mRNA genotyping by gold nanoprobes

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Biotecnologia

Fontes de fósforo total e o estado trófico de albufeiras em Portugal continental

O estudo realizado incidiu sobre 260 albufeiras, identificadas em diferentes fontes de informação e localizadas em Portugal continental. De entre as massas de água identificadas procedeu-se à classificação do estado trófico de 92 albufeiras, todas para as quais se dispõe de dados de qualidade da água para o efeito. Destas, de acordo com o critério de classificação adoptado em Portugal, 60 foram classificadas como eutróficas, em resultado principalmente das concentrações de fósforo total. Após a delimitação das bacias drenantes de 194 albufeiras, foram implementadas metodologias de quantificação de fósforo total afluente a essas massas de água. Com recurso a um modelo de balanço de massas foram simuladas as concentrações de fósforo total em 80 albufeiras, tendo sido considerados adequados os resultados obtidos em 42 albufeiras. Com base nos resultados obtidos concluiu-se que as metodologias de quantificação de fósforo total de origem urbana e de origem difusa são adequadas ao desenvolvimento de estudos de planeamento e de identificação das principais fontes de fósforo total, em águas doces superficiais.

Reproducing stone monument photosynthetic-based colonization under laboratory conditions

Science of the total environment 405(2008) 278-285

O e-learning na manutenção industrial uma proposta de e-learning aplicada à manutenção produtiva total

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia e Gestão Industrial

The role of detoxification in the mosquito Anopheles gambiae response to Plasmodium infection

Rute C. Félix PALAVRAS-CHAVE: Malária, mosquito vector, Anopheles gambiae, parasita, Plasmodium berghei, infecção, enzimas de detoxificação, citocromos P450, tubulinas A malária, uma das doenças mais devastadoras que ocorrem em África é causada por um parasita do género Plasmodium e é transmitida aos humanos por mosquitos vectores do género Anopheles durante a refeição de sangue. Apesar da resposta do mosquito à infecção por Plasmodium ter vindo a ser intensamente estudada nos últimos anos, as interacções entre o mosquito vector e o parasita são muito complexas e, estão longe de serem completamente compreendidas. Este estudo tem como objectivo principal contribuir para o conhecimento da resposta do mosquito à infecção por Plasmodium, focando-se no papel das enzimas de detoxificação. Para atingir este objectivo realizouse uma análise transcriptómica com microarrays, com o intuito de identificar alterações de transcrição de enzimas de detoxificação no mosquito Anopheles gambiae em resposta à infecção por Plasmodium. Esta análise permitiu identificar alterações na expressão de 254 genes de destoxificação no estômago e corpo gordo de A. gambiae durante a invasão do intestino médio pelos oocinetos e durante a libertação dos esporozoítos do oocisto. Os resultados mostraram que a invasão do intestino médio pelos oocinetos causou alterações num maior número de genes em ambos os tecidos estudados, sendo o intestino médio do mosquito o tecido mais afectado nas duas fases da infecção do parasita. De todos os genes de destoxificação com expressão alterada, as tubulinas e os citocromos P450 destacaram-se e foram escolhidos para continuar o estudo. As tubulinas foram seleccionadas porque estão associadas à invasão do epitélio do intestino médio e a sua função na resposta à invasão do Plasmodium ainda não está bem definida. Os citocromos P450 foram seleccionados porque já foram descritos como tendo a expressão alterada em resposta ao Plasmodium e a outras infecções. Para identificar e caracterizar o papel das tubulinas durante a infecção pelo parasita e a sua possível associação com os citocromos P450 foi utilizado o silenciamento génico por RNA de interferência e a injecção de inibidores químicos de tubulinas. O silenciamento e co-silenciamento das tubulinas causaram um aumento da taxa e intensidade da infecção. No entanto, apesar de o aumento ser consistente não foi significativo. Por outro lado, a injecção de paclitaxel, um inibidor de tubulinas, aumentou significativamente a taxa e intensidade da infecção, fortalecendo a hipótese do envolvimento das tubulinas na resposta à infecção por Plasmodium. Este trabalho também mostrou que o co-silenciamento da tubulina A e tubulina B e a injecção do inibidor de tubulinas colchicine causam alterações significativas na expressão da CYP6Z2, sendo este proposto como um possível elo de ligação entre as tubulinas e os citocromos P450. Finalmente, uma análise comparativa foi realizada para estudar as regiões promotoras dos citocromos P450: CYP6M2 e o CYP6Z1. Este estudo obteve novos dados sobre compostos que activam estes citocromos e quais os possíveis factores de transcrição envolvidos. Dos diferentes estímulos utilizados, a exposição a insecticidas e a bactérias foram os que mais afectaram estes citocromos. O conjunto total das diferentes abordagens utilizadas neste trabalho contribuiu para aumentar o conhecimento do papel das enzimas de destoxificação durante a passagem do parasita da malária pelo mosquito vector.

Efeito dos factores do hospedeiro e parasitários na susceptibilidade à Malária e gravidade da Doença

A malária é considerada como a doença parasitária mais séria em humanos, infectando cerca de 5 a 10% da população mundial, estimando-se entre 300 a 600 milhões de casos e mais de dois milhões de mortes, anualmente. Apesar da severidade da doença, a compreensão da variabilidade da resposta do hospedeiro à infecção (traduzida desde a infecção silenciosa até formas crónicas da doença, passando por quadros clínicos potencialmente fatais), continua a ser um dos grandes desafios da investigação médica. Vários factores genéticos parasitários ou do hospedeiro, estado imune e níveis de exposição, contribuem para esta variabilidade, mas a sua importância relativa para a carga total da doença tem sido pouco estudada. Entre outros, é possível salientar como fontes importantes de variabilidade na susceptibilidade à malária e gravidade da doença, factores intrínsecos ao hospedeiro tais como polimorfismos genéticos relacionados com as células sanguíneas e factores parasitários como a composição da(s) população(ões) parasitária(s) presentes na infecção. Factores do hospedeiro humano relacionados com as células sanguíneas (drepanocitose e deficiência na glucose-6-fosfato desidrogenase - G6PD) têm sido tradicionalmente estudados e relacionados com a gravidade da malária causada por Plasmodium falciparum. Relativamente às populações parasitárias, das cinco espécies que infectam humanos, P. falciparum continua a ser responsável pela malária grave, apesar de muito recentemente alguma gravidade ser atribuída a Plasmodium vivax. Sabe-se que nas mesmas áreas outras espécies coexistem em muito maior prevalência, contrariando o que se pensava há algum tempo. Apesar de poucos estudos terem focado o tema das infecções mistas, existem alguns relatos de que eventuais interacções entre as diferentes espécies presentes simultaneamente no mesmo hospedeiro poderem afectar a susceptibilidade à doença. Com o objectivo geral de avaliar o efeito e a contribuição destes factores na susceptibilidade e gravidade da malária, analisando e comparando três grupos (estudo de caso-controlo) doentes com malária grave (MG), doentes com malária não-complicada (Mnc) e indivíduos infectados assintomáticos (IA), realizámos em Angola de 2007 a 2010, um estudo em sete das 18 províncias com distintos níveis de endemicidade. Foram obtidas 1.416 amostras de sangue periférico de 1.198 indivíduos assintomáticos e 218 doentes. O DNA obtido a partir destes isolados foi utilizado para detecção da presença de variantes genéticos relacionados com os eritrócitos (drepanocitose – análise do gene HBB, deficiência G6PD – análise do gene G6PD, antigénio Duffy-análise do gene DARC) e identificação das espécies de Plasmodium presentes, através de nested-PCR mediante a amplificação dos genes que codificam a subunidade menor do RNA ribossomal. Os resultados demonstraram prevalências superiores às anteriormente descritas em relação às seguintes espécies parasitárias: P. falciparum 98,2% vs 92,0% e Plasmodium malariae 10,7% vs 1,0% e inferior em relação a P. vivax 2,5% vs 7,0%. Foi reconfirmada a presença de Plasmodium ovale (descrita anteriormente), mas não publicada em documentos oficiais e relatada pela primeira vez em Angola a presença de infecções mistas (duplas e triplas) (15,7%) e de infecção por P. vivax em indivíduos Duffy-negativos (dados publicados). Relativamente aos polimorfismos relacionados com os genes HBB e G6PD e provável associação com a protecção à malária, os nossos resultados confirmam a associação do traço falciforme (heterozigotia HbS), com a protecção à doença (OR = 0,30; IC 95% 0,18-0,49; p<0,001). Contudo, não foi encontrada, quer nos indivíduos hemizigóticos, quer nos heterozigóticos para o alelo G6PD (A-) nenhuma evidência para a protecção a malária (MG e Mnc) (OR = 1,69; IC 95% 0,91-3,13; p=0,096). Os resultados desta investigação requerem um estudo mais aprofundado, com uma dimensão amostral maior, necessário à confirmação da nossa observação.

A fenomenologia enquanto lugar total da vida: diálogo poético-amoroso entre Merleau-Ponty e alguns pensadores e artistas

Dissertação de doutoramento em Filosofia Contemporânea

The merger of Total Portugal and CEPSA

A Work Project, presented as part of the requirements for the Award of a Masters Degree in Management from the NOVA – School of Business and Economics

Sofisticação e disponibilidade total dos serviços On-Line da segurança social

Dissertação apresentada como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Gestão de Informação

Revision based total semantics for extended normal logic programs

Dissertação para obtenção do Grau de Doutor em Matemática - Lógica e Fundamentos da Matemática

Seroprevalência e subtipos do vírus da hepatite C circulantes em indivíduos co-infectados com o vírus da imunodeficiência humana

Mundialmente, estima-se que 40 milhões de pessoas estejam infectadas com VIH, 5 milhões das quais cronicamente infectadas com VHC. A co-infecção com VIH aumenta a taxa de persistência do VHC, acelera a velocidade de progressão da doença hepática e reduz significativamente a resposta à terapia do VHC. O VHC possui extensa diversidade genética, sendo classificado em seis genótipos e cerca de 90 subtipos com padrões epidemiológicos e resposta à terapia distintos. Tendo isto presente e devido a serem limitados os dados relativos aos genótipos e subtipos do VHC circulantes em Portugal e ainda ao facto de os utilizadores de drogas injectáveis (UDIs) serem um grupo de risco importante para a co-infecção por VIH e VHC, realizámos um estudo retrospectivo para determinar a prevalência da infecção por VHC e a distribuição de subtipos deste vírus num grupo de UDIs infectados com VIH. Amostras de plasma de 66 indivíduos (1998-2001) foram testadas para anticorpos anti-VHC (ensaio imunoenzimático) e RNA do VHC (amplificação da 5’UTR por RT-PCR). Para identificar os subtipos de VHC e detectar recombinantes, as amostras com RNA viral detectável foram sujeitas a amplificação, sequenciação e análise filogenética de sequências nucleotídicas parciais para C/E1 e NS5B. Encontrámos que 86,4% dos indivíduos possuíam anticorpos anti-VHC, 93,0% dos quais com infecção activa. Todas as amostras, exceptuando duas, com RNA viral detectável originaram amplicões para C/E1 e NS5B. A análise filogenética permitiu incluir as estirpes de VHC nos subtipos 1a (43,8%), 1b (3,6%), 2a (1,8%), 3a (21,1%), 4a (8,8%) e 4d (15,8%), revelando um padrão epidemiológico semelhante ao dos UDIs de outros países do Sul da Europa. Apenas uma amostra apresentou discordância entre os subtipos das duas regiões (4d para C/E1 e 4a para NS5B) sugerindo um potencial recombinante intragenótipo. No total, os subtipos 1a, 4a e 4d do VHC são responsáveis por 68,4% das infecções nos UDIs infectados com VIH analisados. Considerando que apenas 20-30% dos doentes positivos para VIH e co-infectados com os genótipos 1 e 4 respondem à terapia do VHC e que ocorre transmissão do VHC dos UDIs para a população em geral, são prioritários estudos alargados de vigilância epidemiológica e implementação de estratégias de prevenção para controlar ambos os vírus neste grupo de risco.

Functional and structural studies of two enzymes: membrane bound kinase and Z-DNA/Z-RNA-binding protein

Dissertação para obtenção do Grau de Doutor em Sistemas de Bioengenharia

Efeitos da laqueação proximal dos vasos curtos e da fundoplicatura total sobre a microcirculação do fundo gástrico : estudo microvascular em cobaias

RESUMO: A operação de Nissen, por laparoscopia, é considerada a cirurgia antirefluxo mais adequada por ser a que melhor replica a fisiologia normal da válvula gastresofágica na maioria dos doentes com sintomas típicos de doença do refluxo gastresofágico (DRGE). São critérios técnicos o encerramento seguro dos pilares do diafragma e a criação de fundoplicatura completa (360 graus), curta (inferior a dois centímetros), lassa e sem tensão – desiderando para o qual a laqueação proximal dos vasos curtos gástricos é crucial. Realizei a operação de Nissen, por laparoscopia, em sessenta mulheres e quarenta homens com DRGE, sem mortalidade operatória, no Serviço de Cirurgia 6 do Hospital dos Capuchos, CHLC, EPE. Os cem doentes apresentavam média etária de 46 anos e queixas, com tempo de evolução entre 1 e 43 anos, de pirose (90%), regurgitação (80%), azia (73%), epigastralgias (54%). A endoscopia alta revelou esofagite de grau Savary-Miller 0-I (62%), II (23%), III (8%), IV (7%); hérnia de deslizamento (71%), hérnia paraesofágica (8%), sem hérnia (21%); a pHmetria de 24h diagnosticou padrão misto (38%), levantado (20%), deitado (20%), inconclusiva (22%) e a manometria diagnosticou EEI hipotónico (35%), peristálise esofágica normal (88%), hipomotilidade ligeira (5%) e foi omissa (7%). Hérnia hiatal, esofagite grave, ineficácia do controlo sintomático com inibidor da bomba de protões e desejo de descontinuidade terapêutica constituíram as indicações para tratamento cirúrgico. Por celioscopia, efetuei laqueação dos vasos curtos gástricos (70%), cruroplastia e fundoplicatura total (seda 2/0), curta (dimensão média 1,5-2 cm), lassa, sem tensão e sem calibração intraoperatória do esófago. A fundoplicatura de Nissen laparoscópica mostrou-se segura e eficaz no tratamento da DRGE. A sua idoneidade foi ainda comprovada pela normalização da pHmetria de 24 horas e da manometria pós-operatórias, com significado estatístico, num grupo de catorze voluntários assintomáticos. Em catamnese com recuo médio 30,7 meses 94% dos indivíduos persistem assintomáticos. Interrogando-me acerca das repercussões desta operação sobre a microcirculação do fundo gástrico coloquei, como premissa, a possibilidade de na operação de Nissen a laqueação dos vasos curtos poder induzir modificação no diâmetro arteriolar da parede do fundo gástrico. Para pesquisar a influência da laqueação dos vasos curtos gástricos e da fundoplicatura total sobre o calibre arteriolar da parede do estômago no cárdia, no fundo e na região dos vasos curtos gástricos, idealizei um Projeto de investigação experimental em cobaias. O Projeto foi desenvolvido no Centro de Investigação do Departamento de Anatomia da FCM-UNL. Para a sua realização obtive autorização da Comissão Científica e Pedagógica da FCM-UNL, requeri a acreditação como investigador à Direção Geral de Veterinária e, por recorrer à utilização de animais, submeti-o à Comissão de Ética da FCM-UNL, que o aprovou por unanimidade. Para limitar o número de animais utilizados ao mínimo necessário, calculei, por método estatístico, a quantidade de cobaias necessárias. Subdividindo-as num grupo de ensaio (GE), onde realizei a operação de Nissen, e num grupo de controlo (GC), onde apenas procedi a tração gástrica, defini e apliquei protocolos de anestesia, de cirurgia e de eutanásia, segundo os princípios dos 3R – Replacement, Reduction, Refinement da técnica de experimentação humana de Russell e Burch (1959) – uma estrutura ética amplamente aceite para a realização de experimentação científica humanizada com animais. A utilização das técnicas de estudo angiomorfológico permitiu-me analisar e descrever a anatomia normal, a vascularização arterial macroscópica, a microangioarquitetura, por microscopia eletrónica de varrimento de moldes de corrosão vascular, e a histologia da parede do estômago da cobaia. Procedi, também, à definição dos critérios morfológicos que considerei suscetíveis de validação deste modelo animal para o estudo proposto. Por razões académicas, foi necessário abreviar o Projeto encurtando, em cerca de dois anos, o prazo disponível para conclusão do estudo. Apreciando-o com o Gabinete de Análise Epidemiológica e Estatística do Centro de Investigação do CHLC, EPE, optou-se, perante a escassez de elementos após já terem sido recrutados 46 animais, por uma amostra, suplementar, de dimensão de conveniência de oito cobaias (quatro em cada grupo), condicionada pelo limite temporal universitário e pelo respeito pela dignidade dos animais. Neste subgrupo procedi, por microscopia eletrónica de varrimento, à medição dos calibres arteriolares nos moldes vasculares do cárdia, do fundo e da zona dos vasos curtos gástricos tanto no GC como no GE efetuando 469 medições no primeiro e 461 no último. Os dados foram enviados ao Centro de Investigação do CHLC, EPE que procedeu à sua análise estatística (ANOVA). A referida análise revelou que as arteríolas do plexo mucoso e as do plexo submucoso do cárdia, do fundo e da região dos vasos curtos gástricos, mostraram aumento de calibre no GE. O aumento foi, estatisticamente, significativo por ser superior a 50% do calibre do GC. Nos vasos curtos, a diferença foi mais pequena, mas persistiu sendo, estatisticamente, significativa. Os vasos retos dilataram na base, na sua emergência do plexo seroso, apenas no fundo gástrico. Na cobaia a operação de Nissen – fundoplicatura total com laqueação dos vasos curtos gástricos –, provocou vasodilatação arteriolar do fundo gástrico. Considero que essa vasodilatação constituiu acomodação à modificação introduzida e infiro que o mesmo possa acontecer no ser humano. Admito, assim, que também ocorra vasodilatação no ser humano, na sequência da laqueação dos vasos curtos gástricos, pela analogia microvascular entre as duas espécies e que essa vasodilatação corresponda, igualmente, a um mecanismo de adaptação arteriolar visando, por exemplo, suprir a perda incorrida pela laqueação. A associação experimental entre laqueação dos vasos curtos gástricos e realização de fundoplicatura total, que exerce aumento inerente de pressão sobre a JEG, não só não provocou défice da microcirculação do esófago distal ou do estômago proximal como desencadeou um mecanismo de vasodilatação fúndica que reforça o conceito de segurança da operação de Nissen para tratamento da DRGE. -------------- ABSTRACT: The laparoscopic Nissen operation is considered to be the most appropriate antirefluxsurgery because it suitably replicates the standard physiology of the gastroesophageal valve in most patients with typical symptoms of gastroesophageal reflux disease (GERD). The technical criteria includes the safe shutdown of the diafragmatic crura(cruroplasty) and the creation of a complete fundoplication (360 degrees), short (lesser than two inches), floppy and without tension – a goal for which the proximal ligation of the gastric short vessels is crucial. The laparoscopic Nissen operation was performed in sixty women and forty men with GERD, without any operative mortality, at the Surgical Department of the Hospital dos Capuchos, CHLC, EPE. The one hundred patients, averaged 46 years old, complained of heartburn (90%), regurgitation (80%) and upper abdominal pain (54 %). The endoscopy process revealed Savary-Miller esophagitis of grade 0-I (62%), II (23%), III (8%), IV (7%), sliding hernia (71%), paraesophageal hernia (8%) or no herniation (21%). The pHmetry/24h diagnosed mixed pattern (38%), raised (20%), lying (20%) or inconclusive (22%). The manometry diagnosed hypotensive LES (35%), normal esophageal peristalsis (88%), mild hypomotility (5%) and was absent (7%). Hiatal hernia, severe esophagitis, ineffective symptomatic control with proton pump inhibitor and request for treatment discontinuation were the signs for surgical action. A laparoscopic ligation of short gastric vessels (70%), cruroplasty and fundoplication (silk 2/0), short (average size 1.5–2 cm) and floppy, without tension and without intraoperative calibration of the esophagus were thus performed. The laparoscopic Nissen fundoplication behaved safe and effective in treating GERD. In a group of 14 asymptomatic volunteers its reputation was confirmed with statistical significance by normalization of postoperative pHmetry/24h and manometry. 94% of the individuals remained asymptomatic up to 30.7 months (average) in the follow-up. Interrogating myself about the impact of this operation on the microcirculation of the gastric fundus I put premised on the possibility of the ligation of the short gastric vessels in the Nissen procedure can induce changes in the arteriolar diameter in the Wall of the gastric fundus. To explore the influence of ligation of the short gastric vessels and the fundoplication at the arteriolar caliber of the cardia, the fundus and the region of the short vessels of the gastric wall, I designed a project of experimental research in guinea pigs with two interdependent components: one veterinary and another technical where I applied angiomorphological studies. The project was developed at the Research Centre of the Department of Anatomy FCMUNL. For its accomplishment I got permission from the Scientific and Pedagogical Committee of the FCM-UNL, I requested for accreditation as a researcher at the General Directorate of Veterinary and, by resorting to the use of animals I submitted it to the Ethics Committee of the FCM-UNL, which approved it unanimously. The guinea pigs were divided into two experimental groups: an experimental group (EG), in which the Nissen procedure was performed and a control group (CG) in which only a gastric traction was done. Protocols of anesthesia, surgery and euthanasia were applied according to the 3Rs – Replacement, Reduction, Refinement of the technique of human experimentation of Burch and Russell (1959) – a widely accepted ethical framework for conducting scientific experiments using animals humanely. Using histological and angiomorphological techniques, I performed the analysis and the description of the normal, macro and microvascular, anatomy of the guinea pig stomach and I defined the morphological criteria that I considered susceptible for validation of this animal model for the proposed study. By means of scanning electron microscopy I measured the arteriolar calibers of the vascular casts of the cardia, of the fundus and of the short gastric vessels in both CG and EG, making 469 measurements in the former and 461 in the latter. The data were sent to the Research Center of the CHLC which conducted the statistical analysis (ANOVA). The data were sent to the Centre for Research of the CHLC, EPE which proceeded to statistical analysis (ANOVA). This analysis revealed that the arterioles plexus of the mucosal and submucosal plexus of the cardia, fundus and region of the short gastric vessels, showed increased caliber in EG. The increase was statistically significant for being greater than 50% CG gauge. In the short gastric vessels, the difference was smaller, but persisted and statistically significant. Straight vessels were dilated at the base, on its emergence of the plexus serous only in the fundus. In the guinea pig, the Nissen procedure - complete fundoplication with ligation of the short gastric vessels - caused arteriolar vasodilation on the gastric fundus. I believe that this vasodilation constituted some accommodation to the modification introduced and infer that the same might happen in humans. I admit therefore that vasodilation also occurs in humans following the ligation of the short gastric vessels by microvascular analogy between the two species and that this vasodilation corresponds also to na adaptation mechanism arteriolar, for example, to compensate the loss incurred by ligation. The association of experimental ligation of the short gastric vessels with conducting complete fundoplication, which exerts increased pressure on the EGJ, not only did not cause a microcirculation deficit of the distal esophagus or proximal stomach as triggered a mechanism of fundic vasodilation which reinforces the security concept of the Nissen procedure for treatment of GERD.

Six Sigma aplicado ao erro total das medições laboratoriais

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia e Gestão Industrial