Prevalência de Anticorpos anti-Toxoplasma gondii em Grávidas da Região de Lisboa e Vale do Tejo e Estudo dos Factores de Risco

A toxoplasmose é uma antropozoonose de distribuição mundial que afecta quase um terço da população humana, bem como os animais e é causada por um protozoário intracelular obrigatório, Toxoplasma gondii. A prevalência desta parasitose na população humana varia com os hábitos alimentares, nível sócio-económico e com o clima. A transmissão ao homem está associada à ingestão de oocistos infecciosos (esporulados) provenientes das fezes dos gatos, a partir da água, de alimentos e do solo contaminados, ingestão de quistos na carne crua ou mal cozida, via congénita ou transfusional e por transplante de órgãos e/ou de tecidos de dadores infectados com o parasita e, mais raramente, através do leite não pasteurizado. A transmissão materno-fetal do parasita só ocorre quando a infecção é adquirida pela primeira vez na gravidez, podendo provocar sequelas graves para o feto, nomeadamente, atraso mental e morte fetal. O objectivo deste trabalho foi determinar a prevalência e os factores de risco associados à infecção por T. gondii em grávidas seguidas no Hospital Garcia de Orta. Este estudo teve a duração de 8 meses (Abril de 2010 a Janeiro de 2011) e foram contactadas 163 grávidas, das quais 140 (85,89 %) responderam ao questionário, tendo sido possível recolher soros de 155 (96,88%) grávidas. Os soros recolhidos foram testados para os anticorpos IgG anti-T. gondii pelo kit comercial Toxo-Screen Da e para os anticorpos IgM anti-T. gondii pelo kit comercial Toxo-ISAGA, ambos da bioMérieux®. Nas amostras seropositivas para o anticorpo IgM anti-T. gondii realizou-se a avidez dos anticorpos IgG anti-T. gondii através do kit NovaLisa - Toxoplasma gondii IgG Avidity Test da Novatec™. Foi efectuada a análise descritiva dos dados, centrada essencialmente em frequências absolutas para cada variável. Para testar a associação entre as variáveis utilizou-se o teste Qui-Quadrado de Pearson ou o teste exacto de Fisher (IC 95%, p≤0,05). A prevalência da toxoplasmose nas grávidas, neste estudo, foi de 21,94% (34), dos quais 50% (17) correspondem a grávidas seropositivas só para os anticorpos IgG (imunidade) e os outros 50% (17) correspondem a grávidas seropositivas para os anticorpos IgG/IgM. Neste último grupo, realizou-se a avidez e verificou-se que todas as grávidas eram portadoras de uma infecção antiga. Também, constatou-se que 78,06% das grávidas eram susceptíveis para a toxoplasmose, com risco de adquirirem a doença durante a gravidez. Na análise estatística entre os factores de risco e a infecção por T. gondii nas grávidas verificámos uma associação significativa (p<0,05) entre o número de partos, o conhecimento da toxoplasmose, o contacto com gatos de familiares/amigos e o consumo de carne proveniente da caça (pássaros, coelhos, javalis etc.). Estes factores parecem ser de grande importância na aquisição da infecção por T. gondii nas grávidas, deste estudo, dentre os vários factores investigados. vii Este trabalho pode constituir um alerta para que os profissionais de saúde insistam na prevenção primária, fornecendo informação (escrita e oral) sobre como evitar a infecção por T. gondii durante a gravidez e efectuar uma vigilância serológica, apenas quando esta se torna necessária, ou seja, nas grávidas não imunes à toxoplasmose.

Malhas de polígonos para simulação de tecidos baseadas em regiões afins

Dissertação de Mestrado em Engenharia Informática

Estudo da potencial utilização como agente de contraste em imagem por ressonância magnética de novos magnetolipossomas

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Biomédica

A lesão de isquémia/reperfusão em transplante hepático: análise genética, morfológica e correlação clínica

RESUMO: O transplante hepático ortotópico é uma terapêutica aceite para casos selecionados de falência hepática terminal. O procedimento tem-­‐se aperfeiçoado, evidenciado pelo aumento da taxa de sobrevida de 30 para 75% aos 5 anos, mas cerca de 13 a 27% dos enxertos desenvolve falência primária (PNF) ou disfunção primária (DF) após o transplante. As consequências são devastadoras para a sobrevida do doente e do enxerto. A sua etiologia é multifactorial, incluindo factores relacionados com o dador e o receptor, tempos de isquémia, agressões cirúrgicas, bem como características anatomopatológicas do enxerto. A lesão de isquémia/reperfusão mantem-­‐se como um factor de risco intra operatório, com implicações directas sobre toda a evolução do transplante : existe uma relação íntima entre a PNF e a DF, a preservação do enxerto, a lesão de isquémia/reperfusão, e a falência do transplante. Além disso, está comprovada evidência que sugere que a lesão de I/R torna um aloenxerto mais vulnerável por aumento da imunogenicidade, aumentando a probabilidade de episódios de rejeição precoce e tardia. Com base na prática clínica quotidiana do CHBPT HCC, estudaram-­‐se 54 casos de transplante hepático, agrupados segundo grupos por alocação do enxerto respectivo: Grupo 1(n=27): dador cadáver para receptor cirrótico, Grupo 2 (n=15): dador cadáver para receptor PAF, Grupo 3 (n=12): dador PAF para receptor cirrótico. Observaram-­‐se as alterações histológicas e moleculares sobre o enxerto até ao final da operação do receptor, e as suas consequências clínicas,avaliando: -­‐ As diferentes capacidades de resistência e cada enxerto à lesão de isquémia/reperfusão. -­‐ As situações em que os factores do receptor se sobrepõem às do enxerto na definição do prognóstico, e vice versa. -­‐ A relevância das lesões histológicas e moleculares precoces no tecido hepático na evolução do enxerto e do receptor. Foram colhidas biópsias por agulha dos 54 enxertos hepáticos,42 provenientes de cadáver com coração batente(morte cerebral) e 12 provenientes de dador vivo com PAF, em três tempos diferentes do processo de colheita e transplante hepático: ­‐ A primeira(T0)antes da clampagem da aorta do dador -­‐ A segunda (T1) no final da isquémia fria -­‐ A terceira (T2) após a reperfusão do enxerto, durante o encerramento da parede abdominal. A estas amostras foi extraído RNA total, convertido em cDNA por transcrição reversa e feita a análise da expressão dos genes da CTLA4, IL-­‐1β, IL-­‐4, IL-­‐6, IL-­‐13, TNF-­‐α, Perforina, Selectina, (SELE), Fas-­‐ligando, Granzima-­‐B, Heme-­‐Oxigenase 1(HO1)e Óxido Nítrico Sintetase(iNOS2A)por PCR quantitativo segundo o método do Ct comparativo, utilizando como referência a expressão dos genes da amostra não-­‐isquémica –T0. Os fragmentos de todas as biópsias foram seccionados, para envio de amostra comparativa para processamento histológico habitual, sem qualquer alteração ao protocolo seguido habitualmente na Unidade de Transplantação do Hospital Curry Cabral. A presença de alguns parâmetros histológicos definidos, como esteatose, necrose, vacuolização, congestão sinusoidal e infiltração neutrofílica, foi registada e contabilizada numa classificação numérica. O seguimento clínico e laboratorial, bem como o acompanhamento de eventuais complicações, foi registado e correlacionado com os dados das colheitas de órgãos e com os dados das biópsias. Foram consideradas as seguintes variáveis, como as mais relevantes e objectivas para a interpretação da evolução clínica, tendo sido comparadas estatisticamente com os dados recolhidos, laboratoriais e clínicos: disfunção do enxerto, 207 pós operatórias, número de internamentos igual ou superior a 2 e rejeição crónica e/ou morte do receptor. Foram identificadas características clínicas menos favoráveis, a considerar, nalgumas circunstâncias: género feminino do receptor (sobretudo associado a enxerto masculino, p=0,077), isquémia fria superior a 500 minutos (p=0,074), isquémia quente superior a 90 minutos (p=0,099). Na análise laboratorial, distinguiram-­‐se duas características histológicas desfavoráveis e irreversíveis, como índice de mau prognóstico: a necrose e a balonização (p=0,029); no painel genético escolhido neste estudo,a expressão basal de IL-­‐1β(p=0,028), de SELE p=0,013)e de FAS-­‐L (p=0,079)relacionaram-­‐se com pior prognóstico. Algumas características protectoras intrínsecas dos enxertos só se revelaram indirectamente, como menor infiltração neutrofílica e maior expressão de HO1 e de iNOS nos enxertos PAF, não tendo sido possível provar uma interferência directa nos resultados clínicos. Não se obteve expressão mensurável de genes anti-­‐ inflamatórios nas biopsias hepáticas processadas neste estudo, como a IL13 e a I 4: assim, com a metodologia utilizada, não foi possível obter um perfil de expressão genética associado a boa evolução clínica. O perfil inverso foi sugerido apenas pela expressão basal dos 3 genes mencionados (FAS-­‐L,IL-­‐1β e SELE)no mesmo painel, com o protocolo seguido neste conjunto de 54 doentes. As características do receptor sobrepuseram-­‐se às do enxerto no caso de: -­‐ diagnóstico de PAF no receptor, que determinou uma maior predisposição para a disfunção do enxerto, o que, por sua vez, determina uma menor sobrevida. No entanto, o diagnóstico de PAF no receptor exibe uma curva de sobrevida mais favorável. -­‐ receptores com um baixo balanço de risco (BAR)definiram características favoráveis para enxertos com níveis baixos e moderados de esteatose, fazendo que esta característica, definida como um risco acrescido, não só não se manifestasse clinicamente,como parecesse um factor favorável. As características do enxerto sobrepuseram-­‐se às do receptor no caso de: -­‐ tempo de isquémia fria superior a 500 minutos -­‐ balonização, necrose, FAS-­‐L,IL-­‐1β e SELE em T0 A integração dos resultados moleculares e morfológicos com a evolução clínica, realça o papel da mobilização precoce de neutrófilos nos desempenhos menos favoráveis do enxerto hepático. -------------ABSTRACT: Orthotopic liver transplantation is na accepted therapeutic procedure for selected cases of terminal liver failure. The procedure has been improved, evidenced by the rise of survival rates from 30 to 70% at 5 years, but 13 to 27% of the liver grafts develops primary non function (PNF) or primary dysfunction (PDF) after transplantation. The consequences are devastating for the survival of the patient and of the graft. Its etiology is multifactorial, including factos related with the donor and with the recipient, ischemic times, surgical aggressions, as well as the histological characteristics of the graft. The ischemia/reperfusion lesion is still an intraoperative risk factor, with direct implications in the whole transplant outcome: there is a close interrelation between PNF and DF, graft preservation, ischemia / reperfusion lesion and graft failure. Beyond his, there is proved evidence that suggests that I/R lesion turns the allograft more vulnerable by increasing its immunogenity, increasing the probability of precocious and late rejection episodes. Based on the daily clinical practice at CHBPT /HCC, 54 cases of hepatic transplantation have been studied, grouped by allocation of each graft: Group (n=27):deceased do nortocirrhotic recipient, Group 2 (n=15): deceased donor to FAP recipient, Group 3 (n=12): FAP living donor to cirrhotic recipient. The histologic and molecular changes in the liver graft were observed until the end of the recipiente operation,together with its clinical consequences, evaluating:-­‐The different capacity of resistance of each graft to the ischemia / reperfusion lesion -­‐ The situations where the recipiente factos overlap the ones of the graft, in the definition of prognosis, and vice versa.-­‐ The relevance of the precocious histologic and molecular lesions of the hepatic tissue in the clinical outcome of the graft and the recipient. Needle biopsies were obtained from 54 liver grafts, 42 deceased brain dead donors and 12 from FAP living donors, at three diferente times of the harvesting and the hepatic transplantation: The first one (T0) before clamping the donor aorta -­‐ The second one (T2) in the end of cold ischemia time -­‐ The third one (T) after the reperfusion of the graft, during the closure of the abdominal wall. Total RNAwas extracted to these samples, converted to cDNA by reverse transcription and the analysis of gene expression was made for CTLA4,IL-­‐1β,IL-­‐4,IL-­‐6,IL-­‐13,TNF-­‐α,Perforin,E Selectin (SELE),Fas-­‐ligand,Granzyme-­‐B,Heme-­‐oxigenase 1 (HO1) and Nitric Oxide Sintetase (iNOS2A) by quantitative PCR, according with the Ct comparative method, using the expression of the non ischemic sample – T0. The fragments of all the biopsies were divided, to send a comparative sample to the usual histologic processement, keeping the same usual protocol at the Transplantation Unit of Curry Cabral Hospital. The presence of some defined histologic parameters, such as steatosis, necrosis, vacuolization, sinusoidal congestion and neutrophilic infiltration, was registered and catalogued in a numeric classification. The clinical and laboratory follow-­‐up, as well as the following of eventual complications, was registered and correlated with the data from organ procurement operations and with the data from the biopsies. The following variables were considered as the most relevant and objective ones, to the interpretation of the clinical evolution, being statistically compared with the clinical and laboratorial collected data: graft dysfunction, post-­‐operative complications, number of readmissions of 2 or more and chronic rejection and /or recipiente death. There were identified some unfavorable clinical characteristics, to be considered under certain circumstances: recipiente female gender (specially associated with malegraft, p=0,077), cold ischemia time of more than 500 minutes (p=0,074), warm ischemia time of more than 90 minutes (p=0,099). In the laboratory analysis, two histologic characteristics were identified as unfavorable and irreversible, associated with bad prognosis: necrosis and balonization (p=0,029); in the gene panel selected in this study, the basal expression of IL-­‐1β (p=0,028), SELE (p=0,013) and FAS-­‐L (p=0,079)were related with worse prognosis.Some intrinsic protective characteristics of the grafts were only indirectly revealed, such as less neutrophilic infiltration and bigger expression of HO1 and iNOS in FAP grafts, being impossible to prove any direct inte ference in the clinical results. A relevant and measurable expression of the anti inflammatory genes IL13 and IL4 was not obtained: with the used methodology, it was impossible to obtain a gene expression profile associated with a favorable clinical outcome.The inverse profile was suggested only by the basal expression of the three mentioned genes (FAS-­‐L, IL-­‐ 1β e SELE) in the same gene panel, according with the followed protocol in this group of 54 patients. The characteristics of the recipient overlapped those from the graft, in the case of :-­‐ FAP diagnosis in the recipient, which determined a bigger predisposition to graft dysfunction, which by itself determines a shorter survival. However, FAP diagnosis in the recipiente depicts a more favorable survival curve. -­‐ Recipients with a low balance risk índex (BAR) defined favorable characteristics to grafts with low and moderate grades of steatosis, making that this characteristic, associated with bad prognosis, looked like a favorable factor, and with no clinical interference. The graft characteristics overlapped those from the receptor in the case of: -­‐ Cold ischemic time more than 500 minutes -­‐ Balonization, necrosis, FAS-­‐L, IL-­‐1β and SELE at T0. The integration of molecular and morphologic results with the clinical evolution, stresses the role of a precocious neutrophils mobilization in the worse outcomes of liver grafts.

Caracterização de matrizes de Quitosano para a regeneração de tecidos produzidas pela técnica de TIPS

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Biomédica

Exposição profissional a chumbo : utilização da protoporfirina-zinco (PPZ) na vigilância de saúde de trabalhadores ex

Resumo Uma estratégia de avaliação e prevenção de riscos na exposição a agentes químicos deve ter sempre em conta que a vigilância do ambiente de trabalho e a da saúde dos trabalhadores são aspectos complementares de uma mesma realidade – os riscos resultantes da interacção entre um agente químico e os trabalhadores a ele expostos. Se à Vigilância Ambiental compete apreciar o risco, pela caracterização do agente no ambiente de trabalho, a Vigilância Biológica pronuncia-se sobre a interacção entre o tóxico e o organismo, avaliando a resposta à agressão química e a evolução das reacções de adaptação ou de desajuste face à absorção do tóxico. Os Indicadores Biológicos, deste modo, assumem um estatuto de instrumento privilegiado na vigilância da saúde dos trabalhadores expostos, na medida em que medem a quantidade de tóxico que efectivamente penetrou e foi absorvido, ou o resultado (efeito) determinado por essa mesma dose. O presente estudo procura contribuir para a definição de um quadro metodológico de utilização dos Indicadores Biológicos na avaliação/gestão da exposição profissional ao chumbo, designadamente apreciando a variação da protoporfirina-zinco (PPZ), indicador até ao presente ainda não utilizado em Portugal. O chumbo é um metal de ocorrência natural, cujos níveis nos diversos ecossistemas resultam, principalmente, das actividades antropogénicas de natureza doméstica e industrial. A sua capacidade poluente é assinalável, representando uma fonte de exposição permanente para o homem, demonstrável pela sua constante presença no organismo apesar de não desempenhar qualquer tipo de função fisiológica. São actualmente inúmeras as suas aplicações, tornando a exposição profissional ao chumbo uma realidade vasta: indústrias de acumuladores eléctricos, de vidros, de plásticos e de munições, construção civil, manutenção e reparação automóvel e de navios, fabrico de tintas, indústrias electrónicas, fundições e actividades de soldadura são, entre outras, situações onde é uma realidade a ter em conta. A penetração dos compostos inorgânicos de chumbo no organismo efectua-se principalmente por via respiratória, não sendo, no entanto, desprezável, a sua penetração por via digestiva. As partículas absorvidas são transportadas pelo sangue principalmente ligadas aos eritrocitos (95%), distribuem-se pelos tecidos moles e depositam-se essencialmente no tecido ósseo, onde representam mais de 90% da carga corporal do total absorvido e tendo aí um elevado tempo de semi-vida (mais de 20 anos). Não é metabolizado no organismo e a sua eliminação efectua-se essencialmente por via renal,sendo igualmente excretado, em menor escala, através das fezes, do suor, da saliva, das faneras e do leite materno. O conhecimento científico evidencia que concentrações sanguíneas de chumbo entre 20 e 50 mg/dL são susceptíveis de determinar efeitos adversos no homem, podendo ser afectados o sistema hematopoiético, o sistema nervoso, o sistema cardiovascular, o sistema reprodutor e o sistema imunitário. Contudo, ainda muito há a clarificar no âmbito da toxicidade do chumbo. Os níveis de exposição a que correspondem as alterações nos diversos órgãos e sistemas continuam a ser motivo de alguma controvérsia. As características carcinogénicas e mutagénicas do chumbo são, ainda, um campo de vasta exigência de investigação. A intoxicação por chumbo e seus sais (Saturnismo) de origem ocupacional é reconhecida em Portugal como doença profissional (grupo 1 - Doenças Provocadas por Agentes Químicos, da Lista das Doenças Profissionais). É uma intoxicação do tipo crónico, fruto da absorção contínua de doses relativamente pequenas durante longo período, evidenciando-se no seu início por sinais e sintomas vagos e difusos de grande inespecificidade, que podem incluir, nomeadamente, perda de apetite, sabor metálico na boca, palidez, mal-estar e fadiga, cefaleias, mialgias e artralgias, irritabilidade, tremores finos, obstipação, cólicas abdominais, insónias, déficit da memória de curto prazo e da capacidade de concentração. Um importante conjunto de indicadores biológicos pode ser utilizado na vigilância periódica da saúde de trabalhadores nestas condições de exposição. Tais indicadores (de dose ou de efeito), encerram diferentes significados e comportam distintas exigências, competindo ao Médico do Trabalho, no âmbito dos programas de prevenção dos efeitos adversos relacionados com a exposição profissional a chumbo, seleccionar a sua utilização e interpretar a sua informação, de modo a avaliar a interacção do tóxico com o organismo numa fase de reversibilidade. O presente estudo envolveu 180 trabalhadores dos quais 110 apresentavam plumbémias (Pb-S) iguais ou superiores a 40 mg/dL. Além da Pb-S, a todos foi doseada a protoporfirina-zinco (PPZ) e efectuado o Hemograma e a cerca de 25% foi determinada a concentração do ácido d-aminolevulínico urinário (ALA-U). Os doseamentos da PPZ efectuados em amostra de sangue capilar através de um hematofluorímetro portátil revelaram-se de total fiabilidade, dando significado a uma técnica de fácil execução e baixo custo. A avaliação do tipo de colheita urinária para doseamento do ALA-U concluiu pela necessidade de recurso a urinas de 24 horas.Os resultados do estudo evidenciaram uma elevada associação entre a PPZ e a Pb-S, com uma maior magnitude e de início mais precoce do que o que registado na associação da Pb-S com o ALA-U. Revelaram, ainda, fracos níveis de associação da hemoglobina (e outros parâmetros hematológicos) com a Pb-S. E demonstraram para um cut-off de 100 mg/ dL de PPZ, taxa de falsos negativos e falsos positivos, para plumbémias a partir de 70 mg/dL, inferiores a 20%. Assim, concluiu-se que, nos protocolos de vigilância de saúde de trabalhadores expostos a chumbo, o doseamento da PPZ por hematofluorímetro, em sangue de colheita capilar, é adequado, fiável e de realização preferencial em relação ao do ALA-U. Concluiu-se, também, que a realização do hemograma apenas se justifica em situações individuais que clinicamente o tornem aconselhável. E que estes protocolos devem incluir a realização da Pb-S e da PPZ, podendo, em situações de controlo rigoroso (ambiental, biológico e clínico), basear-se apenas na determinação da PPZ reservando os outros indicadores para aprofundar a investigação médica nos casos de taxas elevadas desta ou de situações limitantes. ■ Résumée Une stratégie d’évaluation et de prévention des risques d’exposition aux agents chimiques doit toujours tenir en considération que la vigilance du lieu de travail et de la santé des travailleurs sont des aspects complémentaires d’une même réalité – les risques résultant d’une interaction entre l’agent chimique et les travailleurs exposés. Si c’est à la Vigilance Ambiantale de juger le risque, par la caractérisation de l’agent dans le lieu de travail, la Vigilance Biologique, elle, se prononce sur l’interaction entre le toxique et l’organisme, évaluant la réponse à l’agression chimique et l’évolution des réactions d’adaptation ou de rupture face à l’absorption du toxique. Les Indicateurs Biologiques assument ainsi un statut d’instrument privilégié de vigilance de la santé des travailleurs exposés, dans la mesure où ils déterminent la quantité de toxique qui a effectivement été pénétré et absorbé, ou le résultat (effet) déterminé par cette dose. Cette étude-ci cherche à contribuer à la définition d’un cadre méthodologique d’utilisation des Indicateurs Biologiques dans l’évaluation/ gestion de l’exposition professionnelle au plomb inorganique, évaluant spécialement le comportement de la protoporphirine-zinc (PPZ), indicateur pas encore utilisé au Portugal.Le plomb est un métal d’occurrence naturelle dont les niveaux dans les différents écosystèmes en résultent, principalement, des activités anthropogéniques de nature domestique et industrielle. Sa capacité polluante peut être signalée, représentant une source d’exposition permanente pour l’homme, celle-ci démontrable par sa présence continue dans l’organisme, même si elle n’y accomplit aucune fonction physiologique. Actuellement ses applications sont innombrables, faisant de l’exposition professionnelle au plomb une réalité de grande ampleur : industries d’accumulateurs électriques, de verre, de plastique et de munitions, bâtiments, manutention et réparation automobile et navale, fabrication d’encres, industries électroniques, fontes et activités de soudure sont, entre autres, des situations réelles a en tenir compte. La pénétration du plomb inorganique dans l’organisme se fait principalement par voie respiratoire, pouvant se faire également par voie digestive. Les particules absorbées sont transportées par le sang, surtout liées aux érythrocytes (95%), se repartent à travers les tissus mous et se déposent essentiellement dans le tissu osseux, où elles représentent plus de 90% de la charge corporelle de ce qui a été absorbé et ont un temps de demi-vie élevé (plus de 20 ans). Le plomb n’est pas métabolisé dans l’organisme et son élimination se fait essentiellement par voie rénale, pouvant tout de même, à une moindre échelle, être excrété dans les fèces, de la sueur, de la salive, des ongles, des cheveux et du lait maternel. La connaissance scientifique met en évidence que des concentrations sanguines de plomb entre 20 et 50 mg/dL sont susceptibles de déterminer des effets adverses dans l’homme, pouvant les systèmes hématopoïétique, nerveux, cardiovasculaire, reproducteur et immunitaire en être affectés. Cependant, il en reste beaucoup à éclaircir dans le domaine de la toxicité du plomb. Les niveaux d’exposition auxquels correspondent les modifications des divers organes et systèmes, demeurent toujours sujet de quelque controverse. Les caractéristiques carcinogèniques et mutagèniques du plomb restent toujours un champ d’investigation d’une grande exigence. L’intoxication par le plomb et ses sels (Saturnisme) d’origine occupationnelle est reconnue, au Portugal, comme une maladie professionnelle (groupe 1- Maladies Provoquées par des Agents Chimiques, de la Liste des Maladies Professionnelles). C’est une intoxication du tipe chronique, due à l’absorption continue de doses relativement petites pendant une longue période, mise en évidence à travers des signes et des symptômes vagues et diffus sans grande spécificité, lesquels peuvent inclure, particulièrement, le manque d’appétit, goût métallique dans la bouche, pâleur, malaise et fatigue, céphalées, myalgies et arthralgies, irritabilité, tremblements fins, constipation, coliques abdominales, insomnies, déficit de la mémoire à court terme et de la capacité de concentration.Un ensemble important d’indicateurs biologiques peut être employé dans la vigilance périodique de la santé des travailleurs dans ces conditions d’exposition. Ces indicateurs (de dose ou d’effet) renferment différentes significations et comportent diverses exigences, devant le Médecin de Travail, dans le domaine des programmes de prévention des effets adverses qui sont en relation avec l’exposition professionnelle au plomb, sélectionner son utilisation et interpréter son information de façon à évaluer l’interaction de l’élément toxique avec l’organisme à un stade de réversibilité. L’étude ci-présent engloba 180 travailleurs desquels 110 présentaient des plombémies (Pb-S) égales ou supérieures à 40 mg/dL. À part la Pb-S, la protoporphyrine-zinc (PPZ) leur a été prise en dosage et un Hémogramme fut effectué et fut déterminé l’acide d- aminolévulinique urinaire (ALA-U) sur environ 25% des travailleurs. Le dosage de la PPZ efectué en échantillon de sang capillaire par un fluorimètre portable, s’est accomplit d’une fiabilité total, donnant du sgnificat à une téchnique de facile execution et bas prix. L’évaluation de la prise urinaire par dosage du ALA-U conclut au besoin d’un recours aux urines de 24 heures Les résultats de l’étude ont mis en évidence une association élevée entre la PPZ et la Pb- S, avec une intensité majeure et de début plus précoce par rapport à celui qui fut registré lors de l’association de la Pb-S avec la ALA-U. Ces résultats ont également montré de faibles niveaux d’association entre l’hémoglobine (et autres paramètres hématologiques) et la Pb-S. Ils ont démontré aussi, une valeur de cut-off de 100 mg/dL de PPZ, des taux de faux négatifs et faux positifs, pour des plombémies de 70 mg/dL, inférieurs à 20%. On peut donc conclure que dans les protocoles de vigilance de la santé des travailleurs exposés au plomb, le dosage de la PPZ par fluorimetrie dans le sang capillaire est adéquat, fiable et de réalisation préférentielle par rapport à celui du ALA-U. On peut également conclure que la réalisation de l’hémogramme ne se justifie que dans les cas individuels où, cliniquement, celui-ci est conseillé. De plus, ces protocoles doivent inclure la réalisation de la Pb-S et de la PPZ, pouvant, en cas de contrôle rigoureux (ambiantal, biologique et clinique), s’appuyer que dans la détermination de la PPZ réservant les autres indicateurs pour approfondir l’investigation médicale dans les cas où les taux de celle-ci sont élevés ou dans les cas de situations limitantes. ■ Summary Any strategy to evaluate and prevent the risks of chemical agents exposure must always regard the work environment and workers health as complementary aspects of one reality - the resulting risks from the interaction between the chemical agent and the exposed workers. It is the responsibility of Environmental Monitoring to evaluate the risks of exposure by the characterization of the chemical agent in the work environment. Biological Monitoring, on the other hand, pronounces itself over the toxin and body interaction, evaluating human response to the chemical aggression and the body adaptations to the toxic absorption. Biological Exposure Indices (BEI) assume, therefore, a privileged status among exposed workers' health monitoring instruments, as they measure the actual penetrated and absorbed toxic quantity and the effect it produces. This research study aims to contribute to the definition of a methodological strategy on the utilization of BEI’s in evaluating inorganic lead's occupational exposure, more specifically appreciating the zinc protoporphyrin (ZPP) variation, an index that has never been taken under consideration in Portugal until now. Lead is a natural metal whose ecosystem’s levels are mainly due to domestic and industrial anthropogenic activities. Its pollutant capacity is notable, representing a permanent exposure risk shown by its constant presence in the human body, although it has no physiologic function. Nowadays, lead's applications are countless, turning its professional exposure a huge reality: storage batteries industries, glass industries, plasterers and munitions industries, building construction, ships and motor car maintenance and repairing, ink manufacture, electronics industries, foundries and other soldering activities are, among so many other, realities to attend to. Respiration is the main cause of human body's inorganic lead absorption, although digestive pathway must not to be ignored. The absorbed particles are transported by blood, essentially bounded to erythrocytes (95%). It is distributed by soft tissues and settled mainly on bone tissues, where it represents approximately 90% of the total body charge and has a high half-life time (more than 20 years). It is not metabolized by the organism, its elimination being effectuated by renal activity and, in smaller scale, through lees, sweat, saliva, nails, hair and maternal milk.Scientific knowledge shows that concentrations of lead in blood between 20 e 50 mg/dL are susceptible to determine adverse effects in man and able to affect the hematopoietic system, the nervous system, the cardiovascular system, the reproductive system and the immunological system. Nevertheless, there's still much to be learned and clarified about lead's toxicity. The correlation between exposure levels and human's systems and organs alteration levels continues to be a centre of controversies. Still, lead's carcinogenic and mutagenic characteristics continue to be a high demanding research field. Intoxication by lead and its compounds (saturnism), from occupational origin, is recognized in Portugal as an occupational disease, included in Group 1 - Chemical Agents Caused Diseases, on the Occupational Diseases List. It is a chronic intoxication caused by a continuous absorption of small doses, throughout a long period of time. Its signs and symptoms are diffuse and imprecise, of great unspecificity, such as loss of appetite, metallic flavor in the mouth, paleness, ailment and fatigue, headaches, myalgia and arthralgia, irritability, thin tremors, constipation, abdominal pain, insomnias, short memory loses and inability to concentrate. A considered number of BEI’s can be used in Periodic Health Monitoring of workers in such exposure conditions. Such BEI (dose indices or effect indices) provide different meanings and imply different procedures, being Occupational Doctors responsibility, in the context of lead related adverse effects preventive programmes, to select and interpret its information, in order to evaluate the interaction between toxic and organism in a reversible phase of the toxic action. The present research study involved 180 workers, 110 of which presented blood lead levels (PbB) above or equal to 40 mg/dL. Besides PbB, all workers has been evaluated for zinc protoporphyrin levels (PPZ) and submitted to a haemogram. About 25% of the workers were selected for d-aminolevulinic urinary acid (ALA-U) determination. The evaluation of PPZ, by a portable hematofluorometer using capillary blood samples, turned out to be an easy procedure with low costs and total warrantability. As in regard for ALA- U procedure, it was concluded the necessity of 24 hours urine samples. This research results underlined a strong connection between ZPP and PbB, which was found to to be stringer and to begin earlier than it was registered for PbB and ALA-U association. The same study also revealed a low association level between PbB and hemoglobin or other hematological indices. It was also verified less than 20% of false negatives and false positives cases when admitted a ZPP 100 mg/dL cut off value for PbB³ 70 mg/dL. As in result it was concluded that in Health Monit

Interacção Parasita-Hospedeiro e susceptibilidade de Leishmania infantum a fármacos

RESUMO As leishmanioses são doenças causadas por um protozoário intracelular pertencente à ordem Kinetoplastida, da família Trypanosomatidae, do género Leishmania. Os parasitas são transmitidos aos hospedeiros vertebrados por dípteros pertencentes à sub-família Phlebotominae. Devido à inexistência de vacinas a quimioterapêutica continua a representar o único mecanismo de prevenção e controlo. Os fármacos de primeira linha para o tratamento da leishmaniose visceral continuam a ser os antimoniais pentavalentes e a anfotericina B (AMB). A AMB lipossómica está a ser cada vez mais utilizada como 1ª linha. O conhecimento do(s) mecanismo(s) utilizados pelos parasitas, responsáveis pela resistência, é fundamental de modo a permitir o desenvolvimento de novos fármacos anti-Leishmania que possam substituir e/ou complementar os fármacos existentes, de uma forma eficaz assim como contribuir para o desenvolvimento de metodologias para avaliar e monitorizar a resistência. Espera-se do modelo animal a reprodução da infecção na Natureza. Os modelos canino e murino têm ajudado na compreensão dos mecanismos responsáveis pela patogénese e pela resposta imunitária à infecção por Leishmania. Sendo o cão o principal hospedeiro da infecção por L. infantum e o principal reservatório doméstico da leishmaniose visceral humana, procedeu-se à caracterização da evolução da infecção experimental em canídeos de raça Beagle através da análise clínica, hematológica, histopatológica, parasitária, assim com através da resposta imunitária desenvolvida. As alterações hematológicas observadas foram as associadas à leishmaniose visceral: anemia, leucopenia, trombocitopenia com aumento das proteínas totais e da fracção gama-globulina, e diminuição da albumina. Histologicamente observou-se nos órgãos viscerais uma reacção inflamatória crónica, acompanhada por vezes da formação de granulomas ricos em macrófagos. Apesar de todos os animais terem ficado infectados (confirmado pela presença do parasita nos vários tecidos e órgãos recolhidos na necrópsia), os únicos sinais clínicos observados transitoriamente foram adenopatia e alopécia. As técnicas moleculares foram significativamente mais eficazes na detecção do parasita do que os métodos parasitológicos convencionais. As amostras não invasivas (sangue periférico e conjuntiva) mostraram ser significativamente menos eficazes na detecção de leishmanias. No nosso modelo experimental não se observou a supressão da resposta celular ao antigénio parasitário e confirmou-se que, apesar de não protectora, a resposta humoral específica é pronunciada e precoce. A bipolarização da resposta imunitária Th1 ou Th2, amplamente descrita nas infecções experimentais por L. major no modelo murino, não foram observadas neste estudo. O facto dos animais não evidenciarem doença apesar do elevado parasitismo nos órgãos viscerais poderá estar relacionado com a expressão simultânea de citocinas de ambos os tipos Th1 e Treg, no baço, fígado, gânglio, medula óssea e sangue periférico. Neste estudo também se caracterizou o efeito da saliva do vector Phlebotomus perniciosus na infecção experimental de murganhos BALB/c com estirpes de L. infantum selvagem e tratada com AMB, inoculadas por via intradérmica. A visceralização da infecção ocorreu após a utilização da via de administração do inóculo que mais se assemelha ao que ocorre na Natureza. Apesar da disseminação dos parasitas nos animais co-inoculados com extracto de uma glândula salivar ter sido anterior à do grupo inoculado apenas com parasitas, não se detectaram diferenças significativas na carga parasitária, entre os três grupos, ao longo do período de observação pelo que, embora a saliva do vector esteja descrita como responsável pela exacerbação da infecção, tal não foi observado no nosso estudo. O aumento de expressão de citocinas esteve relacionado com o aumento do parasitismo mas, tal como no modelo canino, não se observou bipolarização da resposta imunitária. Os animais dos três grupos infectados parecem ter desenvolvido nos diferentes órgãos uma resposta mista dos tipos Th1 e Th2/Treg. Contudo, verificou-se a predominância da expressão Th1 (TNF-α), no fim do período de observação, o que pode estar relacionado com a resolução da infecção. Por outro lado, a presença de parasitas na pele dos animais inoculados com a estirpe L. infantum tratada com AMB permite colocar a hipótese da existência de parasitas resistentes na Natureza e destes poderem ser transmitidos. Após se ter verificado que a estirpe de L. infantum tratada com AMB tinha a capacidade de infectar e visceralizar no modelo murino, analisou-se o seu comportamento em dois dos principais vectores de L. infantum, Lutzomyia longipalpis e P. perniciosus. Os parasitas tratados com AMB apresentaram uma menor capacidade de permanecerem no interior do vector assim como um desenvolvimento mais lento apontando para uma menor capacidade de transmissão das estirpes resistentes a este fármaco, pelo que o tratamento com AMB poderá ser favorável à prevenção e controlo através da interrupção do ciclo de vida do parasita. De modo a determinar in vitro a susceptibilidade de Leishmania aos diferentes fármacos utilizados na terapêutica da leishmaniose humana e canina (Glucantime®, Fungizone®, miltefosine e alopurinol) comparou-se o sistema de promastigotas axénicos com o sistema amatigota-macrófago. Verificou-se que, para as estirpes estudadas, os resultados de ambos os sistemas não apresentavam diferenças significativas sendo a utilização do primeiro mais vantajosa ao ser menos moroso e de mais fácil execução. Seleccionaram-se estirpes quimio-resistentes in vitro, por exposição prolongada a doses crescentes de AMB, tendo-se verificado que os parasitas tratados, apresentaram uma menor susceptibilidade do que os não tratados à acção dos fármacos estudados, com excepção do alopurinol. A diminuição da susceptibilidade das estirpes aos fármacos utilizados poderá facilitar a dispersão de parasitas multiresistentes. Sendo a apoptose um dos mecanismos utilizados pelos parasitas para evitar a indução de uma resposta imune por acção de compostos anti- Leishmania, determinou-se o número de amastigotas apoptóticos assim como a produção de TNF-α e IL-10 pelos macrófagos tratados. Concluiu-se que os compostos conseguiram suprimir a produção de IL-10, inibidora da activação dos macrófagos, contudo nem a produção da citocina pro-inflamatória TNF- α nem a apoptose pareceram ser os principais mecanismos responsáveis à sobrevivência dos parasitas ao contacto com os fármacos.

Educar para o regresso a casa após o transplante hepático

RESUMO: Em cuidados de saúde diferenciados, a promoção da saúde e as actividades de educação para a saúde são indispensáveis à capacitação individual, habilitando a pessoa a prevenir complicações da sua patologia e a agir no sentido de exercerem um maior controlo sobre a sua própria saúde para a obtenção de ganhos em saúde. Com esta investigação pretendeu-se analisar a satisfação da pessoa transplantada hepática sobre os cuidados de enfermagem prestados, no âmbito da educação para a saúde e identificar dimensões que influenciaram a percepção e experiência da pessoa, face à preparação do regresso a casa. Foi realizado um estudo descritivo, transversal, de abordagem de investigação mista e exploratório, com orientação quantitativa e qualitativa, num movimento dedutivo-indutivo, baseado numa amostra de conveniência de 75 pessoas transplantadas hepáticas do Hospital de Curry Cabral. Os resultados foram analisados no âmbito da problemática em estudo, baseada na estrutura do movimento metodológico, ao nível das expectativas, experiência e percepção da satisfação da pessoa transplantada hepática. Neste estudo, salienta-se que os factores do domínio sócio-demográfico que influenciaram as expectativas são a idade e o tempo de internamento, assim como as experiências anteriores influenciaram a forma como a pessoa transplantada hepática recebeu as informações nesse internamento. As pessoas submetidas a transplante hepático, inquiridas neste estudo, afirmaram, em termos globais, que os cuidados de enfermagem recebidos durante o internamento, no âmbito da educação para a saúde, para o regresso a casa foram “Bons/Muito Bons” e “Razoáveis”. As expectativas, experiências anteriores, experiência com os cuidados de enfermagem e as percepções sobre os cuidados de enfermagem e a preparação para o regresso a casa são, neste contexto, reconhecidas como influenciadoras da satisfação com os cuidados de enfermagem. É imprescindível, portanto, que as actividades de educação para a saúde desenvolvidas pelos enfermeiros, usando a sua autonomia, contribuam para enfatizar o cuidar profissional em enfermagem, dando visibilidade à sua intervenção com a pessoa e/ou família no regresso a casa. SUMMARY: In differentiated healthcare, the promotion of health and health education activities are indispensable for personal empowerment, preparing the individual to prevent complications of his own disease, exercising a greater control over his own health, resulting in global health gains. This investigation was intended to analyse the satisfaction of liver transplant patients about the nursing care given, concerning health education, as well as to try and identify aspects that influenced the patient’s perception and experience when dealing with the preparation of returning home. The study was descriptive, with a mixed approach of exploratory and mixed inquiry, with qualitative and quantitative orientation, in a deductive-inductive direction. The population integrated a convenience sample of 75 liver transplant patients admitted at the Curry Cabral Hospital. The results were analysed according to the objectives, based on the methodological movement structure, level of expectations, experience and perception of the patient’s satisfaction. This study draws attention to the fact that demographic factors such as age and hospitalisation time influenced expectations, as well as previous experiences influenced the manner in which these patients received information during their hospital stay. The patients submitted to liver transplant, questioned in this study, affirmed, in a global manner, that nursing care given during admission, concerning health education for returning home were "Good/Very Good" and "Reasonable". Expectations, previous experiences, experience with and perceptions about nursing care as well as hospital discharge preparation were in this context, recognized as influences on the satisfaction of nursing care given. It is indispensable, therefore, that activities related to health education autonomously developed by nurses, contribute to emphasize the professional role of nursing care, highlighting the nurse’s intervention with the patient and/or family when returning home.

A regulação endócrina dos balanços de cálcio

RESUMO: As concentrações circulantes de cálcio são notavelmente constantes a despeito das variações diárias na absorção intestinal e na eliminação renal deste elemento. A regulação da calcémia é um sistema complexo que compreende vários factores controladores (a calcémia, a fosforémia, as concentrações circulantes de paratormona (PTH) e calcitriol além de muitos outros factores como hormonas esteróides em geral, outros iões como o magnésio e outros factores hormonais) e vários órgãos alvo (glândulas paratiroideias, osso, rim e intestino). As respostas dos órgãos alvo também são muito variadas. No caso mais simples, a cristalização de sais de cálcio corresponde a uma mudança de fase em que participam moléculas orgânicas que a iniciam, aceleram ou inibem. Em geral a combinação de um factor controlador com o respectivo receptor de membrana (para polipeptídeos ou iões) ou intracelular (hormonas esteróides) é apenas o primeiro passo de uma cadeia bioquímica que introduz uma enorme amplificação na resposta. A esta variedade de mecanismos de resposta correspondem grandes diferenças nos tempos de resposta que podem ser de minutos a semanas. É hoje possível “observar” (medir) com apreciável rigor nos líquidos biológicos (sangue, urina, fezes, etc.) os factores mais importantes do sistema de regulação da calcémia (cálcio, fósforo, paratormona e calcitriol) assim como administrar estes factores em experiências agudas. Esta possibilidade reflecte – se na literatura neste campo que tem vindo a crescer. O advento das técnicas da biologia molecular tem permitido a caracterização molecular de algumas das disfunções da homeostase do cálcio e é de esperar um diagnóstico fisiopatológico cada vez mais rigoroso dessas disfunções. Com o avanço dos conhecimentos nesta área que não cessa de aumentar temos cada vez maiores capacidades para fazer diagnósticos e é cada vez mais difícil interpretar com rigor os correspondentes quadros metabólicos. A análise ou síntese de sistemas complexos é a actividade mais nobre dos engenheiros que lhes permite desenhar pontes, diques, barcos, aviões ou automóveis. Com o aparecimento de computadores de médio ou grande porte foi – lhes possível utilizar descrições matemáticas não só para desenhar sistemas como ainda para interpretar eventuais falhas na sua operação. Essas descrições matemáticas consistem numa sequência de operações realizadas num computador segundo um “programa informático” que receberam a designação genérica de modelos, por analogia com as famosas leis (equações) da física que foram deduzidas a partir de um certo número de postulados e que permitem representar matematicamente processos físicos. As famosas leis de Newton são talvez os exemplos mais famosos de “modelos” de sistemas físicos. A introdução de modelos matemáticos em biologia e particularmente em medicina só se deu recentemente.MÉTODOS No trabalho que aqui se apresenta construiu - se um modelo simplificado da homeostase do cálcio destinado ao cálculo de variáveis observáveis (concentrações de cálcio, fósforo, PTH e calcitriol) de modo a poderem comparar-se valores calculados com valores observados. A escolha dos componentes do modelo foi determinada pela nossa experiência clínica e pela informação fisiopatológica e clínica publicada. Houve a preocupação de construir o modelo de forma modular de modo a ser possível a sua expansão sem grandes transformações na descrição matemática (e informática) já existente. Na sua fase actual o modelo não pode ser usado como instrumento de diagnóstico. É antes uma ferramenta destinada a esclarecer “em princípio” mecanismos fisiopatológicos. Usou – se o modelo para simular um certo número de observações publicadas e para exemplificar a sua eventual aplicação clínica na simulação de situações hipotéticas e na análise de possíveis mecanismos fisiopatológicos responsáveis por situações de hipo ou hipercalcémias. Simultaneamente fez – se uma análise dos dados acumulados relativos a doentes vistos no Serviço de Endocrinologia do Instituto Português de Oncologia de Francisco Gentil – Centro Regional Oncológico de Lisboa, S.A. CONCLUSÕES Numa população de 894 doentes com patologias variadas do Instituto Português de Oncologia de Lisboa os valores da calcémia tiveram uma distribuição normal unimodal com uma média de 9.56 mg/dl, e um erro padrão de 0.41 mg/dl. Estas observações sugerem que a calcémia está sujeita a regulação. A partir dos resultados publicados em que o metabolismo do cálcio foi perturbado por infusões de cálcio, calcitriol ou PTH, de estudos bioquímicos e fisiológicos sobre os mecanismos de acção de factores controladores da calcémia e do estudo do comportamento de órgãos alvo (paratiroideias, intestino, osso e rim) foi possível construir um modelo matemático de parâmetros concentrados do sistema de regulação da calcémia. As expressões analíticas usadas foram baseadas na cinética enzimática de modo a que os seus parâmetros tivessem um significado físico ou fisiológico simples. O modelo revelou apreciável robustez e flexibilidade. É estável quando não perturbado e transita entre estados estacionários quando perturbado. Na sua forma actual gera simulações que reproduzem satisfatoriamente um número apreciável de dados experimentais colhidos em doentes. Isto não significa que possa ser usado como instrumento de diagnóstico aplicável a doentes individuais. O desenho do modelo comporta a adição posterior de novas relações quando surgirem situações para as quais se revele insuficiente. A utilização exaustiva do modelo permitiu explicitar aspectos do metabolismo do cálcio que ou não estão contidas na sua formulação actual – o aparecimento de hipertrofia ou de adenomas das paratiroideias e as alterações na estrutura óssea , a participação de outros factores controladores – magnésio, ou estão insuficientemente descritas – alterações do metabolismo do fósforo nos hipoparatiroidismos. A análise dos dados relativos aos doentes do Serviço de Endocrinologia do IPO permitiu o início da caracterização dos tipos de patologia que representam e de possíveis mecanismos fisiopatológicos subjacentes. Estas observações são o ponto de partida para análises futuras. São exemplos das relações encontradas: a distribuição dos doentes por dois grandes grupos conforme a calcémia é determinada pelas concentrações circulantes de PTH ou estas são determinadas pela calcémia; a distribuição sazonal das concentrações de Vit. D25. no sangue; a correlação negativa entre estas e as concentrações de PTH no sangue. Também foi possível extrair a cinética do controlo da PTH sobre a síntese de calcitriol. O estudo dos níveis circulantes de PTH no pós-operatório imediato de doentes paratiroidectomizados permitiu determinar as suas taxas de degradação metabólica. O modelo permitiu simular as relações Ca/PTH no sangue, Ca/Fracção excretada da carga tubular, Ca/P no sangue para valores normais ou altos de Ca. Foram feitas simulações de situações fisiopatológicas (em “doentes virtuais”): infusões crónicas de cálcio, PTH e calcitriol; alterações no comportamento de receptores. Estas simulações correspondem a experiências que não podem ser realizadas em humanos. São exemplos da utilização do modelo na exploração de possíveis mecanismos fisiopatológicos através da observação de resultados quantitativos inacessíveis à intuição. O modelo foi útil em duas fases do trabalho: Primeiro, durante a sua síntese implicou uma escolha criticamente selectiva de informação, sua análise quantitativa e processamento, uma explicitação rigorosa (analítica) das relações funcionais entre os controladores e as variáveis e da sua integração numa estrutura global; Segundo, a simulação de situações experimentais ou clínicas (dados do Serviço de Endocrinologia do IPO) em doentes obrigou a explicitar raciocínios fisiopatológicos habitualmente formulados em bases puramente intuitivas. Esta prática revelou comportamentos óbvios após as simulações – acção reduzida das infusões PTH (simulação de hiperparatiroidismos primários) enquanto não há inibição total da respectiva secreção, necessidade de aumento da massa secretora da paratiroideia nas insuficiências renais avançadas, etc. A síntese e utilização do modelo não implicaram uma preparação matemática avançada e foram possíveis mercê da disponibilidade de “software” interactivo especificamente desenhado para a simulação de sistemas dinâmicos em que os programas se escrevem em inglês usando a simbologia simples da álgebra elementar. A função nobre de modelos desta natureza é semelhante à dos modelos usados pelos físicos desde o século XVII: permitir explicações de carácter geral funcionando como uma ferramenta intelectual para manipulação de conceitos e para a realização de “experiências pensadas” (“thought experiments”) respeitando certos princípios físicos (princípios de conservação) que estabelecem as fronteiras da realidade. -------ABSTRACT: Calcium blood levels are remarkably constant despite great variations in calcium daily intake, intestinal absorption and renal excretion. The regulation of the calcium concentration in the blood is achieved by a complex system that includes several controller factors (mainly the serum levels of calcium, phosphorus, parathyroid hormone (PTH) and calcitriol but also of steroid hormones, ions such as magnesium and other hormonal factors) and several target organs (parathyroid glands, bone, kidney and intestine). The functional response to the controlling factors obeys a variety of kinetics. The precipitation of calcium salts is a simple phase transition in which organic molecules may provide nucleation centres or inhibit the process. The combination of a controller factor with its receptor located in the cell membrane (for peptides or ions) or in the nucleus (for steroid hormones) is only the first step of a biochemical chain that introduces a huge amplification in the response. To this great variability of response we have to add the times of response that vary from minutes to weeks. It is possible to “observe” (measure) with great accuracy in biological fluids (blood, urine, faeces, etc.) the most important factors intervening in the calcium regulation (calcium, phosphorus, PTH and calcitriol). The response of the system to acute infusions of the controlling factors has also been studied. Using molecular biology techniques it has been possible to characterize some calcium homeostasis dysfunctions and better physiopathological diagnosis are expected. With the increasingly new knowledge in this area we have better capacity to diagnose but it is harder to explain correctly the underlying metabolic mechanisms. The analysis or synthesis of complex systems is the noble activity of engineers that enables them to draw bridges, dams, boats, airplanes or cars. With the availability of medium-large frame computers it was possible to use mathematical descriptions not only to draw systems but also to explain flaws in its operations. These mathematical descriptions are generally known as models by analogy with the laws (equations) of physics that allow the mathematical description of physical processes. In practice it is not possible to find general solutions for the mathematical descriptions of complex systems but (numeric) computations for specific situations can be obtained with digital computers. The introduction of mathematical models in biology and particularly in medicine is a recent event. METHODS In this thesis a simplified model of calcium homeostasis was built that enables the computation of observable variables (concentrations of calcium, phosphorus, PTH and calcitriol) and allows the comparison between the simulation values and observed values. The choice of the model’s components was made according to our clinical experience and to the published clinical and physiopathological data. The model has a modular design that allows future expansions with minor alterations in its structure. In its present form the model cannot be used for diagnosis. It is a tool designed to enlighten physiopathological processes. To exemplify its possible clinical application in the simulation of hypothetical situations and in the analysis of possible mechanisms responsible for hypo or hypercalcemias the model was used to simulate a certain number of published observations. An analysis of clinical and laboratory data from the Endocrinology Department of the Portuguese Cancer Institute (I.P.O.F.G.-C.R.O.L.,S.A.) is also presented. CONCLUSIONS In a population of 188 patients without an identifiable disease of the calcium metabolism at the Portuguese Cancer Institute the calcemia levels had a unimodal distribution with an average of 9.56 mg/dL and a S.E.M of 0.41 mg/dL. This observation confirms that serum calcium is regulated. Using published data; in which calcium metabolism was disrupted by calcium, PTH or calcitriol infusions; from biochemical and physiological studies of the action of controller factors on the calcemia; in which the response of target organs (parathyroid glands, intestine, bone, kidney) was studied it was possible to build a mathematical model of concentrated parameters of the calcium homeostasis. Analytical expressions used were based on enzymatic kinetics. The model is flexible and robust. It is stable when not disturbed and changes between steady states when disturbed. In its present form it provides simulations that reproduce closely a number of experimental clinical data. This does not mean that it can be used as a diagnostic tool for individual patients. The exhaustive utilisation of the model revealed the need of future expansions to include aspects of the calcium metabolism not included in its present form –hypertrophy or adenomas of the parathyroid glands, bone structure changes, participation of other controller factors such as magnesium – or insufficiently described – phosphate metabolism in hypoparathyroidism. The analysis of the data collected from the I.P.O.’s Endocrinology Department allowed the initial characterization of the different pathologies represented and of their possible physiopathological mechanisms. These observations are a starting point for future analysis. As examples of the relations found were: the distribution of patients in two groups according to the dependency of calcium by PTH levels or PTH levels by calcium concentration; the seasonal distribution of the serum concentrations of D25; its negative correlation with PTH concentration. It was also possible to extract the kinetics of the control of the synthesis of calcitriol by PTH. The analysis of immediate post-surgical levels of PTH in parathyroidectomized patients allowed the determination of its metabolic clearance. The model also allowed the simulation of the relations between Ca/PTH in blood, serum Ca/Fraction of tubular load excreted and Ca/P in blood for normal and high values of calcium. Simulations were made of pathological situations (in “virtual patients”): chronic infusions of calcium, PTH and calcitriol; changes in the characteristics of receptors. These simulations are not possible in real persons. They are an example of the use of this model in exploring possible mechanisms of disease through the observation of quantitative results not accessible to simple intuition. This model was useful in two phases: Firstly, its construction required a careful choice of data, its quantitative analysis and processing, an analytical description of the relations between controller factors and variables and their integration in a global structure. Secondly, the simulation of experimental or clinical (I.P.O.’s Endocrinology Department) data implied testing physiopathological explanations that previously were based on intuition. The construction and utilisation of the model didn’t demand an advanced mathematical preparation since user-friendly interactive software was used. This software was specifically designed for the simulation of dynamic systems. The programs are written in English using elementary algebra symbols. The essential function of this type of models is identical to that of those used by physicists since the XVII century which describe quantitatively natural processes and are an intellectual tool for the manipulation of concepts and the performance of “thought experiments” based in certain physical principles (conservation principles) that are the frontiers of reality.------------------RESUMÉE: Les concentrations circulantes de calcium sont constantes même pendant des variations de l’absorption intestinale et de l’élimination rénale de cet élément. La régulation de la calcémie est un système complexe qui comprend plusieurs éléments contrôleurs (la calcémie, la phosphorémie, les concentrations circulantes de l’hormone parathyroïdienne (PTH) e du calcitriol et d’autres comme les hormones stéroïdes ou des ions comme le magnésium) et plusieurs organes (glandes parathyroïdiennes, l’os, le rein et l’intestin). Les réponses de ces organes sont variées. Dans le cas plus simple, la cristallisation des sels de calcium correspond à un changement de phase dans lequel y participent des molécules organiques que la débutent, l’accélèrent ou l’inhibent. Généralement la combinaison d’un élément contrôleur avec leur récepteur de membrane (pour les peptides ou les ions) ou intracellulaire (pour les hormones stéroïdes) n’est que le premier pas d’une chaîne biochimique qu’introduit une grande amplification de la réponse. A cette variété de réponses correspondent des grandes différences des temps de réponses qu’y vont des minuits a semaines. Il est possible « observer » (mesurer) dans les fluides biologiques (sang, urine, fèces, etc.) les éléments plus importants du système de régulation de la calcémie (calcium, phosphate, PTH et le calcitriol) et les administrer en expérimentes aigus. Cette possibilité est visible dans la littérature publiée dans ce domaine qui est en croissance permanente. L’avenir des techniques de biologie moléculaire a permis caractériser des nombreuses dysfonctions de la régulation de la calcémie et on attend un diagnostique physiopathologique de ces dysfonctions chaque fois plus rigoureuses. Les connaissances dans ce domaine s’agrandissent et on a de plus de capacités pour faire des diagnostiques et il est chaque fois plus difficile les interpréter. L’analyse ou synthèse de systèmes complexes est l’activité plus noble des ingénieurs qui les permit dessiner des ponts, bateaux, avions ou automobiles. Avec des ordinateurs de médium ou grand port il les est possible utiliser descriptions mathématiques pour dessiner les systèmes et interpréter des éventuelles fautes d’opération. Ces descriptions mathématiques sont une séquence d’opérations réalisées dans un ordinateur selon « un programme informatique » qui ont reçu la désignation générique de modèles, pour analogie avec les équations de la physique qui ont été déduits d’un nombre de postulées et qu’ont permit représenter des processus physiques en équations mathématiques. Les fameuses équations de Newton sont peut-être les exemples plus connus des systèmes physiques. L’introduction des modèles mathématiques en biologie et en particulier en médecine est un évènement récent. Dans ce travaille, on a construit un modèle simplifié de l’homéostasie du calcium pour calculer les variables observables (concentrations de calcium, phosphate, PTH et calcitriol) pour les comparer. Les choix des components a été déterminés par notre expérience clinique et par l’information physiopathologique et clinique publiée. Le modèle a été construit de façon modulaire ce que permit leur postérieur expansion sans des grandes altérations dans la description mathématique et informatique déjà existante. Dans cette forme le modèle ne peut être utilisé comme un instrument de diagnostique. Il est un outil pour éclairer la physiopathologie. Le modèle a été utilisé pour simuler un certain nombre d’observations publiées et pour exemplifier leur possible utilisation clinique dans la simulation des hypothèses et de la physiopathologie des situations d’hypo ou hypercalcémie. On a fait une analyse des éléments des procès cliniques des malades observées dans le Service d’Endocrinologie de l’IPOFG-CROL, SA. Dans une population de 894 malades avec des différentes pathologies les valeurs de calcémie on une distribution uni modale avec une Médie de 9.56 mg/dL et une erreur standard de 0.41 mg/dL. Ces observations suggèrent que la calcémie soit sujette de régulation. En utilisant des résultats de travaux publiés dans lesquels le métabolisme du calcium a été changé par des infusions de calcium, calcitriol ou PTH, des études biochimiques et physiologiques sur des mécanismes d’action des éléments contrôleurs de la calcémie et de l’étude du comportement des organes cible (parathyroïdes, intestin, rein, os), il a été possible de construire un modèle mathématique de paramètres concentrés du système de régulation de la calcémie. Les expressions analytiques utilisées ont été basées sur la cinétique enzymatique de façon à que les paramètres aient eu une signification physique ou biologique. Le modèle est stable quand il n’est pas perturbé et transit entre états stationnaires quand il est sujet a des perturbations. A ce moment il fait des simulations qui reproduisent de façon satisfaisant un nombre d’observations expérimentales. La construction du modèle permit l’addiction de nouvelles relations dans les cas ou il est insuffisant. L’utilisation exhaustive du modèle a permit expliciter des aspects du métabolisme du calcium qui y ne sont pas compris – l’hyperplasie ou la formation des adénomes des parathyroïdes, les altérations de la structure des os, la participation d’outres éléments régulateurs (magnésium), ou sont insuffisamment décrites – les altérations du métabolisme des phosphates dans l’hypoparathyroidism. L’analyse de l’information des malades du Service d’Endocrinologie a permit caractériser les pathologies représentées et leurs possibles mécanismes physiopathologiques. Ces observations sont le point de départ pour les analyses futures. Sont des exemples des relations trouvées: la distribution des malades par deux groupes: ceux dans lequel la calcémie est déterminée par la PTH ou ceux dans lesquels la PTH est déterminée par la calcémie; la distribution sazonale de la concentration de la vitamine D; la corrélation négative entre la vitamine D et la PTH. On a eu la possibilité de déduire la cinétique de control de la PTH sur la synthèse du calcitriol. L’étude des niveaux circulants de PTH sur des sujets parathyroidectomisées a permit déduire leur taux de dégradation métabolique. Le modèle a permit simuler les relations Ca/PTH dans le sang, Ca/fraction éliminée par le rein, Ca/P dans le sang pour des valeurs normales ou hautes de calcium. On a fait des simulations de situations physiopathologiques (dans “malades virtuelles”): Infusions chroniques de calcium, PTH ou calcitriol; altérations des récepteurs. Ces simulations ne peuvent pas être réalisées dans les humains. Sont des exemples d’utilisation du modèle dans l’exploration des possibles mécanismes de la physiopathologie en observant des résultats quantitatifs inaccessibles à l’intuition. Le modèle a été utile pendant deux étapes des travaux: La première, dans sa construction on a choisi l’information disponible, son analyse quantitative, l’explicitation rigoureuse (analytique) des relations fonctionnelles entre les contrôleurs et les variables et sa intégration dans une structure globale. La deuxième, la simulation de situations expérimentales ou cliniques (du Service d’Endocrinologie) a obligé d’expliciter des raisonnements physiopathologiques généralement formulés utilisant l’intuition. Cette pratique a montré des comportements – action réduite des infusions de PTH (jusqu’à l’inhibition totale de leur respective sécrétion), nécessité d’augmenter la masse sécréteuse de la parathyroïde dans les insuffisants rénales, etc. La synthèse et utilisation du modèle n’ont pas besoin d’une formation avancée en mathématique et sont possibles grâce à un programme interactif qui a été conçu pour la simulation des systèmes dynamiques dans lesquels le programme se construit en anglais en utilisant la symbolique élémentaire de l’algèbre. La fonction noble de ces modèles est semblable à celles des physiques du XVII siècle: Permettre établir explications générales en fonctionnant comme un outil intellectuel pour manipuler des concepts et pour la réalisation d’expérimentes pensées en respectant certains principes de la physique (principe de la conservation) qu’établissent les frontières de la réalité.

Functional significance of adenosine in carotid body chemosensory activity in control and chronically hypoxic animals

ABSTRACT: Carotid bodies (CB) are peripheral chemoreceptor organs sensing changes in arterial blood O2, CO2 and pH levels. Hypoxia and acidosis or hypercapnia activates CB chemoreceptor cells, which respond by releasing neurotransmitters in order to increase the action potential frequency in their sensory nerve, the carotid sinus nerve (CSN). CSN activity is integrated in the brainstem to induce a fan of cardiorespiratory reflex responses, aimed at normalising the altered blood gases. Exogenously applied adenosine (Ado) increases CSN chemosensory activity inducing hyperventilation through activation of A2 receptors. The importance of the effects of adenosine in chemoreception was reinforced by data obtained in humans, in which the intravenous infusion of Ado causes hyperventilation and dyspnoea, an effect that has been attributed to the activation of CB because Ado does not cross blood-brain barrier and because the ventilatory effects are higher the closer to the CB it is injected. The present work was performed in order to establish the functional significance of adenosine in chemoreception at the carotid body in control and chronically hypoxic rats. To achieve this objective we investigated: 1) The release of adenosine from a rat carotid body in vitro preparation in response to moderate hypoxia and the specificity of this release. We also investigated the metabolic pathways of adenosine production and release in the organ in normoxia and hypoxia; 2) The modulation of adenosine/ATP release from rat carotid body chemoreceptor cells by nicotinic ACh receptors; 3) The effects of caffeine on peripheral control of breathing and the identity of the adenosine receptors involved in adenosine and caffeine effects on carotid body chemoreceptors; 4) The interactions between dopamine D2 receptors and adenosine A2B receptors that modulate the release of catecholamines (CA) from the rat carotid body; 5) The effect of chronic caffeine intake i.e. the continuous blockage of adenosine receptors thereby simulating a caffeine dependence, on the carotid body function in control and chronically hypoxic rats. The methodologies used in this work included: molecular biology techniques (e.g. immunocytochemistry and western-blot), biochemical techniques (e.g. neurotransmitter quantification by HPLC, bioluminescence and radioisotopic methods), electrophysiological techniques (e.g. action potential recordings) and ventilatory recordings using whole-body plethysmography. It was observed that: 1) CB chemoreceptor sensitivity to hypoxia could be related to its low threshold for the release of adenosine because moderate acute hypoxia (10% O2) increased adenosine concentrations released from the CB by 44% but was not a strong enough stimulus to evoke adenosine release from superior cervical ganglia and arterial tissue; 2) Acetylcholine (ACh) modulates the release of adenosine/5’-adenosine triphosphate (ATP) from CB in moderate hypoxia through the activation of nicotinic receptors with α4 and ß2 receptor subunits, suggesting that the excitatory role of ACh in chemosensory activity includes indirect activation of purinergic receptors by adenosine and ATP, which strongly supports the hypothesis that ATP/adenosine are important mediators in chemotransduction; 3) adenosine increases the release of CA from rat CB chemoreceptor cells via A2B receptors; 4) the inhibitory effects of caffeine on CB chemoreceptors are mediated by antagonism of postsynaptic A2A and presynaptic A2B adenosine receptors indicating that chemosensory activity elicited by hypoxia is controlled by adenosine; 5) The release of CA from rat CB chemoreceptor cells is modulated by adenosine through an antagonistic interaction between A2B and D2 receptors, for the first time herein described; 6) chronic caffeine treatment did not significantly alter the basal function of CB in normoxic rats assessed as the dynamics of their neurotransmitters, dopamine, ATP and adenosine, and the CSN chemosensory activity. In contrast, the responses to hypoxia in these animals were facilitated by chronic caffeine intake because it increased the ventilatory response, slightly increased CSN chemosensory activity and increased dopamine (DA) and ATP release; 7) In comparison with normoxic rats, chronically hypoxic rats exhibited an increase in several parameters: ventilatory hypoxic response; basal and hypoxic CSN activity; tyrosine hydroxylase expression, CA content, synthesis and release; basal and hypoxic adenosine release; and in contrast a normal basal release and diminished hypoxia-induced ATP release; 8) Finally, in contrast to chronically hypoxic rats, chronic caffeine treatment did not alter the basal CSN chemosensory activity. Nevertheless, the responses to mild and intense hypoxia, and hypercapnia, were diminished. This inhibitory effect of chronic caffeine in CB output is compensated by central mechanisms, as the minute ventilation parameter in basal conditions and in response to acute hypoxic challenges remained unaltered in rats exposed to chronic hypoxia. We can conclude that adenosine both in acute and chronically hypoxic conditions have an excitatory role in the CB chemosensory activity, acting directly on adenosine A2A receptors present postsynaptically in CSN, and acting presynaptically via A2B receptors controlling the release of dopamine in chemoreceptor cells. We suggest that A2B -D2 adenosine / dopamine interactions at the CB could explain the increase in CA metabolism caused by chronic ingestion of caffeine during chronic hypoxia. It was also concluded that adenosine facilitates CB sensitisation to chronic hypoxia although this effect is further compensated at the central nervous system.-------- RESUMO: Os corpos carotídeos (CB) são pequenos orgãos emparelhados localizados na bifurcação da artéria carótida comum. Estes órgãos são sensíveis a variações na PaO2, PaCO2, pH e temperatura sendo responsáveis pela hiperventilação que ocorre em resposta à hipóxia, contribuindo também para a hiperventilação que acompanha a acidose metabólica e respiratória. As células quimiorreceptoras (tipo I ou glómicas) do corpo carotídeo respondem às variações de gases arteriais libertando neurotransmissores que activam as terminações sensitivas do nervo do seio carotídeo (CSN) conduzindo a informação ao centro respiratório central. Está ainda por esclarecer qual o neurotransmissor (ou os neurotransmissores) responsável pela sinalização hipóxica no corpo carotídeo. A adenosina é um neurotransmissor excitatório no CB que aumenta a actividade eléctrica do CSN induzindo a hiperventilação através da activação de receptores A2. A importância destes efeitos da adenosina na quimiorrecepção, descritos em ratos e gatos, foi reforçada por resultados obtidos em voluntários saudáveis onde a infusão intravenosa de adenosina em induz hiperventilação e dispneia, efeito atribuído a uma activação do CB uma vez que a adenosina não atravessa a barreira hemato-encefálica e o efeito é quanto maior quanto mais perto do CB for a administração de adenosina. O presente trabalho foi realizado com o objectivo de esclarecer qual o significado funcional da adenosina na quimiorrecepção no CB em animais controlo e em animais submetidos a hipoxia crónica mantida. Para alcançar este objectivo investigou-se: 1) o efeito da hipóxia moderada sobre a libertação de adenosina numa preparação in vitro de CB e a especificidade desta mesma libertação comparativamente com outros tecidos não quimiossensitivos, assim como as vias metabólicas de produção e libertação de adenosina no CB em normoxia e hipóxia; 2) a modulação da libertação de adenosina/ATP das células quimiorreceptoras do CB por receptores nicotínicos de ACh; 3) os efeitos da cafeína no controlo periférico da ventilação e a identidade dos receptores de adenosina envolvidos nos efeitos da adenosina e da cafeína nos quimiorreceptores do CB; 4) as interacções entre os receptores D2 de dopamina e os receptores A2B de adenosina que modulam a libertação de catecolaminas (CA) no CB de rato e; 5) o efeito da ingestão crónica de cafeína, isto é, o contínuo bloqueio e dos receptores de adenosina, simulando assim o consumo crónico da cafeína, tal como ocorre na população humana mundial e principalmente no ocidente, na função do corpo carotídeo em ratos controlo e em ratos submetidos a hipoxia crónica. Os métodos utilizados neste trabalho incluíram: técnicas de biologia molecular como imunocitoquímica e western-blot; técnicas bioquímicas, tais como a quantificação de neurotransmissores por HPLC, bioluminescência e métodos radioisotópicos; técnicas electrofisiológicas como o registro de potenciais eléctricos do nervo do seio carotídeo in vitro; e registros ventilatórios in vivo em animais não anestesiados e em livre movimento (pletismografia). Observou-se que: 1) a especificidade dos quimiorreceptores do CB como sensores de O2 está correlacionada com o baixo limiar de libertação de adenosina em resposta à hipóxia dado que a libertação de adenosina do CB aumenta 44% em resposta a uma hipóxia moderada (10% O2), que no entanto não é um estímulo suficientemente intenso para evocar a libertação de adenosina do gânglio cervical superior ou do tecido arterial. Observou-se também que aproximadamente 40% da adenosina libertada pelo CB provém do catabolismo extracelular do ATP quer em normóxia quer em hipóxia moderada, sendo que PO2 reduzidas induzem a libertação de adenosina via activação do sistema de transporte equilibrativo ENT1. 2) a ACh modula a libertação de adenosina /ATP do CB em resposta à hipoxia moderada sugerindo que o papel excitatório da ACh na actividade quimiossensora inclui a activação indirecta de receptores purinérgicos pela adenosina e ATP, indicando que a adenosina e o ATP poderiam actuar como mediadores importantes no processo de quimiotransducção uma vez que: a) a activação dos receptores nicotínicos de ACh no CB em normóxia estimula a libertação de adenosina (max 36%) provindo aparentemente da degradação extracelular do ATP. b) a caracterização farmacológica dos receptores nicotínicos de ACh envolvidos na estimulação da libertação de adenosina do CB revelou que os receptores nicotínicos de ACh envolvidos são constituídos por subunidades α4ß2. 3) a adenosina modula a libertação de catecolaminas das células quimiorreceptoras do CB através de receptores de adenosina A2B dado que: a)a cafeína, um antagonista não selectivo dos receptores de adenosina, inibiu a libertação de CA quer em normóxia quer em resposta a estímulos de baixa intensidade sendo ineficaz na libertação induzida por estímulos de intensidade superior; b) o DPCPX e do MRS1754 mimetizaram os efeitos da cafeína no CB sendo o SCH58621 incapaz de induzir a libertação de CA indicando que os efeitos da cafeína seriam mediados por receptores A2B de adenosina cuja presença nas células quimiorreceptoras do CB demonstramos por imunocitoquímica. 4) a aplicação aguda de cafeína inibiu em 52% a actividade quimiossensora do CSN induzida pela hipóxia sendo este efeito mediado respectivamente por receptores de adenosina A2A pós-sinápticos e A2B pré-sinápticos indicando que a actividade quimiossensora induzida pela hipóxia é controlada pela adenosina. 5) existe uma interacção entre os receptores A2B e D2 que controla a libertação de CA do corpo carotídeo de rato uma vez que: a) os antagonistas dos receptores D2, domperidona e haloperidol, aumentaram a libertação basal e evocada de CA das células quimiorreceptoras confirmando a presença de autorreceptores D2 no CB de rato que controlam a libertação de CA através de um mecanismo de feed-back negativo. b) o sulpiride, um antagonista dos receptores D2, aumentou a libertação de CA das células quimiorreceptoras revertendo o efeito inibitório da cafeína sobre esta mesma libertação; c) a propilnorapomorfina, um agonista D2 inibiu a libertação basal e evocada de CA sendo este efeito revertido pela NECA, um agonista dos receptores A2B. O facto de a NECA potenciar o efeito do haloperidol na libertação de CA sugere que a interacção entre os receptores D2 e A2B poderia também ocorrer ao nível de segundos mensageiros, como o cAMP. 6) a ingestão crónica de cafeína em ratos controlo (normóxicos) não alterou significativamente a função basal do CB medida como a dinâmica dos seus neurotransmissores, dopamina, ATP e adenosina e como actividade quimiossensora do CSN. Contrariamente aos efeitos basais, a ingestão crónica de cafeína facilitou a resposta à hipóxia, dado que aumentou o efeito no volume minuto respiratórioapresentando-se também uma clara tendência para aumentar a actividade quimiossensora do CSN e aumentar a libertação de ATP e dopamina.7) após um período de 15 dias de hipóxia crónica era evidente o fenómeno de aclimatização dado que as respostas ventilatórias à hipóxia se encontram aumentadas, assim como a actividade quimiossensora do CSN basal e induzida pela hipóxia. As alterações observadas no metabolismo da dopamina, assim como na libertação basal de dopamina e de adenosina poderiam contribuir para a aclimatização durante a hipoxia crónica. A libertação aumentada de adenosina em resposta à hipóxia aguda em ratos hipóxicos crónicos sugere um papel da adenosina na manutenção/aumento das respostas ventilatórias à hipóxia aguda durante a hipóxia crónica. Observou-se também que a libertação de ATP induzida pela hipóxia aguda se encontra diminuída em hipóxia crónica, contudo a ingestão crónica de cafeína reverteu este efeito para valores similares aos valores controlo, sugerindo que a adenosina possa modular a libertação de ATP em hipóxia crónica. 8) a ingestão crónica de cafeína em ratos hipóxicos crónicos induziu o aumento do metabolismo de CA no CB, medido como expressão de tirosina hidroxilase, conteúdo, síntese e libertação de CA. 9) a ingestão crónica de cafeína não provocou quaisquer alterações na actividade quimiossensora do CSN em ratos hipóxicos crónicos no entanto, as respostas do CSN à hipóxia aguda intensa e moderada e à hipercapnia encontram-se diminuídas. Este efeito inibitório que provém da ingestão crónica de cafeína parece ser compensado ao nível dos quimiorreceptores centrais dado que os parâmetros ventilatórios em condições basais e em resposta à hipoxia aguda não se encontram modificados em ratos expostos durante 15 dias a uma atmosfera hipóxica. Resumindo podemos assim concluir que a adenosina quer em situações de hipoxia aguda quer em condições de hipoxia crónica tem um papel excitatório na actividade quimiossensora do CB actuando directamente nos receptores A2A presentes pós-sinapticamente no CSN, assim como facilitando a libertação de dopamina pré-sinapticamente via receptores A2B presentes nas células quimiorreceptoras. A interacção negativa entre os receptores A2B e D2 observadas nas células quimiorreceptoras do CB poderia explicar o aumento do metabolismo de CA observado após a ingestão crónica de cafeína em animais hipóxicos. Conclui-se ainda que durante a aclimatização à hipóxia a acção inibitória da cafeína, em termos de resposta ventilatória, mediada pelos quimiorreceptores periféricos é compensada pelos efeitos excitatórios desta xantina ao nível do quimiorreceptores centrais.------- RESUMEN Los cuerpos carotídeos (CB) son órganos emparejados que están localizados en la bifurcación de la arteria carótida común. Estos órganos son sensibles a variaciones en la PaO2, en la PaCO2, pH y temperatura siendo responsables de la hiperventilación que ocurre en respuesta a la hipoxia, contribuyendo también a la hiperventilación que acompaña a la acidosis metabólica y respiratoria. Las células quimiorreceptoras (tipo I o glómicas) del cuerpo carotídeo responden a las variaciones de gases arteriales liberando neurotransmissores que activan las terminaciones sensitivas del nervio del seno carotídeo (CSN) llevando la información al centro respiratorio central. Todavía esta por clarificar cual el neurotransmisor (o neurotransmisores) responsable por la señalización hipóxica en el CB. La adenosina es un neurotransmisor excitatório en el CB ya que aumenta la actividad del CSN e induce la hiperventilación a través de la activación de receptores de adenosina del subtipo A2. La importancia de estos efectos de la adenosina en la quimiorrecepción, descritos en ratas y gatos, ha sido fuertemente reforzada por resultados obtenidos en voluntarios sanos en los que la infusión intravenosa de adenosina induce hiperventilación y dispnea, efectos estés que han sido atribuidos a una activación del CB ya que la adenosina no cruza la barrera hemato-encefalica y el efecto es tanto más grande cuanto más cercana del CB es la administración. Este trabajo ha sido realizado con el objetivo de investigar cual el significado funcional de la adenosina en la quimiorrecepción en el CB en animales controlo y en animales sometidos a hipoxia crónica sostenida. Para alcanzar este objetivo se ha estudiado: 1) el efecto de la hipoxia moderada en la liberación de adenosina en una preparación in vitro de CB y la especificidad de esta liberación en comparación con otros tejidos no-quimiosensitivos, así como las vías metabólicas de producción y liberación de adenosina del órgano en normoxia y hipoxia; 2) la modulación de la liberación de adenosina/ATP de las células quimiorreceptoras del CB por receptores nicotínicos de ACh; 3) los efectos de la cafeína en el controlo periférico de la ventilación y la identidad de los receptores de adenosina involucrados en los efectos de la adenosina y cafeína en los quimiorreceptores del CB; 4) las interacciones entre los receptores D2 de dopamina y los receptores A2B de adenosina que modulan la liberación de catecolaminas (CA) en el CB de rata y; 5) el efecto de la ingestión crónica de cafeína, es decir, el bloqueo sostenido de los receptores de adenosina, simulando la dependencia de cafeína observada en la populación mundial del occidente, en la función del CB en ratas controlo y sometidas a hipoxia crónica sostenida. Los métodos utilizados en este trabajo incluirán: técnicas de biología molecular como imunocitoquímica y western-blot; técnicas bioquímicas, tales como la cuantificación de neurotransmissores por HPLC, bioluminescencia y métodos radioisotópicos; técnicas electrofisiológicas como el registro de potenciales eléctricos del nervio do seno carotídeo in vitro; y registros ventilatórios in vivo en animales no anestesiados y en libre movimiento (pletismografia). Se observó que: 1) la sensibilidad de los quimiorreceptores de CB esta correlacionada con un bajo umbral de liberación de adenosina en respuesta a la hipoxia ya que en respuesta a una hipoxia moderada (10% O2) la liberación de adenosina en el CB aumenta un 44%, sin embargo esta PaO2 no es un estimulo suficientemente fuerte para inducir la liberación de adenosina del ganglio cervical superior o del tejido arterial; se observó también que aproximadamente 40% de la adenosina liberada del CB proviene del catabolismo extracelular del ATP en normoxia y en hipoxia moderada, y que bajas PO2 inducen la liberación de adenosina vía activación del sistema de transporte equilibrativo ENT1. 2) la ACh modula la liberación de adenosina /ATP del CB en respuesta a la hipóxia moderada lo que sugiere que el papel excitatório de la ACh en la actividad quimiosensora incluye la activación indirecta de receptores purinérgicos por la adenosina y el ATP, indicando que la adenosina y el ATP pueden actuar como mediadores importantes en el proceso de quimiotransducción ya que: a) la activación de los receptores nicotínicos de ACh en el CB en normoxia estimula la liberación de adenosina (max 36%) que aparentemente proviene de la degradación extracelular del ATP. Se observó también que este aumento de adenosina en el CB en hipoxia ha sido antagonizado parcialmente por antagonistas de estos mismos receptores; b) la caracterización farmacológica de los receptores nicotínicos de ACh involucrados en la estimulación de la liberación de adenosina del CB ha revelado que los receptores nicotínicos de ACh involucrados son constituidos por sub-unidades α4ß2. 3) la adenosina modula la liberación de CA de las células quimiorreceptoras del CB a través de receptores de adenosina A2B ya que: a) la cafeína, un antagonista no selectivo de los receptores de adenosina, ha inhibido la liberación de CA en normoxia y en respuesta a estímulos de baja intensidad siendo ineficaz en la liberación inducida por estímulos de intensidad superior; b) el DPCPX y el MRS1754 ha mimetizado los efectos de la cafeína en el CB y el SCH58621 ha sido incapaz de inducir la liberación de CA lo que sugiere que los efectos de la cafeína son mediados por receptores A2B de adenosina que están localizados pré-sinapticamente en las células quimiorreceptoras del CB. 4) la aplicación aguda de cafeína ha inhibido en 52% la actividad quimiosensora del CSN inducida por la hipoxia siendo este efecto mediado respectivamente por receptores de adenosina A2A pós-sinápticos y A2B pré-sinápticos lo que indica que la actividad quimiosensora inducida por la hipoxia es controlada por la adenosina. 5) existe una interacción entre los receptores A2B y D2 que controla la liberación de CA del CB de rata ya que: a) el sulpiride, un antagonista de los receptores D2, ha aumentado la liberación de CA de las células quimiorreceptoras revertiendo el efecto inhibitorio de la cafeína sobre esta misma liberación; b) los antagonistas de los receptores D2, domperidona y haloperidol, han aumentado la liberación basal e evocada de CA de las células quimiorreceptoras confirmando la presencia de autorreceptores D2 en el CB de rata que controlan la liberación de CA a través de un mecanismo de feed-back negativo; c) la propilnorapomorfina, un agonista D2, ha inhibido la liberación basal e evocada de CA sendo este efecto revertido por la NECA, un agonista de los receptores A2B. Ya que la NECA potencia el efecto del haloperidol en la liberación de CA la interacción entre los D2 y A2B puede también ocurrir al nivel de segundos mensajeros, como el cAMP. 6) la ingestión crónica de cafeína en ratas controlo (normóxicas) no ha cambiado significativamente la función basal del CB medida como la dinámica de sus neurotransmisores, dopamina, ATP y adenosina y como actividad quimiosensora del CSN. Al revés de lo que pasa con los efectos básales, la ingestión crónica de cafeína facilitó la respuesta a la hipóxia, ya que ha aumentado la respuesta ventilatória medida como volumen minuto presentando también una clara tendencia para aumentar la actividad quimiosensora del CSN y aumentar la liberación de ATP y dopamina. 7. Después de un período de 15 días de hipoxia crónica se puede observar el fenómeno de climatización ya que las respuestas ventilatórias a la hipoxia están aumentadas, así como la actividad quimiosensora del CSN basal e inducida por la hipoxia. Los cambios observados en el metabolismo de la dopamina, así como en la liberación basal de dopamina y de adenosina podrían contribuir para la climatización en hipoxia crónica. El aumento en la liberación de adenosina en respuesta a la hipoxia aguda en ratas sometidas a hipoxia crónica sugiere un papel para la adenosina en el mantenimiento/aumento de las respuestas ventilatórias a la hipoxia aguda en hipoxia crónica sostenida. Se ha observado también que la liberación de ATP inducida por la hipoxia aguda está disminuida en hipoxia crónica y que la ingestión crónica de cafeína reverte este efecto para valores similares a los valores controlo, sugiriendo que la adenosina podría modular la liberación de ATP en hipoxia crónica. 8. la ingestión crónica de cafeína ha inducido el aumento del metabolismo de CA en el CB en ratas hipóxicas crónicas, medido como expresión de la tirosina hidroxilase, contenido, síntesis y liberación de CA. 9. la ingestión crónica de cafeína no ha inducido cambios en la actividad quimiosensora del CSN en ratas hipóxicas crónicas sin embargo las respuestas do CSN a una hipoxia intensa y moderada y a la hipercapnia están disminuidas. Este efecto inhibitorio que es debido a la ingestión crónica de cafeína es compensado al nivel de los quimiorreceptores centrales ya que los parámetros ventilatórios en condiciones básales y en respuesta a la hipoxia aguda no están modificados en ratas expuestas durante 15 días a una atmósfera hipóxica. Resumiendo se puede concluir que la adenosina en situaciones de hipoxia aguda así como en hipoxia crónica tiene un papel excitatório en la actividad quimiosensora del CB actuando directamente en los receptores A2A localizados pós-sinapticamente en el CSN, así como controlando la liberación de dopamina pré-sinaptica vía receptores A2B localizados en las células quimiorreceptoras. Las interacciones entre los receptores A2B y D2 observadas en las células quimiorreceptoras del CB podrían explicar el aumento del metabolismo de CA observado después de la ingestión crónica de cafeína en animales hipóxicos. Por fin, pero no menos importante se puede concluir que durante la climatización a la hipoxia la acción inhibitoria de la cafeína, medida como respuesta ventilatória, mediada por los quimiorreceptores periféricos es compensada por los efectos excitatórios de esta xantina al nivel de los quimiorreceptores centrales.

Post-transcriptional regulation of HFE gene expression

Thesis presented to obtain the Ph.D. degree in Biology (Molecular Genetics), by the Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia.

Optimização da focagem de feixes laser em tecidos biológicos: desenvolvimento de um simulador óptico

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Biomédica

Cultura de tecidos de Hypericum foliosum e análise de genes associados à biossíntese de hipericinas

Tese apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obtenção do grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

Matrizes de policaprolactona e quitosano para aplicação em engenharia de tecidos

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Biomédica

Transplante hepático sequencial com preservação da veia cava inferior (técnica de "Duplo Piggyback") : uma técnica original

RESUMO:Desde a declaração de Bethesda em 1983, a transplantação hepática é considerada um processo válido e aceite na prática clínica para muitos doentes com doença hepática terminal, relativamente aos quais não houvesse outra alternativa terapêutica. Em 1991, por proposta de Holmgren, professor de genética, o cirurgião sueco Bo Ericzon realizou em Huntingdon (Estocolmo) o primeiro transplante hepático num doente PAF (Polineuropatia Amilloidótica Familiar), esperando que a substituição do fígado pudesse frenar a evolução da doença. Nesta doença hereditária autossómica dominante, o fígado, apesar de estrutural e funcionalmente normal, produz uma proteína anormal (TTR Met30) responsável pela doença. A partir de então, a transplantação hepática passou a ser a única terapêutica eficaz para estes doentes. Portugal é o país do mundo com mais doentes PAF, tendo sido o médico neurologista português Corino de Andrade quem, em 1951, identificou e descreveu este tipo particular de polineuropatia hereditária, também conhecida por doença de Andrade. Com o início da transplantação hepática programada em Setembro de 1992, o primeiro doente transplantado hepático em Portugal, no Hospital Curry Cabral, foi um doente PAF. Desde logo se percebeu que a competição nas listas de espera em Portugal, entre doentes hepáticos crónicos e doentes PAF viria a ser um problema clínico e ético difícil de compatibilizar. Em 1995, Linhares Furtado, em Coimbra, realizou o primeiro transplante dum fígado dum doente PAF num doente com doença hepática metastática, ficando este tipo de transplante conhecido como transplante sequencial ou “em dominó”. Fê-lo no pressuposto de que o fígado PAF, funcional e estruturalmente normal, apesar de produzir a proteína mutada causadora da doença neurológica, pudesse garantir ao receptor um período razoável de vida livre de sintomas, tal como acontece na história natural desta doença congénita, cujas manifestações clínicas apenas se observam na idade adulta. A técnica cirúrgica mais adequada para transplantar o doente PAF é a técnica de “piggyback”, na qual a hepatectomia é feita mantendo a veia cava do doente, podendo o transplante ser feito sem recorrer a bypass extracorporal. Antes de 2001, para fazerem o transplante sequencial, os diferentes centros alteraram a técnica de hepatectomia no doente PAF, ressecando a cava com o fígado conforme a técnica clássica, recorrendo ao bypass extracorporal. No nosso centro imaginámos e concebemos uma técnica original, com recurso a enxertos venosos, que permitisse ao doente PAF submeter-se à mesma técnica de hepatectomia no transplante, quer ele viesse a ser ou não dador. Essa técnica, por nós utilizada pela primeira vez a nível mundial em 2001, ficou conhecida por Transplante Sequencial em Duplo Piggyback. Este trabalho teve como objectivo procurar saber se a técnica por nós imaginada, concebida e utilizada era reprodutível, se não prejudicava o doente PAF dador e se oferecia ao receptor hepático as mesmas garantias do fígado de cadáver. A nossa série de transplantes realizados em doentes PAF é a maior a nível mundial, assim como o é o número de transplantes sequenciais de fígado. Recorrendo à nossa base de dados desde Setembro de 1992 até Novembro de 2008 procedeu-se à verificação das hipóteses anteriormente enunciadas. Com base na experiência por nós introduzida, a técnica foi reproduzida com êxito em vários centros internacionais de referência, que por si provaram a sua reprodutibilidade. Este sucesso encontra-se publicado por diversos grupos de transplantação hepática a nível mundial. Observámos na nossa série que a sobrevivência dos doentes PAF que foram dadores é ligeiramente superior àqueles que o não foram, embora sem atingir significância estatística. Contudo, quando se analisaram, apenas, estes doentes após a introdução do transplante sequencial no nosso centro, observa-se que existe uma melhor sobrevida nos doentes PAF dadores (sobrevida aos 5 anos de 87% versus 71%, p=0,047).Relativamente aos receptores observámos que existe um benefício a curto prazo em termos de morbi-mortalidade (menor hemorragia peri-operatória) e a longo prazo alguns grupos de doentes apresentaram diferenças de sobrevida, embora sem atingir significância estatística, facto este que pode estar relacionado com a dimensão das amostras parcelares analisadas. Estes grupos são os doentes com cirrose a vírus da hepatite C e os doentes com doença hepática maligna primitiva dentro dos critérios de Milão. Fora do âmbito deste trabalho ficou um aspecto relevante que é a recidiva da doença PAF nos receptores de fígado sequencial e o seu impacto no longo prazo. Em conclusão, o presente trabalho permite afirmar que a técnica por nós introduzida pela primeira vez a nível mundial é exequível e reprodutível e é segura para os doentes dadores de fígado PAF, que não vêem a sua técnica cirúrgica alterada pelo facto de o serem. Os receptores não são, por sua vez, prejudicados por receberem um fígado PAF, havendo mesmo benefícios no pós-operatório imediato e, eventualmente, alguns grupos específicos de doentes podem mesmo ser beneficiados.---------ABSTRACT: Ever since Bethesda statement in 1983, Liver Transplantation has been accepted as a clinical therapeutic procedure for many patients with advanced hepatic failure Holmgren, professor of genetics, suggested that one could expect that transplanting a new liver could lead to improve progressive neurological symptoms of Familial Amyloidotic Polyneuropathy (PAF). Bo Ericzon, the transplant surgeon at Huddinge Hospital in Stockholm, Sweden, did in 1991 the first Liver Transplant on a FAP patient. FAP is an inherited autosomal dominant neurologic disease in which the liver, otherwise structural an functionally normal, produces more than 90% of an abnormal protein (TTR Met30) whose deposits are responsible for symptoms. Liver Transplantation is currently the only efficient therapy available for FAP patients. Portugal is the country in the world where FAP is most prevalent. The Portuguese neurologist Corino de Andrade was the first to recognize in 1951 this particular form of inherited polyneuropathy, which is also known by the name of Andrade disease. Liver Transplantation started as a program in Portugal in September 1992. The first patient transplanted in Lisbon, Hospital Curry Cabral, was a FAP patient. From the beginning we did realize that competition among waiting lists of FAP and Hepatic patients would come to be a complex problem we had to deal with, on clinical and ethical grounds. There was one possible way-out. FAP livers could be of some utility themselves as liver grafts. Anatomically and functionally normal, except for the inherited abnormal trace, those livers could possibly be transplanted in selected hepatic patients. Nevertheless the FAP liver carried with it the ability to produce the mutant TTR protein. One could expect, considering the natural history of the disease that several decades would lapse before the recipient could suffer symptomatic neurologic disease, if at all. In Coimbra, Portugal, Linhares Furtado performed in 1995 the first transplant of a FAP liver to a patient with metastatic malignant disease, as a sequential or “domino” transplant. FAP Liver Transplant patients, because of some dysautonomic labiality and unexpected reactions when they are subjected to surgery, take special advantage when piggyback technique is used for hepatectomy. This technique leaves the vena cava of the patient undisturbed, so that return of blood to the heart is affected minimally, so that veno-venous extracorporeal bypass will not be necessary. The advantages of piggyback technique could not be afforded to FAP patients who became donors for sequential liver transplantation, before we did introduce our liver reconstruction technique in 2001. The hepatectomy took the vena cava together with the liver, which is the classical technique, and the use of extracorporeal veno-venous bypass was of necessity in most cases. The reconstruction technique we developed in our center and used for the first time in the world in 2001 consists in applying venous grafts to the supra-hepatic ostia of piggyback resected FAP livers so that the organ could be grafted to a hepatic patient whose liver was itself resected with preservation of the vena cava. This is the double piggyback sequential transplant of the liver. It is the objective of this thesis to evaluate the results of this technique that we did introduce, first of all that it is reliable and reproducible, secondly that the FAP donor is not subjected to any additional harm during the procedure, and finally that the recipient has the same prospects of a successful transplant as if the liver was collected from a cadaver donor. Our series of liver transplantation on FAP patients and sequential liver transplants represent both the largest experience in the world. To achieve the analysis of the questions mentioned above, we did refer to our data-base from September 1992 to November 2008. The reconstructive technique that we did introduce is feasible: it could be done with success in every case ion our series. It is also reproducible. It has been adopted by many international centers of reference that did mention it in their own publications. We do refer to our data-base in what concerns the safety for the FAP donor.Five years survival of FAP transplanted patients that have been donors (n=190) has been slightly superior to those who were not (n=77), with no statistical significance. However, if we consider five year survival of FAP transplanted patients after the beginning of sequential transplant program in our center, survival is better among those patients whose liver was used as a transplant (87% survival versus 71%, p=0.047). In what concerns recipients of FAP livers: Some short-term benefit of less perioperative morbi-mortality mainly less hemorrhage. In some groups of particular pathologies, there is a strong suggestion of better survival, however the scarcity of numbers make the differences not statistically significant. Patients with cirrhosis HVC (83% versus73%) and patients with primitive hepatic cancer within Milan criteria (survival of 70% versus 58%) are good examples. There is one relevant problem we left beyond discussion in the present work: this is the long-term impact of possible recurrence of FAP symptoms among recipients of sequential transplants. In Conclusion: The reconstruction technique that we did develop and introduce is consistently workable and reproducible. It is safe for FAP donors with the advantage that removal of vena cava can be avoided. Hepatic patients transplanted with those livers suffer no disadvantages and have the benefit of less hemorrhage. There is also a suggestion that survival could be better in cirrhosis HVC and primary liver cancer patients.