Reacção de cisão da molécula de azoto em xénon supercrítico

Apenas há 100 anos atrás foi finalmente estabelecido que os sistemas biológicos têm a capacidade de fixar o azoto. A Química ainda se encontrava atrasada, mas em 1913, Haber e Bosh projectaram a primeira instalação comercial de fixação do azoto e fundaram a indústria química inorgânica moderna. Os mecanismos destes dois processos relacionados são, no entanto, muito diversos. Laplaza e Cummins apresentaram na revista Science uma reacção que representa o culminar de 30 anos de trabalho da comunidade química na fixação de azoto em condições próximas das atmosféricas. Esta descoberta apresenta um complexo inorgânico simples que pode quebrar a ligação tripla da molécula de azoto para formar um novo nitrilo-complexo sem a necessidade de qualquer outro reagente. Esta publicação inspirou o trabalho apresentado nesta tese. Como a transferência de massa entre as fases – gasosa (azoto) e o solvente líquido – constituía um factor limitativo da cinética da reacção, assim a utilização de um solvente supercrítico pareceu ser uma melhoria óbvia. O xénon é o único fluido supercrítico, à temperatura ambiente suficientemente inerte quimicamente para ser usado como solvente em contacto com uma substância extremamente reactiva, capaz de quebrar a ligação da molécula de azoto. Neste trabalho, a reacção descoberta por Laplaza e Cummins foi efectuada em xénon supercrítico. A realização desta reacção envolveu diversas etapas: 1. As sínteses do composto Mo(NRAr)3 (1) (onde R é C(CD3)2CH3 e Ar é 3,5-C6H3(CH3)2), usando caixa de luvas e técnicas sob atmosfera de árgon; 2. A construção de uma nova instalação, projectada para a realização da reacção do composto 1 com o azoto em xénon supercrítico, com monitorização contínua através de espectrofotometria visível; 3. A introdução de sucessivas modificações devido a dificuldades experimentais imprevistas conduziu à reconstrução substancial da primeira instalação utilizada, de forma a ser possível medir a solubilidade do composto 1 em xénon supercrítico, e de proporcionar a difusão do azoto no xénon. 4. Medições da solubilidade do complexo 1 em xénon supercrítico, à temperatura ambiente e pressões entre 6 e 10MPa; 5. Medições da cinética da reacção do composto 1 com azoto gasoso, usando xénon supercrítico como solvente, em diversas condições, com diversos ambientes de solventes, em diferentes quantidades do composto 1, e usando métodos de detecção completamente diferentes do método espectroscópico inicialmente programado; 6. Utilização de simulações em CFD (Computer Fluid Dynamics) para interpretar os resultados obtidos. Estas simulações sugerem que a elevada densidade do xénon induz a sedimentação lenta do excesso (não dissolvido) do composto 1, que controla a distribuição do produto da reacção dentro do reactor. A conclusão principal foi a de que a cisão da ligação da molécula do azoto pelo composto 1 pode ser obtida em segundos em xénon supercrítico.

Transferência de electrão em bases de ADN por colisões átomo-molécula

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obtenção do grau de Mestre em Engenharia Biomédica

Dissociação directa e estatística de iões negativos por colisão átomo-molécula

Dissertação apresentada para obtenção do Grau de Doutor em Física, na especialidade de Física Atómica e Molecular pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

Decomposição do uracilo por colisões átomo-molécula: formação do anião NCO

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Física

Degradação da glicina por transferência de electrão em colisões átomo molécula

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obtenção do grau de Mestre em Engenharia Biomédica

Decomposição de aminoácidos alifáticos por transferência de electrão em colisões átomo-molécula

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Biomédica

Propriedades físico-químicas de líquidos iónicos e estudos quimio- informáticos de reactividade química

Dissertação apresentada para a obtenção do Grau de Doutor em Química Especialidade de Química Orgânica Pela Universidade Nova de Lisboa Faculdade de Ciências e Tecnologia

Resolução cinética enzimática de álcoois secundários em água por tecnologia de miniemulsões

Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obtenção do grau de Mestre em Biotecnologia

Immune reconstitution after autologous hematopoietic stem cell transplantation

Abstract The investigation of the web of relationships between the different elements of the immune system has proven instrumental to better understand this complex biological system. This is particularly true in the case of the interactions between B and T lymphocytes, both during cellular development and at the stage of cellular effectors functions. The understanding of the B–T cells interdependency and the possibility to manipulate this relationship may be directly applicable to situations where immunity is deficient, as is the case of cancer or immune suppression after radio and chemotherapy. The work presented here started with the development of a novel and accurate tool to directly assess the diversity of the cellular repertoire (Chapter III). Contractions of T cell receptor diversity have been related with a deficient immune status. This method uses gene chips platforms where nucleic acids coding for lymphocyte receptors are hybridized and is based on the fact that the frequency of hybridization of nucleic acids to the oligonucleotides on a gene chip varies in direct proportion to diversity. Subsequently, and using this new method and other techniques of cell quantification I examined, in an animal model, the role that polyclonal B cells and immunoglobulin exert upon T cell development in the thymus, specifically on the acquisition of a broader repertoire diversity by the T cell receptors (Chapter IV and V). The hypothesis tested was if the presence of more diverse peptides in the thymus, namely polyclonal immunoglobulin, would induce the generation of more diverse T cells precursors. The results obtained demonstrated that the diversity of the T cell compartment is increased by the presence of polyclonal immunoglobulin. Polyclonal immunoglobulin, and particularly the Fab fragments of the molecule, represent the most diverse self-molecules in the body and its peptides are presented by antigen presenting cells to precursor T cells in the thymus during its development. This probably contributes significantly to the generation of receptor diversity. Furthermore, we also demonstrated that a more diverse repertoire of T lymphocytes is associated with a more effective and robust T cell immune function in vivo, as mice with a more diverse T cell receptors reject minor histocompatiblility discordant skin grafts faster than mice with a shrunken T cell receptor repertoire (Chapter V). We believe that a broader T cell receptor diversity allows a more efficient recognition and rejection of a higher range of external and internal aggressions. In this work it is demonstrated that a reduction of TCR diversity by thymectomy in wild type mice significantly increased survival of H-Y incompatible skin grafts, indicating decrease on T cell function. In addiction reconstitution of T-cell diversity in mice with a decreased T cell repertoire diversity with immunoglobulin Fab fragments, lead to a increase on TCR diversity and to a significantly decreased survival of the skin grafts (Chapter V). These results strongly suggest that increases on T cell repertoire diversity contribute to improvement of T cell function. Our results may have important implications on therapy and immune reconstitution in the context of AIDS, cancer, autoimmunity and post myeloablative treatments. Based on the previous results, we tested the clinical hypothesis that patients with haematological malignancies subjected to stem cell transplantation who recovered a robust immune system would have a better survival compared to patients who did not recover such a robust immune system. This study was undertaken by the examination of the progression and overall survival of 42 patients with mantle cell non-Hodgkin lymphoma receiving autologous hematopoietic stem cell transplantation (Chapter VI). The results obtained show that patients who recovered higher numbers of lymphocytes soon after autologous transplantation had a statistically significantly longer progression free and overall survivals. These results demonstrate the positive impact that a more robust immune system reconstitution after stem cell transplantation may have upon the survival of patients with haematological malignancies. In a similar clinical research framework, this dissertation also includes the study of the impact of recovering normal serum levels of polyclonal immunoglobulin on the survival of patients with another B cell haematological malignancy, multiple myeloma, after autologous stem cell transplantation (Chapter VII). The relapse free survival of the 110 patients with multiple myeloma analysed was associated with their ability to recover normal serum levels of the polyclonal compartment of immunoglobulin. These results suggest again the important effect of polyclonal immunoglobulin for the (re)generation of the immune competence. We also studied the impact of a robust immunity for the response to treatment with the antibody anti CD20, rituximab, in patients with non- Hodgkin’s lymphoma (NHL) (Chapter VIII). Patients with higher absolute counts of CD4+ T lymphocytes respond better (in terms of longer progression free survival) to rituximab compared to patients with lower number of CD4+ T lymphocytes. These observations highlight again the fact that a competent immune system is required for the clinical benefit of rituximab therapy in NHL patients. In conclusion, the work presented in this dissertation demonstrates, for the first time, that diverse B cells and polyclonal immunoglobulin promote T cell diversification in the thymus and improve T lymphocyte function. Also, it shows that in the setting of immune reconstitution, as after autologous stem cell transplantation for mantle cell lymphoma and in the setting of immune therapy for NHL, the absolute lymphocyte counts are an independent factor predicting progression free and overall survival. These results can have an important application in the clinical practice since the majority of the current treatments for cancer are immunosuppressive and implicate a subsequent immune recovery. Also, the effects of a number of antineoplastic treatments, including biological agents, depend on the immune system activity. In this way, studies similar to the ones presented here, where methods to improve the immune reconstitution are examined, may prove to be instrumental for a better understanding of the immune system and to guide more efficient treatment options and the design of future clinical trials. Resumo O estudo da rede de inter-relações entre os diversos elementos do sistema immune tem-se mostrado um instrumento essencial para uma melhor compreensão deste complexo sistema biológico. Tal é particularmente verdade no caso das interacções entre os linfócitos B e T, quer durante o desenvolvimento celular, quer ao nível das funções celulares efectoras. A compreensão da interdependência entre linfócitos B e T e a possibilidade de manipular esta relação pode ser directamente aplicável a situações em que a imunidade está deficiente, como é o caso das doenças neoplásicas ou da imunossupressão após radio ou quimioterapia. O trabalho apresentado nesta dissertação iniciou-se com o desenvolvimento de um novo método laboratorial para medir directamente a diversidade do reportório celular (Capítulo III). Reduções da diversidade do reportório dos receptores de células T têm sido relacionadas com um estado de imunodeficiência. O método desenvolvido utiliza “gene chips”, aos quais hibridizam os ácidos nucleicos codificantes das cadeias proteicas dos receptores linfocitários. A diversidade é calculada com base na frequência de hibridização do ácido nucleico da amostra aos oligonucleótidos presentes no “gene chip”. De seguida, e utilizando este novo método e outras técnicas de quantificação celular examinei, num modelo animal, o papel que as células policlonais B e a imunoglobulina exercem sobre o desenvolvimento linfocitário T no timo, especificamente na aquisição de um reportório diverso de receptores T (Capítulos IV e V). Testei, então, a hipótese de que a presença no timo de péptidos mais diversos, como a imunoglobulna policlonal, induzisse a génese de precursores T mais diversos. Demonstrámos que a diversidade do compartimento T é aumentado pela presença de imunoglobulina policlonal. A imunoglobulina policlonal, e particularmente os fragmentos Fab desta molécula, representam as moléculas autólogas mais diversas presentes nos organismos vertebrados. Estes péptidos são apresentados por células apresentadoras de antigénio às células precursoras T no timo, durante o desenvolvimento celular T. Tal, provavelmente, contribui para a génese da diversidade dos receptores. Também demonstrámos que a presença de um reportório mais diverso de linfócitos T se associa a um incremento da função imunológica T in vivo. Uma diversidade de receptores T mais extensa parece permitir um reconhecimento e rejeição mais eficientes de um maior número de agressores internos e externos. Demonstrámos que ratinhos com receptores de células T (RCT) com maior diversidade rejeitam transplantes cutâneos discordantes para antigénios minor de histocompatibilidade mais rapidamente do que ratinhos com um menor reportório T (Capítulo V). Por outro lado, uma redução da diversidade do RCT, causada por timectomia de ratinhos de estirpes selvagens, mostrou aumentar significativamente a sobrevivência de transplantes cutâneos incompatíveis para o antigénio H-Y (antigénio minor de histocompatibilidade), indicando uma diminuição da função linfocitária T. Além disso, a reconstituição da diversidade dos linfócitos T em ratinhos com uma diversidade de reportório T diminuída, induzida pela administração de fragmentos Fab de imunoglobulina, conduz a um aumento da diversidade dos RCT e a uma diminuição significativa da sobrevivência dos enxertos cutâneos (Capítulo V). Estes resultados sugerem que o aumento do reportório de células T contribui para uma melhoria das funções celulares T e poderão ter implicações importantes na terapêutica e reconstitutição imunológica em contexto de SIDA, neoplasias, autoimunidade e após tratamentos mieloablativos. Baseado nos resultados anteriores, decidimos testar a hipótese clínica de que doentes com neoplasias hematológicas sujeitos a transplantação de precursores hematopoiéticos e com recuperação imunológica precoce após transplante teriam uma sobrevivência mais longa do que doentes que não recuperassem tão bem a sua imunidade. Analisámos a sobrevivência global e sobrevivência sem doença de 42 doentes com linfoma não Hodgkin de células do manto sujeitos a transplante autólogo de precursores hematopoiéticos (Capítulo VI). Os resultados obtidos mostraram que os doentes que recuperaram contagens mais elevadas de linfócitos imediatamente após o transplante autólogo, apresentaram uma sobrevivência global e sem progressão mais longa do que doentes que não recuperaram contagens linfocitárias tão precocemente. Estes resultados demonstram o efeito positivo de uma reconstitutição imunológica robusta após transplante de presursores hematopoiéticos, sobre a sobrevivência de doentes com neoplasias hematológicas. Do mesmo modo, estudámos o efeito que a recuperação de níveis séricos normais de imunoglobulina policlonal tem na sobrevivência de doentes com outras neoplasias hematológicas de linfócitos B, como o mieloma múltiplo,após transplante autólogo de precursos hematopoiéticos (Capítulo VII). A sobrevivência livre de doença dos 110 doentes com mieloma múltiplo analizados está associada com a sua capacidade de recuperar níveis séricos normais do compartmento policlonal de imunoglobulina. Estes resultados pioneiros indicam a importância da imunoglobulina policlonal para a génese de competência imunológica. Também estudámos o impacto de um sistema imunitário eficiente sobre a resposta ao tratamento com o anticorpo anti CD20, ituximab, em doentes com linfoma não Hodgkin (LNH) (Capítulo VIII). Os resultados mostram que doentes com valores mais elevados de linfócitos T CD4+ respondem melhor (em termos de maior sobrevida livre de doença) ao rituximab, do que doentes com valores mais baixos. Estas observações ilustram a necessidade de um sistema imunitário competente para o benefício clínico da terapêutica com rituximab em doentes com LNH. Em conclusão, o trabalho apresentado nesta dissertação demonstra que as células B e a imunoglobulina policlonal promovem a diversidade das células T no timo e melhoram a função linfocitária T periférica. Concomitantemente, também demonstrámos que, no contexto de reconstituição imune, por exemplo, após transplante autólogo de precursores hematopoiéticos em doentes com linfomas de células do manto, o número absoluto de linfócitos é uma factor independente da sobrevivência. Os resultados demonstram, também, a importância dos valores de linfocitos T na resposta ao tratamento com rituximab no caso de doentes com LNH. O mesmo princípio se prova pelo facto de que doentes com mieloma múltiplo sujeitos a transplante autólogo de precursores hematopoiéticos que recuperam valores normais séricos de imunoglobulinas policlonais, terem melhores taxas de resposta em comparação com doentes que não recuperam valores normais de imunoglobulinas policlonais. Estes resultados podem ter importantes aplicações na prática clínica dado que a maioria dos tratamentos de doenças neoplásicas implica imunossupressão e, subsequente, recuperação imunológica. Estes estudos podem ser um instrumento fundamental para uma melhor compreensão do sistema imune e guiar uma escolha mais eficiente de opções terapêuticas bem como contribuir para a concepção de futuros estudos clínicos.

UMA ABORDAGEM YEAST TWO-HYBRID PARA O ESTUDO DA REPLICAÇÃO E PATOGÉNESE DO VÍRUS DA HEPATITE DELTA

O vírus da hepatite delta (HDV) é o agente etiológico de uma das formas mais graves de hepatite viral e é ainda endémico em diversas regiões do globo, nomeadamente em África, na Amazónia e no Extremo Oriente. O HDV co-infecta ou super-infecta hepatócitos infectados com o vírus da hepatite B (HBV) aumentando em cerca de 10 vezes o risco de cirrose e hepatite fulminante. A associação clínica entre os dois vírus deve-se ao facto do invólucro do HDV ser constituído pelos antigénios de superfície do HBV (HBsAgs) que são necessários para a propagação da infecção. O genoma do HDV é constituído por uma molécula de RNA de cadeia simples, circular, com cerca de 1.7 Kb, que possui cerca de 70% de emparelhamento interno. Foi identificada uma única grelha de leitura aberta (ORF) no RNA viral que codifica para o antigénio delta (HDAg). A ocorrência de um mecanismo de editing do RNA, resulta na expressão de duas formas do HDAg, a pequena (S-HDAg) e a grande (L-HDAg). Várias funções essenciais para a replicação do HDV têm sido atribuídas a ambas as formas do HDAg, sendo a S-HDAg essencial para a acumulação de RNA viral e a L-HDAg responsável pela interacção com os HBsAgs para formar partículas virais. No entanto, dada a simplicidade dos seus componentes, admite-se que a replicação viral depende das interacções estabelecidas entre os HDAgs e factores celulares do hospedeiro. Apesar do número considerável de factores celulares descritos como interactores dos HDAgs ou RNA virais, a importância de muitas destas interacções não foi elucidada e muitas etapas do ciclo de replicação do HDV permanecem pouco claras. Para além disso, dado o número limitado de factores do hospedeiro que estão envolvidos na sua replicação, é muito provável que um número elevado de interactores do HDV permaneça por identificar. Este trabalho teve como objectivo a identificação de proteínas de fígado humano capazes de interagir com os HDAgs, utilizando o sistema yeast Two-Hybrid (YTH). Identificaram-se trinta proteínas com capacidade de interagir com a S-HDAg no sistema YTH, sendo que estas proteínas se encontram envolvidas em diferentes processos celulares. Com base nas características funcionais, foram seleccionadas três destas proteínas e as suas interacções com a S-HDAg foram investigadas com maior detalhe. As três proteínas seleccionadas foram a ribonucleoproteína nuclear heterogénea C (hnRNPC), a embryonic lethal abnormal vision like1 (ELAVL1/HuR) e a proteína 2 de ligação a EBNA1 (EBP2). As duas primeiras são proteínas de ligação a RNA, previamente descritas como envolvidas em processos de replicações de outros vírus com genoma RNA, enquanto a EBP2, é uma proteína de localização preferencialmente nucleolar, tal como por vezes acontece com os HDAgs. As interacções foram analisadas recorrendo a vários ensaios bioquímicos. No caso da hnRNPC e da HuR, após validação no sistema YTH, a capacidade de interacção com a S-HDAg foi confirmada quer in vitro por blot overlay quer in vivo por co-imunoprecipitação em células de hepatoma humano. Nas mesmas células, observou-se uma co-localização considerável entre os HDAgs e os RNAs virais. Finalmente, de modo a investigar a contribuição das proteínas hnRNPC e HuR na replicação do HDV, procedeu-se ao silenciamento destas proteínas pela utilização de short hairpin RNAs (shRNAs) específicos para os mRNAs correspondentes Observou-se que o silenciamento de ambas as proteínas hnRNPC e HuR endógenas, individualmente resultou numa diminuição acentuada nos níveis de expressão dos HDAgs. No que respeita à EBP2, a interacção com a S-HDAg foi confirmada em condições in vitro com recurso a ensaios de blot overlay e de cromatografia de afinidade. A análise por imunofluorescência indirecta e microscopia confocal revelou co-localização elevada entre os HDAgs e a EBP2, principalmente nos nucléolos de células de hepatoma humano. Finalmente, foi ainda utilizado o sistema YTH para estudar os mecanismos de importação dos HDAgs. Assim, este sistema foi utilizado com o propósito de identificar proteínas celulares capazes de interagir com um domínio específico dos HDAgs, o sinal de localização nuclear (NLS). Na pesquisa YTH realizada obtiveram-se 161 clones positivos, sendo que um deles mostrou codificar para a carioferina α4 (KPNA4). A interacção da KPNA4 com a S-HDAg foi reproduzida em condições in vitro através de um ensaio de cromatografia de afinidade tendo sido utilizadas formas recombinantes das duas proteínas. Este trabalho permitiu identificar várias proteínas celulares que interagem com a S-HDAg. Obtiveram-se evidências sugestivas de que algumas das proteínas identificadas podem desempenhar funções importantes no ciclo de replicação do HDV e que abrem novas perspectivas para o estudo do ciclo de replicação do vírus.

Uma abordagem a sistemas de crescimento celular apical: síntese de um sensor para iões citosólicos de potássio

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Bioorgânica

Lesões inteligentes em DNA

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Dissertação apresentada para obtenção do Grau de Doutor em Química Sustentável pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

Remoção de compostos farmacêuticos de águas residuais por carvões activados

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Produção de biocombustíveis a partir da biomassa : melhoria da resistência do zeólito ZSM-5 aos compostos fenólicos

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