequências com tropismo X4 ou duplo. Por fim, com base na literatura, realizou-se uma pesquisa de polimorfismos genéticos associados a resistência ao MVC presentes na ansa V3. Foi observado um número elevado destas mutações. A presença dos padrões 11S+26V e 20F+25D+26V, num total de 3 sequências, é relevante, visto estes estarem inequivocamente associados à resistência in vivo ao MVC. Apesar de não estar ainda definido um perfil de resistência para o MVC, a presença das mutações encontradas, em indivíduos sem contacto prévio com o fármaco, trará implicações relevantes na sua gestão clínica, considerando a introdução do MVC na terapia de recurso.---------- ABSTRACT: Maraviroc (MVC) is the only CCR5 inhibitor licensed today. This drug interacts with the transmembrane helices of CCR5 co-receptor, inducing a conformation change of its extracellular loops and preventing the interaction with gp120. MVC is only active against R5 strains of HIV-1 and is currently used in salvage therapy. The genetic diversity of the env C2V3C3 region of HIV-1 strains from injecting drug users in the Greater Lisbon was studied, along with the presence of natural genetic polymorphisms. 52 plasma samples were used and the amplification by RT-nested PCR of a 565 bp-product was possible in 35 of them. The phylogenetic analysis revealed 23 sequences classified as subtype B (probably including 2 CRF14_BG), 8 A, 3 G and 1 F1. After translation, the presence of natural genetic polymorphisms was studied by comparison to a subtype B consensus. A high frequency of genetic polymorphisms was observed and significant “amino acid signatures” were found in association with non-B subtypes. A full characterization of the N-glycosylation sites was also performed and a coreceptor prediction (genotypic approach) was accomplished using the 11/25 and the V3 net charge rules and the programs PSSM and geno2pheno[coreceptor]. The number of N-glycosylation sites was generically preserved. Five sequences were defined as X4 or dual-tropic. Based on published data, a search for genetic polymorphisms, present in V3loop, associated to MVC resistance was finally undertaken. Several of such mutations were observed, being particularly interesting the presence of the patterns 11S+26V and 20F+25D+26V, in a total of 3 sequences, since these patterns have unequivocally been associated with MVC resistance in vivo. Although a resistance profile for MVC is not yet defined, the presence of these mutations in MVC-naïve populations may have significant impact in their clinical management in the future, especially considering the introduction of this drug in salvage therapy.

Expressão em Escherichia coli de antigénios do Cell fusing agent virus (Flaviviridae: Flavivirus) como proteína de fusão

RESUMO: O Cell Fusing Agent Vírus (CFAV), considerado como o primeiro “flavivírus específicos de insectos” (ISF), parece estar exclusivamente adaptado aos seus hospedeiros, não replicando em células de vertebrados. Apesar de ter sido identificado há mais de três décadas (1975), a verdade é que muito pouco se conhece sobre a sua biologia. Dado o seu parentesco filogenético com alguns outros flavivírus encontrados naturalmente em mosquitos de diferentes géneros colhidos em diferentes regiões do globo, este vírus poderá ser usado como modelo para o estudo de ISF. No entanto, necessitam do desenvolvimento de ferramentas básicas, tais como clones moleculares ou baterias de soros contendo anticorpos que reconheçam uma ou mais proteínas codificadas pelo genoma viral, produzidas, por exemplo, a partir de antigénios virais produzidos de forma recombinante. Com este trabalho pretendeu-se a optimização de protocolos que permitiram a expressão e purificação parcial de quatro proteínas [duas proteínas estruturais (C e E) e duas não estruturais (NS3hel e NS5B)] do CFAV em E. coli, todas elas produzidas como proteínas de fusão com “caudas” (tags) de hexahistidina nos seus extremos carboxilo. Para a expansão do CFAV foram utilizadas células Aedes albopictus (C6/36). Após a realização da extracção do RNA viral e a obtenção de cDNA, procedeu-se amplificação, por RT-PCR, das regiões codificantes das proteínas C, E, NS3hel e NS5B, utilizando primers específicos. Os quatro fragmentos de DNA foram independentemente inseridos no vector pJTE1.2/blunt usando E. coli NovaBlue como hospedeira de clonagem e, posteriormente, inseridos em vectores de expressão pET-28b e pET-29b usando E. coli BL21(DE3)pLysS e Rosetta(DE3)pLysS como hospedeiras de expressão. Após da indução, expressão e purificação das proteínas recombinantes C, E, NS3hel e NS5B, foi confirmada a autenticidade destas proteínas produzidas através do método Western Blot com um anticorpo anti-histidina. --------- ABSTRACT: The Cell Fusing Agent virus (CFAV) considered as the first "insect- specific flavivirus" (ISF) and seems to be uniquely adapted to their hosts, not replicating in vertebrate cells. Although it has been known for more than three decades (1975), the truth is very little is known about its biology. Given its close phylogenetic relationship with other flavivirus naturally circulating in various genera of mosquitoes collected from different regions of the globe, this virus could be used as a model for the study of ISF. However, such studies require the development of experimental basic tools, such as molecular clones or serum batteries containing antibodies that recognize one or more proteins encoded by the viral genome, produced, for example, from viral antigens recombinant produced. In this work, we carried out the optimization of protocols that allowed the expression and partial purification of four proteins [two structural proteins (C and E) and two nonstructural proteins (NS3hel and NS5B)] CFAV in E. coli as fusion protein for c-terminal hexahistidine tags. For the expansion of the CFAV we used Aedes albopictus (C6/36) cells. After completion of the viral RNA extraction and cDNA obtained, amplification of the coding regions of the C, E, NS5B and NS3hel proteins was carried out by RT-PCR using specific primers. The four DNA fragments were independently inserted into the vector pJTE1.2/blunt using E. coli NovaBlue as cloning host and then inserted into expression vectors pET-28b and pET-29b using E. coli BL21(DE3)pLysS and Rosetta(DE3)pLysS as expression host. After induction, expression and purification of recombinant C, E, NS3hel and NS5B proteins Western Blot analyses with an anti-histidine antibody confirmed the authenticity of these proteins produced.

Novel transcription factors regulating the expression of the rice gene OsDREB1B

Dissertation presented to obtain the Ph.D degree in Biology

Analysis of the intranuclear life of nonsense transcripts

Dissertação para obtenção do Grau de Doutor em Biologia, Especialidade de Biologia Molecular