The Role of Small RNAs and Ribonucleases in the Control of Gene Expression in Salmonella Typhimurium

Dissertation presented to obtain the Ph.D degree in Biology

Implementação do método de suspensão quantitativa para avaliar a actividade bactericida de desinfectantes químicos, de acordo com a Norma Europeia EN 1040

As bactérias patogénicas presentes nos sistemas de processamento de alimentos podem ser potencialmente causadoras de doenças alimentares graves, quando sobrevivem à acção bactericida de desinfectantes. Esta acção depende da eficácia das substâncias activas que fazem parte da formulação do desinfectante e das condições ambientais onde se processa a interacção desinfectante – bactéria, sendo ainda específica para cada estirpe bacteriana. Este trabalho teve, como propósito, a implementação de um método que permita avaliar, in vitro, a eficácia bactericida de desinfectantes comerciais contra estirpes bacterianas que são potencialmente causadores de doenças de origem alimentar. A eficácia do desinfectante foi avaliada seguindo a Norma EN1040 e aplicando o método de diluição-neutralização. Para além das estirpes recomendadas naquele documento normativo, nomeadamente, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus, foram também utilizadas Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Salmonella Typhimurium e Listeria monocytogenes. Os desinfectantes foram seleccionados com base nas suas formulações, tendo sido escolhidos desinfectantes cujos princípios activos são, respectivamente: tensioactivos aniónicos; alcalis inorgânicos; hidrocloreto de biguanida polimérica; álcool etoxilado ou cloreto benzalcónio. Foram seleccionados como neutralizantes: tampão fosfato, tiosulfato de sódio, gema de ovo fresca e polisorbato 80 com histidina. Após cada ensaio, o número de bactérias sobreviventes foi obtido pelo cálculo da redução logarítmica decimal, a partir do número de unidades formadoras de colónia presentes em cada placa. A eficácia do desinfectante, na inactivação de cada estirpe alvo, foi classificada numa escala de redução logarítmica à qual 5 log corresponde a redução mínima aceitável do número de colónias quando o tempo de contacto é de 5 minutos, e a temperatura do ensaio é 20ºC. Conclui-se que o método de diluição-neutralização é sensível para todas as estirpes testadas. A gema de ovo fresca revelou ser o melhor neutralizante para desinfectantes contendo tensioactivos aniónicos, enquanto o tampão fosfato é mais adequado para neutralizar desinfectantes contendo alcalis inorgânicos. Porém, nenhum dos neutralizantes testados mostrou ser adequado para os desinfectantes contendo cloreto de benzalcónio ou hidrocloreto biguanida polimérica ou álcool etoxilado. Conclui-se também que as condições laboratoriais implementadas são as adequadas para testar a acção bactericida de desinfectantes utilizados em sistemas de processamento de alimentos.

The Crystal Structure of the Escherichia coli Autoinducer-2 Processing Protein LsrF

PLOS ONE, 4(8):ARTe6820

Sistemas bacterianos no estudo da bioactivação do antirectroviral nevirapina

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

Manipulation of host cell functions by Salmonella: the role of the bacterial effector protein SteA

Salmonella enterica serovars are Gram-negative facultative intracellular bacterial pathogens that infect a wide variety of animals. Salmonella infections are common in humans, causing usually typhoid fever and gastrointestinal diseases. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), which is a leading cause of human gastroenteritis, has been extensively used to study the molecular pathogenesis of Salmonella, because of the availability of sophisticated genetic tools, and of suitable animal and tissue culture models mimicking different aspects of Salmonella infections.(...)

Sistemas bacterianos competentes em biotransformação humana para estudos mecanísticos e toxicológicos

Devido às limitações de sistemas in vitro atuais, existe uma necessidade de modelos celulares especializados em mimetizar propriamente a biotransformação humana. Além da aplicação destes novos sistemas na avaliação e estudo de toxicidade químicos, estes sistemas permitem o uso em estudos funcionais e mecanísticos de enzimas de biotransformação humanas. Nesta dissertação é abordado o desenvolvimento de modelos celulares competentes em enzimas de biotransformação humanas, aplicado na avaliação de um dos principais metabolitos do fármaco antirretroviral Nevirapina (NVP), como também num estudo mecanístico do importante fator proteico na biotransformação humana, a NADPH citocromo P450 oxido-redutase (CPR). NVP é frequentemente usado no tratamento de HIV-1 e tem sido associado a efeitos adversos como lesões hepáticas e erupções cutâneas severas. Evidências apontam ao envolvimento de citocromos P450 e subsequente sulfonação por sulfotransferases na formação de metabolitos reativos. Contudo, testes padrão in vitro não demonstraram evidências de mutagenicidade ou clastogenicidade. Neste estudo, utilizando uma estirpe de S. typhimurium, competente na expressão controlável e estável de sulfotransferase 1A1 (SULT1A1) humana, demonstrou-se mutagenicidade de 12-hidroxi-NVP dependente de SULT1A1. A enzima CPR está envolvida nas principais reações de biotransformação de xenobióticos, além de interagir com outras proteínas importantes com funções celulares importantes. O mecanismo pelo qual CPR doa eletrões aos seus parceiros redox não é completamente claro. Foi desenvolvido um sistema de E. coli para ser aplicado em estudos mecanísticos sobre a doação de eletrões de CPR. Este novo sistema co expressa CPR e hemeoxigenase I (HO-1) humanas, que depende importantemente de CPR, sendo sustentada por sete eletrões doados por cada ciclo enzimático. As condições de cultura foram otimizadas para níveis de expressão CPR/HO-1 aproximados à estequiometria verificada em humanos. Este modelo células foi aplicado no desenvolvimento de um ensaio de cinética de HO-1, focando-se em vários parâmetros para a sua otimização.