18 resultados para Rèmols de petxines -- Genètica
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Dissertao apresentada para a obteno do Grau de Mestre em Gentica Molecular e Biomedicina, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Cincias e Tecnologia
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Cincias biomdicas
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A malria constitui um problema de sade pblica, que tem vindo a agravar-se, sendo crescente a necessidade de estratgias renovadas para o seu controlo, como a interrupo do ciclo esporognico. Deste modo, essencial compreender as respostas imunolgicas de Anopheles anti-Plasmodium. Demonstrou-se anteriormente, que a inibio de transglutaminases, enzimas que participam em vrios processos biolgicos ao catalisarem a formao de ligaes covalentes entre pptidos, agrava a infeco em mosquitos pelo parasita. O presente trabalho tem por objectivo caracterizar as transglutaminases AGAP009098 e AGAP009100 de Anopheles gambiae. Os mtodos utilizados para este efeito foram: a sequenciao de regies dos genes AGAP009098 e AGAP009100; a clonagem molecular de fragmentos da regio codificante do gene AGAP009098, usando o vector plasmdico pET28a(+) e Escherichia coli como sistema de expresso; e PCR em Tempo Real para analisar a expresso relativa dos genes AGAP009098 e AGAP009100 nos diferentes os estdios de desenvolvimento. AGAP009098 expressa ubiquamente e AGAP009100 a partir do estdio pupa. Estes resultados apontam para a concluso de que AGAP009098 e AGAP009100 podero desempenhar funes em processos biolgicos relevantes, por exemplo na defesa imunitria, ou no desenvolvimento. Os pptidos recombinantes, obtidos a partir da clonagem com sucesso de fragmentos da regio codificante do gene AGAP009098, constituem uma ferramenta importante para averiguar a funo destas TGases, no futuro.
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RESUMO: O cancro da mama a patologia oncolgica mais frequente nas mulheres sendo o responsvel pela maior taxa de mortalidade por cancro no sexo feminino. Contudo, as causas inerentes a esta patologia permanecem por esclarecer. Nos ltimos anos tem-se verificado que o risco para patologia neoplsica depende de factores ambientais e genticos, estando estes ltimos associados variabilidade gentica inter-individual. Polimorfismos genticos em genes envolvidos no metabolismo de hormonas sexuais, de cancergenos ambientais e na reparao da leso gentica, so potenciais candidatos a estarem associados susceptibilidade individual para esta patologia. Assim, neste trabalho desenvolveram-se estudos de associao caso-controlo na populao Portuguesa, com vista a avaliar-se o papel atribudo aos polimorfismos na susceptibilidade para cancro da mama. Foram seleccionados polimorfismos em genes envolvidos em diferentes vias mecanicistas: destoxificao de cancergenos, metabolismo de estrognios, reparao por exciso de bases, reparao por exciso de nucletidos, reparao mismatch e reparao por recombinao homloga. Os resultados obtidos revelaram associao entre os seguintes polimorfismos e a susceptibilidade individual para cancro da mama: os dois SNPs estudados no gene XRCC1 (Arg194Trp e Arg399Gln) e o SNP no gene XRCC3 (Thr241Met) aps estratificao pelo status menopausico. Mediante estratificao por status de amamentao os SNPs identificados nos genes MnSOD (Val16Ala) e XRCC2 (Arg118His); um SNP no gene MLH3 (Leu844Pro), e por fim como resultado de interaco gene-gene as interaces descritas por MSH3 Ala1045Thr/MSH6 Gly39Glu e MSH4 Ala97Thr/MLH3 Leu844Pro. Os resultados obtidos e apresentados na presente dissertao, revelam que o estudo de polimorfismos pode representar um papel determinante na etiologia do cancro da mama. No entanto, mais estudos envolvendo estes mesmos polimorfismos em populaes casuisticamente superiores sero uma mais-valia nos estudos de associao para esta neoplasia. Adicionalmente, a utilizao da metodologia de Pools de DNA, poder ser uma ferramenta til na pr-seleco dos polimorfismos mais relevantes a estudar, na medida em que permite estimar a frequncia allica de cada SNP numa determinada populao.-----------------------------------ABSTRACT: Breast cancer is the most common form of cancer among women, being the responsible for the highest mortality rate from cancer among the female sex. However, the main causes related to this pathology remain unclear. The risk of neoplasic disease has been connected with genetic and environmental factors. In fact, genes and the environment share the stage for most, if not all, common non-familial cancers, and are related to individual susceptibility. Genetic polymorphisms identified in genes encoding enzymes involved in estrogen metabolism, xenobiotics and DNA repair pathways are believed to be candidates for associations with breast cancer. Therefore, it was our intention to develop case-control studies among the Portuguese population, in order to evaluate the potential role of several genetic polymorphisms in breast cancer susceptibility. We selected polymorphisms in genes involved in different pathways: carcinogenic detoxification, estrogen metabolism, base excision repair, nucleotide excision repair, mismatch repair and double strand break repair by homologous recombination. The results obtained revealed potential associations between some polymorphisms studied and individual susceptibility to breast cancer. Regarding this fact, our results suggest the potential involvement of two XRCC1 gene polymorphisms (Arg194Trp and Arg399Gln) and XRCC3 gene polymorphism (Thr241Met) after stratification to menopausal status and after stratification to breastfeeding status an association of MnSOD gene polymorphism (Val16Ala) and XRCC2 (Arg188His) with the disease. The SNP identified in MLH3 gene (Leu844Pro), and the interaction gene-gene described by MSH3 Ala1045Thr/MSH6 Gly39Glu and MSH4 Ala97Thr/MLH3 Leu844Pro were also related to breast cancer susceptibility. The results shown in the present dissertation have revealed the potential role of polymorphisms in breast cancer etiology. However, further studies will be needed with larger populations to confirm these results. Additionally, the use of DNA pools methodology, as a pre-selection tool, could allow the identification of the most relevant polymorphisms to be studied, estimating the allelic frequency of each SNPs in different populations.
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Dissertao de Doutoramento em Lnguas, Literaturas e Culturas. Literatura Portuguesa Moderna
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RESUMO O presente estudo teve como principal objectivo avaliar a diversidade gentica de uma populao parasitria de Leishmania em isolados portugueses de hospedeiros humanos, caninos, vulpinos e do vector, aplicando dois marcadores moleculares: kDNA e microssatlites. No Captulo 1 fez-se uma reviso bibliogrfica sobre as leishmanioses incluindo a epidemiologia da infeco nos pases da bacia mediterrnica nomeadamente Portugal. Deu-se especial relevo epidemiologia molecular que nos ltimos anos tem vindo a ser desenvolvida. No Captulo 2 efectuou-se um inqurito de leishmaniose canina que abrangeu 374 ces provenientes da Regio Metropolitana de Lisboa. Foi encontrada uma prevalncia total de 19,2%, com a prevalncia de 18,4% nos ces com dono e 21,6% nos ces sem dono ou vadios. Os resultados obtidos evidenciaram a importncia dos ces vadios na transmisso do parasita e disseminao da doena. A partir dos 72 ces infectados, foram isolados 49 estirpes de Leishmania, tendo estas sido tipadas como L. infantum zimodeme MON-1. Estas estirpes, em conjunto com outras amostras isoladas a partir de humanos, vector e outros candeos, foram utilizadas para avaliar a diversidade gentica. No Captulo 3 foram desenvolvidas sequncias iniciadoras cinetoplastideais, MC1 e MC2, tendo-se estas revelado especficas e sensveis para a identificao do complexo L. donovani isolados em cultura ou directamente a partir de amostras clnicas. Aplicou-se a metodologia de kDNA-PCR-RFLP na anlise de 161 amostras de DNA, das quais 134 eram provenientes de isolados portugueses de L. infantum. Foram identificados 16 gentipos na totalidade das amostras, tendo 13 sido identificados nas amostras portuguesas. Observou-se a predominncia do gentipo A, observado exclusivamente na populao parasitria portuguesa. Em termos geogrficos esta metodologia mostrou estar de acordo com a tipagem isoenzimtica, e outros marcadores moleculares, individualizando as amostras provenientes de frica num nico gentipo. No entanto no se observou individualizao ao nvel das regies de Portugal estudadas, sugerindo a existncia de fluxo gentico entre as diferentes reas geogrficas. No Captulo 4 aplicou-se a anlise de 13 loci de microssatlites, polimrficos para L. infantum, em 154 amostras, das quais 128 eram provenientes de diferentes regies geogrficas de Portugal e de diferentes hospedeiros e vector. Obteve-se um maior grau de polimorfismo com estes marcadores do que com o kDNA, identificando-se 85 gentipos. Observou-se uma maior diversidade molecular nas amostras provenientes do Algarve e Alto Douro e, relativamente ao hospedeiro, estes alvos moleculares mostraram ser muito mais polimrficos no hospedeiro humano que o canino, indo ao encontro dos resultados de tipagem isoenzimtica que se conhecem at actualidade. Foi individualizado um agrupamento de amostras no MON-1 e dentro deste, um sub-agrupamento das amostras de frica Oriental (Etipia e Sudo), como anteriormente sugerido por outros autores. No Captulo 5 discutiram-se os resultados obtidos permitindo verificar que a variabilidade dos parasitas Leishmania no nosso pas maior do que tem sido considerada at ao presente. Possibilitaram tambm o conhecimento de que h gentipos predominantes em Portugal e que a variabilidade gentica no hospedeiro humano e no vector superior do reservatrio domstico e silvtico.
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Dissertao para obteno do Grau de Mestre em Gentica Molecular e Biomedicina
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Dissertao apresentada na Faculdade de Cincias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obteno do grau de Grau de Mestre por Licenciados Pr-Bolonha, em Biotecnologia
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Glossina palpalis gambiensis o principal vector de Tripanossomose Humana Africana (THA) na frica Ocidental e a mosca ts-ts mais comum na Guin-Bissau. Apesar da sua ampla distribuio, nenhum caso de THA tem sido reportado no pas desde finais dos anos 70 do sculo XX. Populaes naturais do Grupo palpalis demonstraram diferentes nveis de variao intraespecfica que podem influenciar a sua capacidade vectorial. Portanto, o conhecimento exacto acerca da identidade das espcies e estrutura populacional essencial para prever o possvel restabelecimento e propagao da transmisso de THA na Guin-Bissau. A variao gentica foi analisada em amostras de Glossina palpalis gambiensis de cinco regies da Guin-Bissau, com recurso a microssatlites. Trs das regies pertencem parte continental e duas representam a parte insular do pas. No total, 261 moscas ts-ts do sexo feminino foram genotipadas para 11 loci microssatlites. Baixos nveis de diferenciao gentica foram observados entre as populaes de G. p. gambiensis da Guin-Bissau (FST = 0,006, P = 0,002). Este resultado est de acordo com a anlise de agrupamentos, que revelou a presena de um nico cluster agrupando todas as amostras, independentemente da origem geogrfica. De um modo geral, estes resultados sugerem uma baixa subestruturao populacional em G. p. gambiensis nesta regio. Anlises de equilbrio mutao-deriva sugerem ainda a ocorrncia de expanso populacional recente. As evidncias genticas sugerem considerveis nveis de fluxo gentico entre as populaes continentais e entre as populaes insulares e continentais da Guin-Bissau. No caso do restabelecimento de focos de transmisso de THA, a possibilidade de disseminao do protozorio Trypanosoma, atravs da disperso activa das moscas ts-ts, deve ser tida em conta no planeamento de estratgias de controlo vectorial na Guin-Bissau. PALAVRAS-CHAVE: Glossina, Tripanossomose Humana Africana, microssatlites, diferenciao gentica.
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RESUMO: O maraviroc (MVC) o nico anti-retroviral antagonista do co-receptor CCR5 licenciado e interage com as ansas transmembranares de CCR5, induzindo uma alterao da sua conformao e impedindo a interaco com gp120. O MVC activo apenas contra estirpes R5 de HIV-1, sendo utilizado em terapia de recurso. Neste trabalho, foi estudada a diversidade gentica da regio C2V3C3 do gene env de estirpes de HIV-1 de oxicodependentes por via endovenosa da Grande Lisboa, pesquisando-se tambm a presena de polimorfismos genticos naturais. Foram utilizadas 52 amostras de plasma e para 35 destas foi amplificado por RT-nested PCR um produto de 565 pb. A anlise filogentica revelou a seguinte distribuio de gentipos: 23 B (incluindo, provavelmente, 2 CRF14_BG), 8 A, 3 G e 1 F1. Aps traduo, e por comparao com a sequncia consenso B, verificou-se uma elevada frequncia de polimorfismos genticos, sendo encontradas algumas assinaturas de aminocidos relativas aos subtipos no-B. Realizou-se ainda uma pesquisa de locais de N-glicosilao e a previso da utilizao de co-receptores (abordagem genotpica), com recurso s regras 11/25 e da carga lquida da ansa V3 e aos programas PSSM e geno2pheno[coreceptor]. Observou-se uma conservao genrica do nmero de locais de N-glicosilao e foram identificadas 5 sequncias com tropismo X4 ou duplo. Por fim, com base na literatura, realizou-se uma pesquisa de polimorfismos genticos associados a resistncia ao MVC presentes na ansa V3. Foi observado um nmero elevado destas mutaes. A presena dos padres 11S+26V e 20F+25D+26V, num total de 3 sequncias, relevante, visto estes estarem inequivocamente associados resistncia in vivo ao MVC. Apesar de no estar ainda definido um perfil de resistncia para o MVC, a presena das mutaes encontradas, em indivduos sem contacto prvio com o frmaco, trar implicaes relevantes na sua gesto clnica, considerando a introduo do MVC na terapia de recurso.---------- ABSTRACT: Maraviroc (MVC) is the only CCR5 inhibitor licensed today. This drug interacts with the transmembrane helices of CCR5 co-receptor, inducing a conformation change of its extracellular loops and preventing the interaction with gp120. MVC is only active against R5 strains of HIV-1 and is currently used in salvage therapy. The genetic diversity of the env C2V3C3 region of HIV-1 strains from injecting drug users in the Greater Lisbon was studied, along with the presence of natural genetic polymorphisms. 52 plasma samples were used and the amplification by RT-nested PCR of a 565 bp-product was possible in 35 of them. The phylogenetic analysis revealed 23 sequences classified as subtype B (probably including 2 CRF14_BG), 8 A, 3 G and 1 F1. After translation, the presence of natural genetic polymorphisms was studied by comparison to a subtype B consensus. A high frequency of genetic polymorphisms was observed and significant amino acid signatures were found in association with non-B subtypes. A full characterization of the N-glycosylation sites was also performed and a coreceptor prediction (genotypic approach) was accomplished using the 11/25 and the V3 net charge rules and the programs PSSM and geno2pheno[coreceptor]. The number of N-glycosylation sites was generically preserved. Five sequences were defined as X4 or dual-tropic. Based on published data, a search for genetic polymorphisms, present in V3loop, associated to MVC resistance was finally undertaken. Several of such mutations were observed, being particularly interesting the presence of the patterns 11S+26V and 20F+25D+26V, in a total of 3 sequences, since these patterns have unequivocally been associated with MVC resistance in vivo. Although a resistance profile for MVC is not yet defined, the presence of these mutations in MVC-nave populations may have significant impact in their clinical management in the future, especially considering the introduction of this drug in salvage therapy.
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Dissertao para obteno do Grau de Mestre em Gentica Molecular e Biomedicina
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Neste estudo procedeu-se caracterizao da diversidade gentica das regies codificantes da protease (PR), transcritase reversa (RT) e integrase (IN) do gene pol do vrus da imunodeficincia humana tipo 1 (HIV-1), bem como pesquisa de polimorfismos genticos associados diminuio da susceptibilidade aos anti-retrovirais inibidores enzimticos, circulante numa populao de 51 indivduos utilizadores de drogas por via endovenosa (IDUs) da Grande Lisboa. Em termos globais, a anlise filogentica realizada com base em 38 sequncias nucleotdicas concatenadas revelou que 12 (31,6%), 13 (34,2%) e 13 (34,2%) das sequncias analisadas eram dos subtipos B, G/CRF14_BG e de formas genticas no-B/no-G (1 F1, 4 CRF02_AG e 8 formas recombinantes nicas), respectivamente. Relativamente pesquisa de mutaes associadas a resistncia (perfil genotpico), foram encontradas 15, presentes em 50,0% (22/44) dos indivduos, com uma distribuio de 1-3/indivduo (4, todas acessrias, na PR; 6 na RT; 5 na IN, uma principal e 4 acessrias). Todavia, apenas 26,7% (4/15) dessas mutaes conferiam uma expresso fenotpica de resistncia a uma das classes de inibidores (da RT ou IN), em 9,1% (4/44) dos indivduos. Foi ainda observada uma elevada frequncia de outros polimorfismos genticos, mais frequentes em subtipos no-B, alguns dos quais considerados assinaturas de subtipo. A homologia gentica total ou parcial com os subtipos B e G, reconhecida neste estudo, reflectir a sua predominncia na populao de IDUs. Este resultado sugere tambm que a epidemia de HIV-1 em Portugal poder estar a evoluir para um padro epidemiolgico singular, no qual os subtipos B, G e suas formas recombinantes predominam. A proporo observada de indivduos portadores de vrus com mutaes associadas a resistncia, mesmo em indivduos naive relativamente teraputica, indica que a sua transmisso se encontra em curso entre a populao de IDUs, tendo, certamente, um impacto relevante ao nvel da abordagem teraputica e monitorizao da infeco.
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A Programao Gentica (PG) uma tcnica de Aprendizagem de Mquina (Machine Learning (ML)) aplicada em problemas de otimizao onde pretende-se achar a melhor soluo num conjunto de possveis solues. A PG faz parte do paradigma conhecido por Computao Evolucionria (CE) que tem como inspirao teoria da evoluo natural das espcies para orientar a pesquisa das solues. Neste trabalho, avaliada a performance da PG no problema de previso de parmetros farmacocinticos utilizados no processo de desenvolvimento de frmacos. Este um problema de otimizao onde, dado um conjunto de descritores moleculares de frmacos e os valores correspondentes dos parmetros farmacocinticos ou de sua atividade molecular, utiliza-se a PG para construir uma funo matemtica que estima tais valores. Para tal, foram utilizados dados de frmacos com os valores conhecidos de alguns parmetros farmacocinticos. Para avaliar o desempenho da PG na resoluo do problema em questo, foram implementados diferentes modelos de PG com diferentes funes de fitness e configuraes. Os resultados obtidos pelos diferentes modelos foram comparados com os resultados atualmente publicados na literatura e os mesmos confirmam que a PG uma tcnica promissora do ponto de vista da preciso das solues encontradas, da capacidade de generalizao e da correlao entre os valores previstos e os valores reais.
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Glossina palpalis gambiensis o principal vector de Tripanossomose Humana Africana (THA) na frica Ocidental e a mosca ts-ts mais comum na Guin-Bissau. Apesar da sua ampla distribuio, nenhum caso de THA tem sido reportado no pas desde finais dos anos 70 do sculo XX. Populaes naturais do Grupo palpalis demonstraram diferentes nveis de variao intraespecfica que podem influenciar a sua capacidade vectorial. Portanto, o conhecimento exacto acerca da identidade das espcies e estrutura populacional essencial para prever o possvel restabelecimento e propagao da transmisso de THA na Guin-Bissau. A variao gentica foi analisada em amostras de Glossina palpalis gambiensis de cinco regies da Guin-Bissau, com recurso a microssatlites. Trs das regies pertencem parte continental e duas representam a parte insular do pas. No total, 261 moscas ts-ts do sexo feminino foram genotipadas para 11 loci microssatlites. Baixos nveis de diferenciao gentica foram observados entre as populaes de G. p. gambiensis da Guin-Bissau (FST = 0,006, P = 0,002). Este resultado est de acordo com a anlise de agrupamentos, que revelou a presena de um nico cluster agrupando todas as amostras, independentemente da origem geogrfica. De um modo geral, estes resultados sugerem uma baixa subestruturao populacional em G. p. gambiensis nesta regio. Anlises de equilbrio mutao-deriva sugerem ainda a ocorrncia de expanso populacional recente. As evidncias genticas sugerem considerveis nveis de fluxo gentico entre as populaes continentais e entre as populaes insulares e continentais da Guin-Bissau. No caso do restabelecimento de focos de transmisso de THA, a possibilidade de disseminao do protozorio Trypanosoma, atravs da disperso activa das moscas ts-ts, deve ser tida em conta no planeamento de estratgias de controlo vectorial na Guin-Bissau.
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RESUMO: O transplante heptico ortotpico uma teraputica aceite para casos selecionados de falncia heptica terminal. O procedimento tem-se aperfeioado, evidenciado pelo aumento da taxa de sobrevida de 30 para 75% aos 5 anos, mas cerca de 13 a 27% dos enxertos desenvolve falncia primria (PNF) ou disfuno primria (DF) aps o transplante. As consequncias so devastadoras para a sobrevida do doente e do enxerto. A sua etiologia multifactorial, incluindo factores relacionados com o dador e o receptor, tempos de isqumia, agresses cirrgicas, bem como caractersticas anatomopatolgicas do enxerto. A leso de isqumia/reperfuso mantem-se como um factor de risco intra operatrio, com implicaes directas sobre toda a evoluo do transplante : existe uma relao ntima entre a PNF e a DF, a preservao do enxerto, a leso de isqumia/reperfuso, e a falncia do transplante. Alm disso, est comprovada evidncia que sugere que a leso de I/R torna um aloenxerto mais vulnervel por aumento da imunogenicidade, aumentando a probabilidade de episdios de rejeio precoce e tardia. Com base na prtica clnica quotidiana do CHBPT HCC, estudaram-se 54 casos de transplante heptico, agrupados segundo grupos por alocao do enxerto respectivo: Grupo 1(n=27): dador cadver para receptor cirrtico, Grupo 2 (n=15): dador cadver para receptor PAF, Grupo 3 (n=12): dador PAF para receptor cirrtico. Observaram-se as alteraes histolgicas e moleculares sobre o enxerto at ao final da operao do receptor, e as suas consequncias clnicas,avaliando: - As diferentes capacidades de resistncia e cada enxerto leso de isqumia/reperfuso. - As situaes em que os factores do receptor se sobrepem s do enxerto na definio do prognstico, e vice versa. - A relevncia das leses histolgicas e moleculares precoces no tecido heptico na evoluo do enxerto e do receptor. Foram colhidas bipsias por agulha dos 54 enxertos hepticos,42 provenientes de cadver com corao batente(morte cerebral) e 12 provenientes de dador vivo com PAF, em trs tempos diferentes do processo de colheita e transplante heptico: A primeira(T0)antes da clampagem da aorta do dador - A segunda (T1) no final da isqumia fria - A terceira (T2) aps a reperfuso do enxerto, durante o encerramento da parede abdominal. A estas amostras foi extrado RNA total, convertido em cDNA por transcrio reversa e feita a anlise da expresso dos genes da CTLA4, IL-1, IL-4, IL-6, IL-13, TNF-, Perforina, Selectina, (SELE), Fas-ligando, Granzima-B, Heme-Oxigenase 1(HO1)e xido Ntrico Sintetase(iNOS2A)por PCR quantitativo segundo o mtodo do Ct comparativo, utilizando como referncia a expresso dos genes da amostra no-isqumica T0. Os fragmentos de todas as bipsias foram seccionados, para envio de amostra comparativa para processamento histolgico habitual, sem qualquer alterao ao protocolo seguido habitualmente na Unidade de Transplantao do Hospital Curry Cabral. A presena de alguns parmetros histolgicos definidos, como esteatose, necrose, vacuolizao, congesto sinusoidal e infiltrao neutroflica, foi registada e contabilizada numa classificao numrica. O seguimento clnico e laboratorial, bem como o acompanhamento de eventuais complicaes, foi registado e correlacionado com os dados das colheitas de rgos e com os dados das bipsias. Foram consideradas as seguintes variveis, como as mais relevantes e objectivas para a interpretao da evoluo clnica, tendo sido comparadas estatisticamente com os dados recolhidos, laboratoriais e clnicos: disfuno do enxerto, 207 ps operatrias, nmero de internamentos igual ou superior a 2 e rejeio crnica e/ou morte do receptor. Foram identificadas caractersticas clnicas menos favorveis, a considerar, nalgumas circunstncias: gnero feminino do receptor (sobretudo associado a enxerto masculino, p=0,077), isqumia fria superior a 500 minutos (p=0,074), isqumia quente superior a 90 minutos (p=0,099). Na anlise laboratorial, distinguiram-se duas caractersticas histolgicas desfavorveis e irreversveis, como ndice de mau prognstico: a necrose e a balonizao (p=0,029); no painel gentico escolhido neste estudo,a expresso basal de IL-1(p=0,028), de SELE p=0,013)e de FAS-L (p=0,079)relacionaram-se com pior prognstico. Algumas caractersticas protectoras intrnsecas dos enxertos s se revelaram indirectamente, como menor infiltrao neutroflica e maior expresso de HO1 e de iNOS nos enxertos PAF, no tendo sido possvel provar uma interferncia directa nos resultados clnicos. No se obteve expresso mensurvel de genes anti- inflamatrios nas biopsias hepticas processadas neste estudo, como a IL13 e a I 4: assim, com a metodologia utilizada, no foi possvel obter um perfil de expresso gentica associado a boa evoluo clnica. O perfil inverso foi sugerido apenas pela expresso basal dos 3 genes mencionados (FAS-L,IL-1 e SELE)no mesmo painel, com o protocolo seguido neste conjunto de 54 doentes. As caractersticas do receptor sobrepuseram-se s do enxerto no caso de: - diagnstico de PAF no receptor, que determinou uma maior predisposio para a disfuno do enxerto, o que, por sua vez, determina uma menor sobrevida. No entanto, o diagnstico de PAF no receptor exibe uma curva de sobrevida mais favorvel. - receptores com um baixo balano de risco (BAR)definiram caractersticas favorveis para enxertos com nveis baixos e moderados de esteatose, fazendo que esta caracterstica, definida como um risco acrescido, no s no se manifestasse clinicamente,como parecesse um factor favorvel. As caractersticas do enxerto sobrepuseram-se s do receptor no caso de: - tempo de isqumia fria superior a 500 minutos - balonizao, necrose, FAS-L,IL-1 e SELE em T0 A integrao dos resultados moleculares e morfolgicos com a evoluo clnica, reala o papel da mobilizao precoce de neutrfilos nos desempenhos menos favorveis do enxerto heptico. -------------ABSTRACT: Orthotopic liver transplantation is na accepted therapeutic procedure for selected cases of terminal liver failure. The procedure has been improved, evidenced by the rise of survival rates from 30 to 70% at 5 years, but 13 to 27% of the liver grafts develops primary non function (PNF) or primary dysfunction (PDF) after transplantation. The consequences are devastating for the survival of the patient and of the graft. Its etiology is multifactorial, including factos related with the donor and with the recipient, ischemic times, surgical aggressions, as well as the histological characteristics of the graft. The ischemia/reperfusion lesion is still an intraoperative risk factor, with direct implications in the whole transplant outcome: there is a close interrelation between PNF and DF, graft preservation, ischemia / reperfusion lesion and graft failure. Beyond his, there is proved evidence that suggests that I/R lesion turns the allograft more vulnerable by increasing its immunogenity, increasing the probability of precocious and late rejection episodes. Based on the daily clinical practice at CHBPT /HCC, 54 cases of hepatic transplantation have been studied, grouped by allocation of each graft: Group (n=27):deceased do nortocirrhotic recipient, Group 2 (n=15): deceased donor to FAP recipient, Group 3 (n=12): FAP living donor to cirrhotic recipient. The histologic and molecular changes in the liver graft were observed until the end of the recipiente operation,together with its clinical consequences, evaluating:-The different capacity of resistance of each graft to the ischemia / reperfusion lesion - The situations where the recipiente factos overlap the ones of the graft, in the definition of prognosis, and vice versa.- The relevance of the precocious histologic and molecular lesions of the hepatic tissue in the clinical outcome of the graft and the recipient. Needle biopsies were obtained from 54 liver grafts, 42 deceased brain dead donors and 12 from FAP living donors, at three diferente times of the harvesting and the hepatic transplantation: The first one (T0) before clamping the donor aorta - The second one (T2) in the end of cold ischemia time - The third one (T) after the reperfusion of the graft, during the closure of the abdominal wall. Total RNAwas extracted to these samples, converted to cDNA by reverse transcription and the analysis of gene expression was made for CTLA4,IL-1,IL-4,IL-6,IL-13,TNF-,Perforin,E Selectin (SELE),Fas-ligand,Granzyme-B,Heme-oxigenase 1 (HO1) and Nitric Oxide Sintetase (iNOS2A) by quantitative PCR, according with the Ct comparative method, using the expression of the non ischemic sample T0. The fragments of all the biopsies were divided, to send a comparative sample to the usual histologic processement, keeping the same usual protocol at the Transplantation Unit of Curry Cabral Hospital. The presence of some defined histologic parameters, such as steatosis, necrosis, vacuolization, sinusoidal congestion and neutrophilic infiltration, was registered and catalogued in a numeric classification. The clinical and laboratory follow-up, as well as the following of eventual complications, was registered and correlated with the data from organ procurement operations and with the data from the biopsies. The following variables were considered as the most relevant and objective ones, to the interpretation of the clinical evolution, being statistically compared with the clinical and laboratorial collected data: graft dysfunction, post-operative complications, number of readmissions of 2 or more and chronic rejection and /or recipiente death. There were identified some unfavorable clinical characteristics, to be considered under certain circumstances: recipiente female gender (specially associated with malegraft, p=0,077), cold ischemia time of more than 500 minutes (p=0,074), warm ischemia time of more than 90 minutes (p=0,099). In the laboratory analysis, two histologic characteristics were identified as unfavorable and irreversible, associated with bad prognosis: necrosis and balonization (p=0,029); in the gene panel selected in this study, the basal expression of IL-1 (p=0,028), SELE (p=0,013) and FAS-L (p=0,079)were related with worse prognosis.Some intrinsic protective characteristics of the grafts were only indirectly revealed, such as less neutrophilic infiltration and bigger expression of HO1 and iNOS in FAP grafts, being impossible to prove any direct inte ference in the clinical results. A relevant and measurable expression of the anti inflammatory genes IL13 and IL4 was not obtained: with the used methodology, it was impossible to obtain a gene expression profile associated with a favorable clinical outcome.The inverse profile was suggested only by the basal expression of the three mentioned genes (FAS-L, IL- 1 e SELE) in the same gene panel, according with the followed protocol in this group of 54 patients. The characteristics of the recipient overlapped those from the graft, in the case of :- FAP diagnosis in the recipient, which determined a bigger predisposition to graft dysfunction, which by itself determines a shorter survival. However, FAP diagnosis in the recipiente depicts a more favorable survival curve. - Recipients with a low balance risk ndex (BAR) defined favorable characteristics to grafts with low and moderate grades of steatosis, making that this characteristic, associated with bad prognosis, looked like a favorable factor, and with no clinical interference. The graft characteristics overlapped those from the receptor in the case of: - Cold ischemic time more than 500 minutes - Balonization, necrosis, FAS-L, IL-1 and SELE at T0. The integration of molecular and morphologic results with the clinical evolution, stresses the role of a precocious neutrophils mobilization in the worse outcomes of liver grafts.
