Digitally programmable delay-locked-loop with adaptive charge pump current for UWB radar system

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Electrotécnica e Computadores

Biological activity of well defined hydantoin derivatives on efflux pump systems of bacteria and cancer cells

A multi-resistência a antibióticos e medicamentos usados em quimioterapia é um dos grandes problemas com os quais as instituições de saúde se debatem hoje em dia. A acção provocada por bombas de efluxo é uma das suas causas. Estas bombas têm uma importância fundamental, uma vez que, ao expelirem todo o tipo de tóxicos para o exterior das células, também expelem medicamentos, fazendo com que estes não tenham o efeito desejado dentro delas. As bombas de efluxo são transportadores que se encontram nas membranas de todo o tipo de células. Existem dois grandes tipos de bombas de efluxo: as primárias e as secundárias. As primeiras conferem multi-resistência principalmente em células eucariotas, como as células do cancro em humanos, tendo como função a mediação da repulsa de substâncias tóxicas por intermédio da hidrólise de ATP. A primeira a ser descoberta e mais estudada destas bombas foi a ABCB1 que é o gene que codifica a glicoproteína-P (P de permeabilidade). Enquanto as secundárias, que são a maior fonte de multi-resistência em bactérias, promovem a extrusão de substâncias tóxicas através da força motriz de protões. Neste tipo de bombas são conhecidas quatro famílias principais, das quais uma das mais importantes é a superfamília RND, uma vez que inclui a bomba AcrAB-TolC, que é muito importante no metabolismo xenobiótico de bactérias Gramnegativas, nomeadamente a E.coli. Com o objectivo de reverter a multi-resistência, tanto em células eucariotas como procariotas, têm-se desenvolvido estratégias de combate que envolvem a descoberta de substâncias que inibam as bombas de efluxo. Assim sendo, ao longo dos tempos têm sido descobertas variadas substâncias que cumprem este objectivo. É o caso, por exemplo, dos derivados de fluoroquinolonas usados como inibidores de bombas de efluxo em bactérias ou do Tamoxifen, utilizado na terapia de pacientes com cancro da mama. Um dos grupos de substâncias estudados para o desenvolvimento de possíveis compostos que actuem como reversores de multi-resistência são os compostos derivados de hidantoínas. Estes, são conhecidos por possuírem uma grande variedade de propriedades bioquímicas e farmacológicas, sendo portanto usados para tratarem algumas doenças em humanos, como a epilepsia. Nestes, estão englobados compostos com actividade anti-convulsão que constitui a sua grande mais-valia e, dependente da substituição no anel que os constitui, uma grande variedade de outras propriedades farmacológicas como a anti-fungica, a anti-arritmica, a anti-viral, a anti-diabética ou por exemplo a antagonização de determinados receptores, como os da serotonina. Apesar de pouco usados em estudos experimentais para desenvolver substâncias anti-carcinogénicas, existem alguns estudos com este efeito. Objectivos: O presente projecto envolve o estudo de bombas de efluxo primárias e secundárias, em células eucariotas e procariotas, respectivamente. Em bactérias, foram usados quatro modelos experimentais: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 29212, E. coli AG 100 e Salmonella Enteritidis NCTC 13349. Em células de cancro foram usadas, células T de linfoma de rato parentais e células T de linfoma de rato transfectadas com o gene humano MDR-1. O principal objectivo deste estudo foi a pesquisa de novos moduladores de bombas de efluxo presentes em bactérias e células do cancro, tentando assim contribuir para o desenvolvimento de novos agentes farmacológicos que consigam reverter a multi-resistência a medicamentos. Assim sendo foram testados trinta compostos derivados de hidantoínas: SZ-2, SZ-7, LL-9, BS-1, JH-63, MN-3, TD-7k, GG-5k, P3, P7, P10, P11, RW-15b, AD-26, RW-13, AD-29, KF-2, PDPH-3, Mor-1, KK-XV, Thioam-1, JHF-1, JHC-2, JHP-1, Fur-2, GL-1, GL-7, GL-14, GL-16, GL-18. Como forma de atingir estes objectivos, a actividade biológica dos trinta compostos derivados de hidantoínas foi avaliada nas quatro estirpes de bactérias da seguinte forma: foram determinadas as concentrações mínimas inibitórias dos trinta compostos como forma de definir as concentrações em que os compostos seriam utilizados. Os compostos foram posteriormente testadas com um método fluorométrico de acumulação de brometo de etídeo, que é um substrato comum em bombas de efluxo bacterianas, desenvolvido por Viveiros et al. A actividade biológica dos compostos derivados de hidantoínas nas células de cancro foi demonstrada por diferentes métodos. O efeito anti-proliferativo e citotóxico dos trinta compostos foi avaliado nas células T de linfoma de rato transfectadas com o gene humano MDR-1 pelo método de thiazolyl de tetrazólio (MTT). Como o brometo de etídeo também é expelido pelos transportadores ABC, estes compostos foram posteriormente testados com um método fluorométrico de acumulação de brometo de etídeo desenvolvido por Spengler et al nos dois diferentes tipos de células eucariotas. Resultados: A maioria dos compostos derivados de hidantoínas foi eficaz na modulação de bombas de efluxo, nas duas estirpes de bactérias Gram-negativas e nos dois diferentes tipos de células T de linfoma. Em contraste com estes resultados, nas duas estirpes de células Gram-positivas, a maioria dos compostos tiveram pouco efeito na inibição de bombas de efluxo ou até nenhum, em muitos dos casos. De uma maneira geral os melhores compostos nas diferentes estirpes de bactérias foram: Thioam-1, SZ-2, P3, Rw-15b, AD-26, AD-29, GL-18, GL-7, KF-2, SZ-7, MN-3, GL-16 e GL- 14. Foram portanto estes os compostos que provocaram maior acumulação de brometo de etídeo, inibindo assim com maior eficácia as bombas de efluxo. No presente estudo, a maioria dos compostos conseguiu inibir a resistência provocada pela bomba de efluxo ABCB1, tanto nas células parentais bem como nas células que sobre-expressam esta bomba, causando a acumulação de brometo de etídeo dentro das células. As células que sobreexpressam a bomba ABCB1 foram posteriormente testadas com citometria de fluxo que é a técnica padrão para pesquisa de inibidores de bombas de efluxo. Os compostos que foram mais efectivos na inibição da bomba ABCB1, causando assim maior acumulação de brometo de etídeo nas células que sobre-expressam esta bomba foram: PDPH-3, GL-7, KK-XV, AD-29, Thioam-1, SZ-7, KF-2, MN-3, RW-13, LL-9, P3, AD-26, JH-63 e RW- 15b. Este facto não corroborou totalmente os resultados da citometria de fluxo uma vez que os moduladores que provocaram maior inibição da bomba ABCB1 foram o MN-3, JH-63 e o BS-1, sendo que o último não foi seleccionado como um bom composto usando o método fluorométrico de acumulação de brometo de etídeo. Conclusão: Os compostos derivados de hidantoínas testados tiveram maior efeito nas estirpes de bactérias Gram-negativas do que nas Gram-positivas. Relativamente às células eucariotas, as estruturas mais activas apresentam substituintes aromáticos bem como alguns fragmentos aminicos terciários.

Experimental study of proton induced nuclear reactions in 6,7 Li

This work presents the results of the experimental study of proton induced nuclear reactions in lithium, namely the 7Li(p,α) 4He, 6Li(p,α) 3He and 7Li(p,p)7Li reactions. The amount of 7Li and 6Li identified as primordial and observed in very old stars of the Milky Way galactic halo strongly deviates from the predictions of primordial nucleosynthesis and stellar evolution models which depend, among other factors, on the cross sections of reactions like 7Li(p,α) 4He and 6Li(p,α) 3He. These discrepancies have triggered a large amount of research in the fields of stellar evolution, cosmology, pre-galactic evolution and low energy nuclear reactions. Focusing on nuclear reactions, this work has measured the 7Li(p,α) 4He and 6Li(p,α) 3He reactions cross sections (expressed in terms of the astrophysical S -factor) with higher accuracy, and the electron screening effects in these reactions for different environments (insulators and metallic targets). The 7Li(p,α) 4He angular distributions were also measured. These measurementstook place in two laboratory facilities, in the framework of the LUNA (Laboratory for Undergroud Nuclear Astrophysics) international collaboration, namely the Laboratorio ´ de Feixe de Ioes ˜ in ITN (Instituto Tecnologico ´ e Nuclear) Sacavem, ´ Portugal, and the Dynamitron-TandemLaboratorium in Ruhr-Universitat¨ Bochum, Germany. The ITN target chamber was modified to measure these nuclear reactions, with the design and construction of new components, the addition of one turbomolecular pump and a cold finger. The 7Li(p,α) 4He and 6Li(p,α) 3He reactions were measured concurrently with seven and four targets, respectively. These targets were produced in order to obtain adequate and stable lithium depth profiles. In metallic environments, the measured electron screening potential energies are much higher than the predictions of atomic-physics models. The Debye screening model applied to the metallic conduction electrons is able to explain these high values. It is a simple model, but also very robust. Concerning primordial nucleosynthesis and stellar evolution models, these results are very important as they show that laboratory measurements are well controlled, and the model inputs from these cross sections are therefore correct. In this work the 7Li(p,p)7Li differential cross section was also measured, which is useful to describe the 7Li(p,α) 4He entrance channel.

Notas sobre depósitos de Taveiro estratigrafia, paleontologia, idade, paleoecologia

This paper reports some research work that has been done to support Geological Survey's field work for the 1:50.000 Carta Geológica de Portugal, (sheets 19-C Figueira da Foz and 19-D Coimbra-Lousã). Its main purpose was to establish the age of some continental formations. At Cerâmica do Mondego, Ld.ª near Taveiro, two series were observed. The lower one is mainly pelitic, montmorillonite being predominant. It also includes some sandy beds and channel deposits with high energy sediments (conglomerate with limestone pebbles). The upper series lies unconformably upon the former, and there is a neat discontinuity surface between the two. It mainly consists of sands, kaolinite being the most abundant of the clay minerals. This seems to indicate an intensive weathering, an acid, well drained environment and transportation by quite high energy running waters. No fossils were recorded. Preliminary paleontological results are presented, along with some data concerning other localities (Aveiro, etc.). Fossils found in the lower series are: gastropoda (Bulimus gaudryi, TV. 15 bed), several vertebrates (TV. 18), fishes (TV. 19?) and plants (TV. 19-TV. 24). Vertebrata belong to the same fauna as that from Vizo, Aveiro, etc. The presence of mammals is most important as only a single tooth was previously Know in Europe (Southern France) in Late Cretaceous formations. Elsewhere there are some mammalian remains in Peru besides the rich assemblages found in the USA and Mongolia. Plants are representative of the «Debeya flora» well known at several localities in Beira Litoral province, in «Buçaco sandstones», and in Lisbon's «Basaltic Complex». The most important stratigraphical conclusion is that the lower series is Upper Campanian and/or Maastrichtian in age, and not Tertiary as sometimes it has been considered. As at Aveiro, «Bebeya flora» occurs in-beds somewhat higher than those with the Aveiro-Vizo-Taveiro vertebrate fauna. Correlation with other «Debeya flora» localities are now more clear. Data concerning Taveiro lower series, in the whole, point out to a rather warm (and moist?) environment in an occasionally (seasonally?) flooded region.

Compact SMB chromatography for binary separation

A thesis submitted for the degree of Doctor of Philosophy

Non-volatile analysis in fruits by laser resonant ionization spectrometry: application to resveratrol (3,5,4 -trihydroxystilbene) in grapes

Applied Physics B Lasers and Optics, vol.71

The role of the efflux mechanisms in multidrug resistance in Mycobacterium tuberculosis

Abstract The emergence of multi and extensively drug resistant tuberculosis (MDRTB and XDRTB) has increased the concern of public health authorities around the world. The World Health Organization has defined MDRTB as tuberculosis (TB) caused by organisms resistant to at least isoniazid and rifampicin, the main first-line drugs used in TB therapy, whereas XDRTB refers to TB resistant not only to isoniazid and rifampicin, but also to a fluoroquinolone and to at least one of the three injectable second-line drugs, kanamycin, amikacin and capreomycin. Resistance in Mycobacterium tuberculosis is mainly due to the occurrence of spontaneous mutations and followed by selection of mutants by subsequent treatment. However, some resistant clinical isolates do not present mutations in any genes associated with resistance to a given antibiotic, which suggests that other mechanism(s) are involved in the development of drug resistance, namely the presence of efflux pump systems that extrude the drug to the exterior of the cell, preventing access to its target. Increased efflux activity can occur in response to prolonged exposure to subinhibitory concentrations of anti-TB drugs, a situation that may result from inadequate TB therapy. The inhibition of efflux activity with a non-antibiotic inhibitor may restore activity of an antibiotic subject to efflux and thus provide a way to enhance the activity of current anti-TB drugs. The work described in this thesis foccus on the study of efflux mechanisms in the development of multidrug resistance in M. tuberculosis and how phenotypic resistance, mediated by efflux pumps, correlates with genetic resistance. In order to accomplish this goal, several experimental protocols were developed using biological models such as Escherichia coli, the fast growing mycobacteria Mycobacterium smegmatis, and Mycobacterium avium, before their application to M. tuberculosis. This approach allowed the study of the mechanisms that result in the physiological adaptation of E. coli to subinhibitory concentrations of tetracycline (Chapter II), the development of a fluorometric method that allows the detection and quantification of efflux of ethidium bromide (Chapter III), the characterization of the ethidium bromide transport in M. smegmatis (Chapter IV) and the contribution of efflux activity to macrolide resistance in Mycobacterium avium complex (Chapter V). Finally, the methods developed allowed the study of the role of efflux pumps in M. tuberculosis strains induced to isoniazid resistance (Chapter VI). By this manner, in Chapter II it was possible to observe that the physiological adaptation of E. coli to tetracycline results from an interplay between events at the genetic level and protein folding that decrease permeability of the cell envelope and increase efflux pump activity. Furthermore, Chapter III describes the development of a semi-automated fluorometric method that allowed the correlation of this efflux activity with the transport kinetics of ethidium bromide (a known efflux pump substrate) in E. coli and the identification of efflux inhibitors. Concerning M. smegmatis, we have compared the wild-type M. smegmatis mc2155 with knockout mutants for LfrA and MspA for their ability to transport ethidium bromide. The results presented in Chapter IV showed that MspA, the major porin in M. smegmatis, plays an important role in the entrance of ethidium bromide and antibiotics into the cell and that efflux via the LfrA pump is involved in low-level resistance to these compounds in M. smegmatis. Chapter V describes the study of the contribution of efflux pumps to macrolide resistance in clinical M. avium complex isolates. It was demonstrated that resistance to clarithromycin was significantly reduced in the presence of efflux inhibitors such as thioridazine, chlorpromazine and verapamil. These same inhibitors decreased efflux of ethidium bromide and increased the retention of [14C]-erythromycin in these isolates. Finaly, the methods developed with the experimental models mentioned above allowed the study of the role of efflux pumps on M. tuberculosis strains induced to isoniazid resistance. This is described in Chapter VI of this Thesis, where it is demonstrated that induced resistance to isoniazid does not involve mutations in any of the genes known to be associated with isoniazid resistance, but an efflux system that is sensitive to efflux inhibitors. These inhibitors decreased the efflux of ethidium bromide and also reduced the minimum inhibitory concentration of isoniazid in these strains. Moreover, expression analysis showed overexpression of genes that code for efflux pumps in the induced strains relatively to the non-induced parental strains. In conclusion, the work described in this thesis demonstrates that efflux pumps play an important role in the development of drug resistance, namely in mycobacteria. A strategy to overcome efflux-mediated resistance may consist on the use of compounds that inhibit efflux activity, restoring the activity of antimicrobials that are efflux pump substrates, a useful approach particularly in TB where the most effective treatment regimens are becoming uneffective due to the increase of MDRTB/XDRTB.

Parametric analog signal amplification applied to nanoscale cmos wireless digital transceivers

Thesis presented in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy in the subject of Electrical and Computer Engineering by the Universidade Nova de Lisboa,Faculdade de Ciências e Tecnologia

The inhibitory activity of synthetic compounds and ions against transporters of multi-drug resistant bacteria

RESUMO: Sessenta e três derivados de hidantoína foram utilizados para avaliar possíveis efeitos de modulação na actividade das bombas de efluxo (BE) na Salmonella NCTC 13349 utilizando um método fluorimétrico semi-automático. Nenhum dos compostos apresentaram actividade anti-bacteriana até concentrações de 240 mg/L. Entre todos os compostos, SZ-7 demonstrou possuir propriedades de modulação de effluxo na presença de glucose. Para testar esta actividade, estirpes de Salmonella resistentes à ciprofloxacina, induzidas a elevados níveis de resistência com sobre-expressão de BE, foram expostas ao SZ-7. Este derivado afectou a susceptibilidade das estirpes à ciprofloxacina. Uma vez que os 63 compostos estudados apresentaram pouco efeito inibitório /cumulativo, apesar de serem conhecidos pelos seus efeitos moduladores de BE-dependentes de iões em eucariotas, foi questionado o papel dos iões na regulação de BE bacterianas, que poderão influenciar a eficácia de novos compostos. Para este estudo, utilizamos a Escherichia coli AG100 como modelo, devido ao extenso conhecimento no que respeita a estrutura e actividade das BE. Devido à importância de iões de cálcio (Ca2+) nos canais de transporte membranar e na actividade de ATPases, a sua actividade na modulação do efluxo foi investigada. De resultados anteriormente obtidos concluiu-se que a pH 5 o efluxo é independente de energia metabólica; contudo, a pH 8 é absolutamente dependente, sendo que o Ca2+ é indispensável para manter a actividade das ATPases bacterianas. A acumulação/effluxo de EtBr pela E. coli AG100 foi determinada na presença/ausência de Ca2+, clorpromazina (inibidor de ligação de Ca2+ a proteínas), e ácido etilenodiamino tetra-acético (quelante de Ca2+). Acumulação/effluxo aumentou a pH 8, contudo o Ca2+ reverte estes efeitos evidenciando a sua importância no funcionamento das BE bacterianas. Em resumo este trabalho colocou em evidência que muitos aspectos bioquímicos e bioenergéticos devem ser tomados em consideração no estudo da resistência bacteriana mediada por BE.------- ABSTRACT: Sixty-three hydantoin derivatives were evaluated for their modulating effects on efflux pump (EP) activity of Salmonella NCTC 13349 utilizing a semi-automatic fluorometric method. None of the compounds presented antibacterial activities at concentrations as high as 240 mg/L. Among all compounds, SZ-7 showed possible efflux modulating activity in the presence of glucose, indicative of a potential EP inhibitor. To verify its potential effects, ciprofloxacin-resistant Salmonella strains, induced to high level resistance with over-expressing EPs, were exposed to SZ-7. This derivative affected the susceptibility of the ciprofloxacin-resistant strains. Since the 63 compounds studied had very low inhibitory/accumulative effects, even though their known for being efficient in modulating ion-driven eukaryotic EPs, we questioned whether ions had a leading role in regulating bacterial EPs, influencing the effectiveness of new compounds. For this study we used Escherichia coli AG100 as a model, due to the extensive knowledge on its EPs structure and activity. Owing the importance of calcium ions (Ca2+) for membrane transport channels and activity of ATPases, the role of Ca2+ was investigated. From previous results we concluded that at pH 5 efflux is independent of metabolic energy; however, at pH 8 it is entirely dependent of metabolic energy and the Ca2+ ions are essential to maintain the activity of bacterial ATPases. Accumulation and efflux of ethidium bromide (EtBr) by E. coli AG100 was determined in the presence and absence of Ca2+, chlorpromazine (inhibitor of Ca2+-binding to proteins), and ethylenediaminetetraacetic acid (Ca2+ chelator). Accumulation of EtBr increased at pH 8; however Ca2+ reversed these effects providing information as to the importance of this ion in the regulation of bacterial EP systems. Overall this work puts in evidence that many biochemical and bioenergetic aspects related to the strains physiology need to be taken into consideration in bacterial drug resistance mediated by EPs.

Sarcoplasmic reticulum calcium ATPase is inhibited by organic vanadium coordination compounds: pyridine-2,6-dicarboxylatodioxovanadium(V), BMOV, and an amavadine analogue

Inorg Chem. 2008 Jul 7;47(13):5677-84. doi: 10.1021/ic702405d

O Ordenamento do Território e Urbanismo como Actividade Empresarial

Relatório de Estágio apresentado para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Gestão do Território, na área de especialização em Detecção Remota e Sistemas de Informação Geográfica

Pyruvate kinase and glucose-6-phosphate dehydrogenase deficies and their association with malaria - population genetics and proteomic studies

A malária é reconhecida como uma das principais forças selectivas a actuar na história recente no genoma humano. Inúmeros polimorfismos genéticos têm sido descritos como protectores contra a gravidade da malária, como o alelo HbS (designado de traço falciforme) e o alelo G6PD A- (associado à deficiência de G6PD). Mais recentemente, também a deficiência de PK foi associada com a protecção contra a malária. Evidências desta associação foram obtidas em estudos com modelos de roedor e estudos in vitro utilizando GV humanos deficientes em PK. Até à data, não foram obtidos dados em populações humanas que revelem esta associação: ainda não foi identificada uma variante de PK com uma prevalência elevada em regiões endémicas de malária e não foram identificadas marcas de selecção na região do gene que codifica para a PK (gene PKLR). Além disso, os mecanismos subjacentes à protecção contra a malária por deficiências enzimáticas dos GV não estão bem esclarecidos. Assim, os objectivos do presente estudo foram: investigar os polimorfismos genéticos humanos com associação com a malária em Cabo Verde; pesquisar marcas de selecção da malária na região do gene PKLR em populações Africanas; determinar a frequência da deficiência em PK e identificar uma eventual variante da enzima que possa estar sob selecção positiva em regiões endémicas de malária; avaliar o efeito das duas deficiências enzimáticas (PK e G6PD) na invasão e maturação do parasita em culturas in vitro de Plasmodium usando GV normais e deficientes; e analisar o perfil proteómico de GV infectados e não infectados, normais e com deficiência (em PK e G6PD), bem como de parasitas isolados de GV tanto deficientes como normais. Em Cabo Verde (área epidémica), não foram identificadas marcas de selecção pela malária, através da análise dos vários polimorfismos. No entanto, quando a análise foi realizada em dois países endémicos (Angola e Moçambique), foram detectadas várias marcas de selecção: a genotipagem de microssatélites (STRs) e polimorfismos de base única (SNPs) localizados na vizinhança do gene PKLR revelou uma diferenciação consideravelmente maior entre as populações Africana e Europeia (Portuguesa), do que a diferenciação determinada aquando da utilização de marcadores genéticos neutros. Além disso, uma região genómica de maior amplitude apresentou um Desequilíbrio de Ligação (LD) significativo no grupo de malária não grave (e não no grupo de malária grave), sugerindo que a malária poderá estar a exercer pressão selectiva sobre a região do genoma humano que envolve o gene PKLR. No estudo que incidiu na determinação da prevalência da deficiência de PK no continente Africano (realizado em Moçambique), esta revelou-se elevada - 4,1% - sendo o valor mais elevado descrito até ao momento a nível mundial para esta enzimopatia. Na pesquisa de mutações que pudessem estar na causa deste fenótipo (baixa actividade de PK), foi identificada uma mutação não sinónima 829G>A (277Glu>Lys), significativamente associada à baixa actividade enzimática. Esta mutação foi também identificada em Angola, São Tomé e Príncipe e Guiné Equatorial, onde a frequência de portadores heterozigóticos foi entre 2,6 e 6,7% (valores que se encontram entre os mais elevados descritos globalmente para mutações associadas à deficiência em PK). Não foi possível concluir acerca da associação entre a deficiência de PK e o grau de severidade da malária e da associação entre o alelo 829A e a mesma, devido ao baixo número de amostras. Os resultados dos ensaios de invasão/maturação do parasita sugeriram que, nos GV com deficiência de PK ou G6PD, a invasão (onde está envolvida a membrana do GV hospedeiro e o complexo apical do parasita) é mais relevante para a eventual protecção contra a malária do que a maturação. Os resultados da análise proteómica revelaram respostas diferentes por parte do parasita nas duas condições de crescimento (GV com deficiência de PK e GV com deficiência de G6PD). Esta resposta parece ser proporcional à gravidade da deficiência enzimática. Nos parasitas que cresceram em GV deficientes em G6PD (provenientes de um indivíduo assintomático), a principal alteração observada (relativamente às condições normais) foi o aumento do número de proteínas de choque térmico e chaperones, mostrando que os parasitas responderam às condições de stress oxidativo, aumentando a expressão de moléculas de protecção. Nos parasitas que cresceram em condições de deficit de PK (GV de indivíduo com crises hemolíticas regulares, dependente de transfusões sanguíneas), houve alteração da expressão de um maior número de proteínas (relativamente ao observado em condições normais), em que a maioria apresentou uma repressão da expressão. Os processos biológicos mais representados nesta resposta do parasita foram a digestão da hemoglobina e a troca de proteínas entre hospedeiro e parasita/remodelação da superfície do GV. Além disso, uma elevada percentagem destas proteínas com expressão alterada está relacionada com as fendas de Maurer, que desempenham um papel importante na patologia da infecção malárica. É colocada a hipótese de que a protecção contra a malária em GV deficientes em PK está relacionada com o processo de remodelação da membrana dos GV pelo parasita, o que pode condicionar a invasão por novos parasitas e a própria virulência da malária. Os resultados da análise do proteoma dos GV contribuirão para confirmar esta hipótese.

Validação da determinação de teobromina em amostras de cacau e seus derivados por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Tecnologia e Segurança Alimentar

Efeitos da laqueação proximal dos vasos curtos e da fundoplicatura total sobre a microcirculação do fundo gástrico : estudo microvascular em cobaias

RESUMO: A operação de Nissen, por laparoscopia, é considerada a cirurgia antirefluxo mais adequada por ser a que melhor replica a fisiologia normal da válvula gastresofágica na maioria dos doentes com sintomas típicos de doença do refluxo gastresofágico (DRGE). São critérios técnicos o encerramento seguro dos pilares do diafragma e a criação de fundoplicatura completa (360 graus), curta (inferior a dois centímetros), lassa e sem tensão – desiderando para o qual a laqueação proximal dos vasos curtos gástricos é crucial. Realizei a operação de Nissen, por laparoscopia, em sessenta mulheres e quarenta homens com DRGE, sem mortalidade operatória, no Serviço de Cirurgia 6 do Hospital dos Capuchos, CHLC, EPE. Os cem doentes apresentavam média etária de 46 anos e queixas, com tempo de evolução entre 1 e 43 anos, de pirose (90%), regurgitação (80%), azia (73%), epigastralgias (54%). A endoscopia alta revelou esofagite de grau Savary-Miller 0-I (62%), II (23%), III (8%), IV (7%); hérnia de deslizamento (71%), hérnia paraesofágica (8%), sem hérnia (21%); a pHmetria de 24h diagnosticou padrão misto (38%), levantado (20%), deitado (20%), inconclusiva (22%) e a manometria diagnosticou EEI hipotónico (35%), peristálise esofágica normal (88%), hipomotilidade ligeira (5%) e foi omissa (7%). Hérnia hiatal, esofagite grave, ineficácia do controlo sintomático com inibidor da bomba de protões e desejo de descontinuidade terapêutica constituíram as indicações para tratamento cirúrgico. Por celioscopia, efetuei laqueação dos vasos curtos gástricos (70%), cruroplastia e fundoplicatura total (seda 2/0), curta (dimensão média 1,5-2 cm), lassa, sem tensão e sem calibração intraoperatória do esófago. A fundoplicatura de Nissen laparoscópica mostrou-se segura e eficaz no tratamento da DRGE. A sua idoneidade foi ainda comprovada pela normalização da pHmetria de 24 horas e da manometria pós-operatórias, com significado estatístico, num grupo de catorze voluntários assintomáticos. Em catamnese com recuo médio 30,7 meses 94% dos indivíduos persistem assintomáticos. Interrogando-me acerca das repercussões desta operação sobre a microcirculação do fundo gástrico coloquei, como premissa, a possibilidade de na operação de Nissen a laqueação dos vasos curtos poder induzir modificação no diâmetro arteriolar da parede do fundo gástrico. Para pesquisar a influência da laqueação dos vasos curtos gástricos e da fundoplicatura total sobre o calibre arteriolar da parede do estômago no cárdia, no fundo e na região dos vasos curtos gástricos, idealizei um Projeto de investigação experimental em cobaias. O Projeto foi desenvolvido no Centro de Investigação do Departamento de Anatomia da FCM-UNL. Para a sua realização obtive autorização da Comissão Científica e Pedagógica da FCM-UNL, requeri a acreditação como investigador à Direção Geral de Veterinária e, por recorrer à utilização de animais, submeti-o à Comissão de Ética da FCM-UNL, que o aprovou por unanimidade. Para limitar o número de animais utilizados ao mínimo necessário, calculei, por método estatístico, a quantidade de cobaias necessárias. Subdividindo-as num grupo de ensaio (GE), onde realizei a operação de Nissen, e num grupo de controlo (GC), onde apenas procedi a tração gástrica, defini e apliquei protocolos de anestesia, de cirurgia e de eutanásia, segundo os princípios dos 3R – Replacement, Reduction, Refinement da técnica de experimentação humana de Russell e Burch (1959) – uma estrutura ética amplamente aceite para a realização de experimentação científica humanizada com animais. A utilização das técnicas de estudo angiomorfológico permitiu-me analisar e descrever a anatomia normal, a vascularização arterial macroscópica, a microangioarquitetura, por microscopia eletrónica de varrimento de moldes de corrosão vascular, e a histologia da parede do estômago da cobaia. Procedi, também, à definição dos critérios morfológicos que considerei suscetíveis de validação deste modelo animal para o estudo proposto. Por razões académicas, foi necessário abreviar o Projeto encurtando, em cerca de dois anos, o prazo disponível para conclusão do estudo. Apreciando-o com o Gabinete de Análise Epidemiológica e Estatística do Centro de Investigação do CHLC, EPE, optou-se, perante a escassez de elementos após já terem sido recrutados 46 animais, por uma amostra, suplementar, de dimensão de conveniência de oito cobaias (quatro em cada grupo), condicionada pelo limite temporal universitário e pelo respeito pela dignidade dos animais. Neste subgrupo procedi, por microscopia eletrónica de varrimento, à medição dos calibres arteriolares nos moldes vasculares do cárdia, do fundo e da zona dos vasos curtos gástricos tanto no GC como no GE efetuando 469 medições no primeiro e 461 no último. Os dados foram enviados ao Centro de Investigação do CHLC, EPE que procedeu à sua análise estatística (ANOVA). A referida análise revelou que as arteríolas do plexo mucoso e as do plexo submucoso do cárdia, do fundo e da região dos vasos curtos gástricos, mostraram aumento de calibre no GE. O aumento foi, estatisticamente, significativo por ser superior a 50% do calibre do GC. Nos vasos curtos, a diferença foi mais pequena, mas persistiu sendo, estatisticamente, significativa. Os vasos retos dilataram na base, na sua emergência do plexo seroso, apenas no fundo gástrico. Na cobaia a operação de Nissen – fundoplicatura total com laqueação dos vasos curtos gástricos –, provocou vasodilatação arteriolar do fundo gástrico. Considero que essa vasodilatação constituiu acomodação à modificação introduzida e infiro que o mesmo possa acontecer no ser humano. Admito, assim, que também ocorra vasodilatação no ser humano, na sequência da laqueação dos vasos curtos gástricos, pela analogia microvascular entre as duas espécies e que essa vasodilatação corresponda, igualmente, a um mecanismo de adaptação arteriolar visando, por exemplo, suprir a perda incorrida pela laqueação. A associação experimental entre laqueação dos vasos curtos gástricos e realização de fundoplicatura total, que exerce aumento inerente de pressão sobre a JEG, não só não provocou défice da microcirculação do esófago distal ou do estômago proximal como desencadeou um mecanismo de vasodilatação fúndica que reforça o conceito de segurança da operação de Nissen para tratamento da DRGE. -------------- ABSTRACT: The laparoscopic Nissen operation is considered to be the most appropriate antirefluxsurgery because it suitably replicates the standard physiology of the gastroesophageal valve in most patients with typical symptoms of gastroesophageal reflux disease (GERD). The technical criteria includes the safe shutdown of the diafragmatic crura(cruroplasty) and the creation of a complete fundoplication (360 degrees), short (lesser than two inches), floppy and without tension – a goal for which the proximal ligation of the gastric short vessels is crucial. The laparoscopic Nissen operation was performed in sixty women and forty men with GERD, without any operative mortality, at the Surgical Department of the Hospital dos Capuchos, CHLC, EPE. The one hundred patients, averaged 46 years old, complained of heartburn (90%), regurgitation (80%) and upper abdominal pain (54 %). The endoscopy process revealed Savary-Miller esophagitis of grade 0-I (62%), II (23%), III (8%), IV (7%), sliding hernia (71%), paraesophageal hernia (8%) or no herniation (21%). The pHmetry/24h diagnosed mixed pattern (38%), raised (20%), lying (20%) or inconclusive (22%). The manometry diagnosed hypotensive LES (35%), normal esophageal peristalsis (88%), mild hypomotility (5%) and was absent (7%). Hiatal hernia, severe esophagitis, ineffective symptomatic control with proton pump inhibitor and request for treatment discontinuation were the signs for surgical action. A laparoscopic ligation of short gastric vessels (70%), cruroplasty and fundoplication (silk 2/0), short (average size 1.5–2 cm) and floppy, without tension and without intraoperative calibration of the esophagus were thus performed. The laparoscopic Nissen fundoplication behaved safe and effective in treating GERD. In a group of 14 asymptomatic volunteers its reputation was confirmed with statistical significance by normalization of postoperative pHmetry/24h and manometry. 94% of the individuals remained asymptomatic up to 30.7 months (average) in the follow-up. Interrogating myself about the impact of this operation on the microcirculation of the gastric fundus I put premised on the possibility of the ligation of the short gastric vessels in the Nissen procedure can induce changes in the arteriolar diameter in the Wall of the gastric fundus. To explore the influence of ligation of the short gastric vessels and the fundoplication at the arteriolar caliber of the cardia, the fundus and the region of the short vessels of the gastric wall, I designed a project of experimental research in guinea pigs with two interdependent components: one veterinary and another technical where I applied angiomorphological studies. The project was developed at the Research Centre of the Department of Anatomy FCMUNL. For its accomplishment I got permission from the Scientific and Pedagogical Committee of the FCM-UNL, I requested for accreditation as a researcher at the General Directorate of Veterinary and, by resorting to the use of animals I submitted it to the Ethics Committee of the FCM-UNL, which approved it unanimously. The guinea pigs were divided into two experimental groups: an experimental group (EG), in which the Nissen procedure was performed and a control group (CG) in which only a gastric traction was done. Protocols of anesthesia, surgery and euthanasia were applied according to the 3Rs – Replacement, Reduction, Refinement of the technique of human experimentation of Burch and Russell (1959) – a widely accepted ethical framework for conducting scientific experiments using animals humanely. Using histological and angiomorphological techniques, I performed the analysis and the description of the normal, macro and microvascular, anatomy of the guinea pig stomach and I defined the morphological criteria that I considered susceptible for validation of this animal model for the proposed study. By means of scanning electron microscopy I measured the arteriolar calibers of the vascular casts of the cardia, of the fundus and of the short gastric vessels in both CG and EG, making 469 measurements in the former and 461 in the latter. The data were sent to the Research Center of the CHLC which conducted the statistical analysis (ANOVA). The data were sent to the Centre for Research of the CHLC, EPE which proceeded to statistical analysis (ANOVA). This analysis revealed that the arterioles plexus of the mucosal and submucosal plexus of the cardia, fundus and region of the short gastric vessels, showed increased caliber in EG. The increase was statistically significant for being greater than 50% CG gauge. In the short gastric vessels, the difference was smaller, but persisted and statistically significant. Straight vessels were dilated at the base, on its emergence of the plexus serous only in the fundus. In the guinea pig, the Nissen procedure - complete fundoplication with ligation of the short gastric vessels - caused arteriolar vasodilation on the gastric fundus. I believe that this vasodilation constituted some accommodation to the modification introduced and infer that the same might happen in humans. I admit therefore that vasodilation also occurs in humans following the ligation of the short gastric vessels by microvascular analogy between the two species and that this vasodilation corresponds also to na adaptation mechanism arteriolar, for example, to compensate the loss incurred by ligation. The association of experimental ligation of the short gastric vessels with conducting complete fundoplication, which exerts increased pressure on the EGJ, not only did not cause a microcirculation deficit of the distal esophagus or proximal stomach as triggered a mechanism of fundic vasodilation which reinforces the security concept of the Nissen procedure for treatment of GERD.

Building a thinner gap in a gas-gap heat switch

25th International Cryogenic Engineering Conference and the International Cryogenic Materials Conference in 2014, ICEC 25–ICMC 2014