Efeito da aplicação de águas residuais na produtividade e na qualidade de três genótipos de Miscanthus

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Energia e Bioenergia

Evolução de genótipos de Streptococcus agalactiae associados a colonização na grávida

Dissertação para obtenção do grau de Mestre em Microbiologia Médica

Chlamydia trachomatis: genótipos circulantes, comparação de métodos para o seu diagnóstico e necessidade do seu rastreio

As infecções urogenitais originadas por Chlamydia trachomatis têm aumentado nos últimos anos em todo o mundo, afectando essencialmente jovens adultos com vida sexual activa. O seu rastreio recomenda-se nas mulheres entre os 19-25 anos de idade em alguns países Europeus, desde que seja de custo eficácia, para prevenção das suas complicações (doença inflamatória pélvica e infertilidade). Os testes de amplificação de ácidos nucleicos (NAATs) são cada vez mais utilizados no seu diagnóstico pela sua elevada sensibilidade e especificidade. Este estudo teve como objectivo conhecer a prevalência de infecção urogenital por C. trachomatis em populações de risco, através das técnicas de Multiplex PCR e de PCR em Tempo Real e identificar os genótipos de C. trachomatis. Pretendeu-se também conhecer a prevalência de anticorpos anti-C. trachomatis e verificar a necessidade de execução do rastreio da infecção urogenital por C. trachomatis. C. trachomatis foi identificada em amostras de indivíduos da consulta de venereologia do Hospital de Santa Maria e da consulta da Unidade de DST do Instituto de Higiene e Medicina Tropical, com uma prevalência de 25% (10/40) e 6,8% (5/74), respectivamente, tendo sido identificados quatro genótipos diferentes, D, Da, E e F. A técnica de PCR em Tempo Real apresentou melhores resultados na identificação de C. trachomatis do que a de Multiplex PCR. A prevalência de anticorpos anti-C. trachomatis da classe IgG com um título de 1:320 foi de 59,4% (57/96) e com um título de 1:1.000 foi de 39,6% (38/96). A prevalência de anticorpos da classe IgM, geralmente associada a infecção aguda, foi 35,9% (14/39) dos indivíduos. No presente estudo verificou-se que, embora a pesquisa de anticorpos não pareça ser eficiente no diagnóstico de C. trachomatis, pode eventualmente ser útil como marcador epidemiológico de infecção. O elevado número de anticorpos presente nos indivíduos do nosso estudo parece indicar a necessidade do rastreio da infecção urogenital por C. trachomatis neste tipo de populações.

Epidemiologia da infeção por rotavírus em Huambo, Angola: prevalência da infeção e dos genótipos circulantes

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Microbiologia Médica

Fitorremediação de águas residuais contaminadas com Cd e Ni por três genótipos de Miscanthus

Fitorremediação, o uso de vegetação para a descontaminação de diferentes matrizes, é uma estratégia de baixo custo e tem sido apontada como uma metodologia passível de atenuar e estabilizar águas residuais. Neste contexto, este estudo tem como principal objectivo avaliar a capacidade fitorremediadora de três genótipos de Miscanthus (duas espécies - Miscanthus sinensis e Miscanthus floridulus, e um híbrido – Miscanthus x giganteus) a águas residuais contaminadas com cádmio e níquel (2,0 mg Ni/L e 0,2 mg Cd/L). Os resultados demonstraram que a irrigação com águas residuais contaminadas com Cd e Ni não afecta a produtividade dos três genótipos de Miscanthus em estudo e que o M. x giganteus e o M. floridulus registaram produtividades mais elevadas que o M. sinensis. Contudo, o M. x giganteus, demonstrou tendencialmente uma redução da sua produção com a contaminação de Cd. A biomassa obtida dos ensaios irrigados com águas residuais contaminadas apresentaram maior teor de Cd e Ni, do que a biomassa recolhida dos ensaios Controlo. O sistema Miscanthus-solo registou valores de remoção de Cd de 100%, e de Ni de 96-100%, no caso do M. x giganteus e do M. sinensis. O M. floridulus, contudo, demonstrou menos potencial de fitorremediação no que diz respeito à remoção de Ni das águas residuais: apenas 58% de Ni foi removido pelo sistema “biofiltrador”. Ainda assim, verificou-se a acumulação de Cd e Ni no perfil superior do solo devido à irrigação com as águas residuais contaminadas, o que demonstra a necessidade de controlo desta técnica de modo a prevenir possíveis efeitos negativos no ambiente.

Caracterização da resistência à antracnose dos frutos verdes do cafeeiro

Dissertação apresentada para obtenção do Grau de Doutor em Biologia, especialidade Biologia Vegetal,pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

Diversidade genética do vírus da Hepatite C circulante numa população de utilizadores de drogas injectáveis de Lisboa

Dissertação apresentada para a obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

Epidemiologia da malária em Cabo Verde - Factores genéticos humanos e estrutura populacional do mosquito vector

A malária, doença parasitária complexa que resulta da interacção entre parasita, hospedeiros humano e vector, constitui um dos principais problemas de saúde a nível mundial. À semelhança de outras doenças parasitárias e infecciosas a malária tem um papel importante na evolução, tendo já sido demonstrado o papel da variação genética humana na resistência à infecção. Após quase meio século de controlo, a malária persiste na ilha de Santiago onde, apesar da baixa endemicidade, os indivíduos apresentam geralmente manifestações moderadas, são diagnosticadas infecções abaixo do nível detectável pela microscopia e o vector se encontra muito próximo da população supostamente susceptível, desconhecendo-se a frequência dos principais polimorfismos genéticos humanos mais relacionados com a doença e a estrutura populacional do mosquito vector. Os objectivos gerais de trabalho desta tese assentam 1) no estudo dos dois clássicos factores genéticos do hospedeiro humano relacionados com a malária, nomeadamente os afectos à anemia das células falciformes, à deficiência em G6PD e a análise dum provável envolvimento da PK e 2) na análise genética das populações do mosquito vector, tentando contribuir para a compreensão da epidemiologia da doença na Ilha, e para a escolha de medidas de controlo apropriadas. Os trabalhos incidiram na detecção do alelo responsável pela hemoglobina S, de polimorfismos no gene da G6PD e da PK em indivíduos não aparentados (Infectados e não Infectados) com análise da sua provável associação com a infecção e, ainda, na genotipagem de loci microssatélites de Anopheles arabiensis com recurso a técnicas baseadas na PCR. Relativamente à anemia falciforme, a frequência dos portadores do traço (indivíduos HbAS) e do alelo HbS foi 6% e 5%, respectivamente, e para as variantes da G6PD, 0,8% para G6PDA- e 0,0% para a G6PDMed, não tendo sido encontrado associação entre os genótipos desses dois factores e a presença de infecção. No que concerne ao gene PKLR não foi encontrada uma associação clara entre os polimorfismos analisados e o estado de infecção, mas foi detectado um acentuado desequilíbrio de linkage entre os loci, apenas nos Não Infectados, o que pode significar que essa região do gene, aparentemente conservada, tenha sido seleccionada por fornecer protecção contra a infecção e/ou doença. A diversidade genética das populações de A. arabiensis em onze loci microssatélites foi moderada com valores médio de He, variando de 0,481 a 0,522 e a Rs de 4 a 5. O valor da diferenciação genética baseado em 7 loci polimórficos foi baixo (FST=0,012; p<0,001) mas significativo, variando entre 0,001 e 0,023 entre os pares de populações. Não foram detectados os alelos de resistência associados ao gene Kdr. A baixa frequência dos alelos associados à G6PD (A- e Med) tem implicações importantes nas estratégias de controlo definidas pelo Programa Nacional de Luta contra o Paludismo (PNLP), uma vez que a primaquina pode continuar a ser administrada como complemento aos regimes terapêuticos, em caso de necessidade. A população de A. arabiensis em Santiago revelou-se relativamente homogénea e com uma estrutura reduzida o que pode, por um lado, representar uma desvantagem por permitir uma provável dispersão dos genes de resistência. Por outro lado, essa relativa homogeneidade poderá representar uma vantagem para a introdução de um programa de controlo baseado na libertação de mosquitos transgénicos.

Diversidade genética da população parasitária de leishmania em Portugal

RESUMO O presente estudo teve como principal objectivo avaliar a diversidade genética de uma população parasitária de Leishmania em isolados portugueses de hospedeiros humanos, caninos, vulpinos e do vector, aplicando dois marcadores moleculares: kDNA e microssatélites. No Capítulo 1 fez-se uma revisão bibliográfica sobre as leishmanioses incluindo a epidemiologia da infecção nos países da bacia mediterrânica nomeadamente Portugal. Deu-se especial relevo à epidemiologia molecular que nos últimos anos tem vindo a ser desenvolvida. No Capítulo 2 efectuou-se um inquérito de leishmaniose canina que abrangeu 374 cães provenientes da Região Metropolitana de Lisboa. Foi encontrada uma prevalência total de 19,2%, com a prevalência de 18,4% nos cães com dono e 21,6% nos cães sem dono ou vadios. Os resultados obtidos evidenciaram a importância dos cães vadios na transmissão do parasita e disseminação da doença. A partir dos 72 cães infectados, foram isolados 49 estirpes de Leishmania, tendo estas sido tipadas como L. infantum zimodeme MON-1. Estas estirpes, em conjunto com outras amostras isoladas a partir de humanos, vector e outros canídeos, foram utilizadas para avaliar a diversidade genética. No Capítulo 3 foram desenvolvidas sequências iniciadoras cinetoplastideais, MC1 e MC2, tendo-se estas revelado específicas e sensíveis para a identificação do complexo L. donovani isolados em cultura ou directamente a partir de amostras clínicas. Aplicou-se a metodologia de kDNA-PCR-RFLP na análise de 161 amostras de DNA, das quais 134 eram provenientes de isolados portugueses de L. infantum. Foram identificados 16 genótipos na totalidade das amostras, tendo 13 sido identificados nas amostras portuguesas. Observou-se a predominância do genótipo A, observado exclusivamente na população parasitária portuguesa. Em termos geográficos esta metodologia mostrou estar de acordo com a tipagem isoenzimática, e outros marcadores moleculares, individualizando as amostras provenientes de África num único genótipo. No entanto não se observou individualização ao nível das regiões de Portugal estudadas, sugerindo a existência de fluxo genético entre as diferentes áreas geográficas. No Capítulo 4 aplicou-se a análise de 13 loci de microssatélites, polimórficos para L. infantum, em 154 amostras, das quais 128 eram provenientes de diferentes regiões geográficas de Portugal e de diferentes hospedeiros e vector. Obteve-se um maior grau de polimorfismo com estes marcadores do que com o kDNA, identificando-se 85 genótipos. Observou-se uma maior diversidade molecular nas amostras provenientes do Algarve e Alto Douro e, relativamente ao hospedeiro, estes alvos moleculares mostraram ser muito mais polimórficos no hospedeiro humano que o canino, indo ao encontro dos resultados de tipagem isoenzimática que se conhecem até à actualidade. Foi individualizado um agrupamento de amostras não MON-1 e dentro deste, um sub-agrupamento das amostras de África Oriental (Etiópia e Sudão), como anteriormente sugerido por outros autores. No Capítulo 5 discutiram-se os resultados obtidos permitindo verificar que a variabilidade dos parasitas Leishmania no nosso país é maior do que tem sido considerada até ao presente. Possibilitaram também o conhecimento de que há genótipos predominantes em Portugal e que a variabilidade genética no hospedeiro humano e no vector é superior à do reservatório doméstico e silvático.

Diversidade genética e resistência natural ao Maraviroc em estirpes do vírus da imunodeficiência humana Tipo 1 (HIV-1) em circulação em utilizadores de drogas por via endovenosa na Grande Lisboa

RESUMO: O maraviroc (MVC) é o único anti-retroviral antagonista do co-receptor CCR5 licenciado e interage com as ansas transmembranares de CCR5, induzindo uma alteração da sua conformação e impedindo a interacção com gp120. O MVC é activo apenas contra estirpes R5 de HIV-1, sendo utilizado em terapia de recurso. Neste trabalho, foi estudada a diversidade genética da região C2V3C3 do gene env de estirpes de HIV-1 de oxicodependentes por via endovenosa da Grande Lisboa, pesquisando-se também a presença de polimorfismos genéticos naturais. Foram utilizadas 52 amostras de plasma e para 35 destas foi amplificado por RT-nested PCR um produto de 565 pb. A análise filogenética revelou a seguinte distribuição de genótipos: 23 B (incluindo, provavelmente, 2 CRF14_BG), 8 A, 3 G e 1 F1. Após tradução, e por comparação com a sequência consenso B, verificou-se uma elevada frequência de polimorfismos genéticos, sendo encontradas algumas “assinaturas de aminoácidos” relativas aos subtipos não-B. Realizou-se ainda uma pesquisa de locais de N-glicosilação e a previsão da utilização de co-receptores (abordagem genotípica), com recurso às regras 11/25 e da carga líquida da ansa V3 e aos programas PSSM e geno2pheno[coreceptor]. Observou-se uma conservação genérica do número de locais de N-glicosilação e foram identificadas 5 sequências com tropismo X4 ou duplo. Por fim, com base na literatura, realizou-se uma pesquisa de polimorfismos genéticos associados a resistência ao MVC presentes na ansa V3. Foi observado um número elevado destas mutações. A presença dos padrões 11S+26V e 20F+25D+26V, num total de 3 sequências, é relevante, visto estes estarem inequivocamente associados à resistência in vivo ao MVC. Apesar de não estar ainda definido um perfil de resistência para o MVC, a presença das mutações encontradas, em indivíduos sem contacto prévio com o fármaco, trará implicações relevantes na sua gestão clínica, considerando a introdução do MVC na terapia de recurso.---------- ABSTRACT: Maraviroc (MVC) is the only CCR5 inhibitor licensed today. This drug interacts with the transmembrane helices of CCR5 co-receptor, inducing a conformation change of its extracellular loops and preventing the interaction with gp120. MVC is only active against R5 strains of HIV-1 and is currently used in salvage therapy. The genetic diversity of the env C2V3C3 region of HIV-1 strains from injecting drug users in the Greater Lisbon was studied, along with the presence of natural genetic polymorphisms. 52 plasma samples were used and the amplification by RT-nested PCR of a 565 bp-product was possible in 35 of them. The phylogenetic analysis revealed 23 sequences classified as subtype B (probably including 2 CRF14_BG), 8 A, 3 G and 1 F1. After translation, the presence of natural genetic polymorphisms was studied by comparison to a subtype B consensus. A high frequency of genetic polymorphisms was observed and significant “amino acid signatures” were found in association with non-B subtypes. A full characterization of the N-glycosylation sites was also performed and a coreceptor prediction (genotypic approach) was accomplished using the 11/25 and the V3 net charge rules and the programs PSSM and geno2pheno[coreceptor]. The number of N-glycosylation sites was generically preserved. Five sequences were defined as X4 or dual-tropic. Based on published data, a search for genetic polymorphisms, present in V3loop, associated to MVC resistance was finally undertaken. Several of such mutations were observed, being particularly interesting the presence of the patterns 11S+26V and 20F+25D+26V, in a total of 3 sequences, since these patterns have unequivocally been associated with MVC resistance in vivo. Although a resistance profile for MVC is not yet defined, the presence of these mutations in MVC-naïve populations may have significant impact in their clinical management in the future, especially considering the introduction of this drug in salvage therapy.

Desenvolvimento de Primer universal de SBE para codificação espectral de SNP

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Biotecnologia

Stresse térmico em plantas de trigo. Alterações na composição do grão

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Tecnologia e Segurança Alimentar

Resistência a insecticidas em Anopheles gambiae s.l. na Região de Luanda, Angola

Em Angola, a malária é a principal causa de morbilidade e de mortalidade infantil. O controlo de vectores com recurso aos insecticidas representa uma parte importante da estratégia actual para a prevenção da doença. Em Anopheles gambiae s.s., principal vector de malária em África, estão identificadas duas mutações pontuais no gene que codifica os canais de sódio das membranas das células do sistema nervoso, conferindo resistência knockdown (kdr) aos insecticidas piretróides e ao DDT. Também se encontra descrita para esta espécie uma mutação no gene acetilcolinesterase-1 (ace-1), associada à resistência a carbamatos e organofosfatos. Este trabalho teve como principal objectivo avaliar o nível de resistência aos insecticidas em An. gambiae da província de Luanda, Angola e determinar a frequência destas mutações. Foram realizadas colheitas entomológicas em 2009 e 2010, através da prospeção de criadouros larvares. Os insectos capturados foram criados até a emergência do adulto e sujeitos a ensaios de susceptibilidade a insecticidas, através de testes da OMS. A identificação de espécies e formas moleculares do complexo An. gambiae, bem como a pesquisa de mutações no gene ace-1 foram feitas por PCR-RFLP. A pesquisa de mutações no gene kdr foi realizada por PIRA-PCR. Amostras selecionadas de mosquitos (incluindo uma amostra proveniente de uma colheita de adultos) foram ainda genotipadas para 11 loci microssatélites. Os níveis de resistência para a permetrina, DDT e -cialotrina foram elevados, com taxas de mortalidade inferiores a 70% em ambos os anos. Em contraste, as taxas de mortalidade foram sempre acima de 98% para bendiocarb e fenitrotião, indicadoras de susceptibilidade a estes insecticidas. Todas as amostras processadas foram identificadas como An. gambiae s.s., forma molecular M e não se observou a mutação no gene ace-1 associada à resistência. Em ambos os anos, foi detectada apenas a mutação L1014F no locus kdr e a frequência do alelo mutante (TTT) foi bastante elevada. Em 2009, observou-se uma associação entre genótipos homozigóticos para o alelo 1014F e o fenótipo resistente, para os insecticidas piretróides e para o DDT. O polimorfismo dos loci microssatélites analisados foi elevado, com a riqueza alélica a variar entre 5 (45C1) e 20 (H128) e a heterozigotia esperada entre 0,529 (H577) e 0,862 (H249). A análise genética não revelou um grau de parentesco entre os indivíduos que constituíram as amostras estudadas. Este resultado sugere que os elevados níveis de resistência observados não foram influenciados pelo método de colheita de mosquitos que, em certas condições, poderia contribuir para a amostragem de indivíduos aparentados.

Seroprevalência e subtipos do vírus da hepatite C circulantes em indivíduos co-infectados com o vírus da imunodeficiência humana

Mundialmente, estima-se que 40 milhões de pessoas estejam infectadas com VIH, 5 milhões das quais cronicamente infectadas com VHC. A co-infecção com VIH aumenta a taxa de persistência do VHC, acelera a velocidade de progressão da doença hepática e reduz significativamente a resposta à terapia do VHC. O VHC possui extensa diversidade genética, sendo classificado em seis genótipos e cerca de 90 subtipos com padrões epidemiológicos e resposta à terapia distintos. Tendo isto presente e devido a serem limitados os dados relativos aos genótipos e subtipos do VHC circulantes em Portugal e ainda ao facto de os utilizadores de drogas injectáveis (UDIs) serem um grupo de risco importante para a co-infecção por VIH e VHC, realizámos um estudo retrospectivo para determinar a prevalência da infecção por VHC e a distribuição de subtipos deste vírus num grupo de UDIs infectados com VIH. Amostras de plasma de 66 indivíduos (1998-2001) foram testadas para anticorpos anti-VHC (ensaio imunoenzimático) e RNA do VHC (amplificação da 5’UTR por RT-PCR). Para identificar os subtipos de VHC e detectar recombinantes, as amostras com RNA viral detectável foram sujeitas a amplificação, sequenciação e análise filogenética de sequências nucleotídicas parciais para C/E1 e NS5B. Encontrámos que 86,4% dos indivíduos possuíam anticorpos anti-VHC, 93,0% dos quais com infecção activa. Todas as amostras, exceptuando duas, com RNA viral detectável originaram amplicões para C/E1 e NS5B. A análise filogenética permitiu incluir as estirpes de VHC nos subtipos 1a (43,8%), 1b (3,6%), 2a (1,8%), 3a (21,1%), 4a (8,8%) e 4d (15,8%), revelando um padrão epidemiológico semelhante ao dos UDIs de outros países do Sul da Europa. Apenas uma amostra apresentou discordância entre os subtipos das duas regiões (4d para C/E1 e 4a para NS5B) sugerindo um potencial recombinante intragenótipo. No total, os subtipos 1a, 4a e 4d do VHC são responsáveis por 68,4% das infecções nos UDIs infectados com VIH analisados. Considerando que apenas 20-30% dos doentes positivos para VIH e co-infectados com os genótipos 1 e 4 respondem à terapia do VHC e que ocorre transmissão do VHC dos UDIs para a população em geral, são prioritários estudos alargados de vigilância epidemiológica e implementação de estratégias de prevenção para controlar ambos os vírus neste grupo de risco.