Diversidade genética do vírus da Hepatite C circulante numa população de utilizadores de drogas injectáveis de Lisboa

Dissertação apresentada para a obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

Studies on the genetics of artemisinin resistance in malaria

A existência de estirpes de Plasmodium falciparum resistentes a multiplos fármacos é um dos problemas mais graves no controlo da malária. Novos fármacos, como a artemisinina (ART) e seus derivados são cada vez mais utilizados no tratamento da malaria e muito embora até ao momento não haja registos de fármaco-resistência estável à ART o seu surgimento seria desastroso devido á falta de alternativas. A investigação apresentada nesta tese descreve a selecção de resistência estável à ART e ao artesunato (ATN) utilizando um modelo roedor de malária, o parasita Plasmodium chabaudi chabaudi (Plasmodium chabaudi). Dois clones de Plasmodium chabaudi diferentes, AS-15CQ e AS-30CQ, foram inoculados em murganhos que por sua vez foram tratados na presença de concentrações sucessivamente crescentes de ATN e ART, sendo que no final do processo de seleção de resistência, os parasitas obtidos apresentavam uma resistência de 6 e 15 vezes superior ao ATN e à ART, respectivamente, em relação aos parasitas iniciais. Os clones obtidos foram nomeados respectivamente AS-ATN (obtido a partir de AS-15CQ por seleção com pressão de ATN) e AS-ART (obtido a partir de AS-30CQ por seleção com pressão de ART). A resistência obtida durante o processo de seleção é estável após clonagem, congelamento/descongelamento, passagem sanguínea na ausência de pressão de fármaco e transmissão natural através do mosquito vector. A sequência nucleotídica e o número de cópias dos genes previamente descritos na literatura como moduladores putativos de resistência à ART e seus derivados: mdr1, cg10, tctp e atp6; foi comparada entre parasitas resistentes e sensíveis, não tendo sido encontradas nenhumas alterações, quer na sequência quer no número de cópias destes genes. Posteriormente, numa tentativa de identificar os genes envolvidos na resistância à ART e ao ATN a técnica de Linkage Group Selection (LGS) foi utilizada. Para tal dois cruzamentos genéticos foram realizados. Estes cruzamentos foram realizados entre os clones fármaco-resistentes; AS-ART e AS-ATN e um clone geneticamente distinto dos anteriores e sensível aos fármacos em estudos, AJ. Após realização do LGS quatro loci genéticos; nos cromossomas de P. chabaudi 1, 2, 6 e 8 foram encontrados associados à resistência. Atendendo a que, a selecção no cromossoma 2 era a mais forte, este locus foi submetido a subsequentes análises genéticas, tendo sido encontradas duas mutações diferentes (V739F e V770F) num gene que codifica para um enzima de desubiquitinação (gene ubp-1).

Studies on the genetics of artemisinin resistance in malaria

A existência de estirpes de Plasmodium falciparum resistentes a multiplos fármacos é um dos problemas mais graves no controlo da malária. Novos fármacos, como a artemisinina (ART) e seus derivados são cada vez mais utilizados no tratamento da malaria e muito embora até ao momento não haja registos de fármaco-resistência estável à ART o seu surgimento seria desastroso devido á falta de alternativas. A investigação apresentada nesta tese descreve a selecção de resistência estável à ART e ao artesunato (ATN) utilizando um modelo roedor de malária, o parasita Plasmodium chabaudi chabaudi (Plasmodium chabaudi). Dois clones de Plasmodium chabaudi diferentes, AS-15CQ e AS-30CQ, foram inoculados em murganhos que por sua vez foram tratados na presença de concentrações sucessivamente crescentes de ATN e ART, sendo que no final do processo de seleção de resistência, os parasitas obtidos apresentavam uma resistência de 6 e 15 vezes superior ao ATN e à ART, respectivamente, em relação aos parasitas iniciais. Os clones obtidos foram nomeados respectivamente AS-ATN (obtido a partir de AS-15CQ por seleção com pressão de ATN) e AS-ART (obtido a partir de AS-30CQ por seleção com pressão de ART). A resistência obtida durante o processo de seleção é estável após clonagem, congelamento/descongelamento, passagem sanguínea na ausência de pressão de fármaco e transmissão natural através do mosquito vector. A sequência nucleotídica e o número de cópias dos genes previamente descritos na literatura como moduladores putativos de resistência à ART e seus derivados: mdr1, cg10, tctp e atp6; foi comparada entre parasitas resistentes e sensíveis, não tendo sido encontradas nenhumas alterações, quer na sequência quer no número de cópias destes genes. Posteriormente, numa tentativa de identificar os genes envolvidos na resistância à ART e ao ATN a técnica de Linkage Group Selection (LGS) foi utilizada. Para tal dois cruzamentos genéticos foram realizados. Estes cruzamentos foram realizados entre os clones fármaco-resistentes; AS-ART e AS-ATN e um clone geneticamente distinto dos anteriores e sensível aos fármacos em estudos, AJ. Após realização do LGS quatro loci genéticos; nos cromossomas de P. chabaudi 1, 2, 6 e 8 foram encontrados associados à resistência. Atendendo a que, a selecção no cromossoma 2 era a mais forte, este locus foi submetido a subsequentes análises genéticas, tendo sido encontradas duas mutações diferentes (V739F e V770F) num gene que codifica para um enzima de desubiquitinação (gene ubp-1).

Salud y Seguridad del Trabajo en Portugal : apuntes diversos

RESUMO - El autor aborda algunos aspectos relativos a la Salud y Seguridad del Trabajo (SST) en Portugal llamando la atención para, esencialmente, intentar sostener la tesis de que, desde mediados de la década de los 90, se observaron importantes avances en la mejoría de las condiciones del trabajo en la perspectiva de la SST, aunque se mantuvieron algunos problemas en la práctica concreta de las normativas legales. Incluso con estas mejoras, las tasas de frecuencia de accidentes de trabajo y de enfermedades profesionales en Portugal todavía se mantienen muy elevadas necesitando, por tanto, estrategias más “agresivas” para concienciar la sociedad portuguesa en torno a las políticas públicas de SST efectivamente promotoras de prevención de riesgos profesionales y de la promoción de la salud de quien trabaja. Es por tanto indispensable que la protección de la salud y de la seguridad de los trabajadores en los puestos de trabajo sea encarada como un conjunto de actividades de indiscutible utilidad para todos los representantes del mundo del trabajo e que la agenda política pase a valorizar, aún más, la promoción de espacios de trabajo saludables y seguros, con la consecuente valorización de las variables individuales en la estrategia nacional de salud y seguridad.--------------------------ABSTRACT – In the present work, the author analyzes several aspects of Occupational Health and Safety (OHS) in Portugal. He provides evidence sustaining the assumption of an important progress, since the mid-nineties, in the improvement of the working conditions from an OHS perspective. Nevertheless, several problems still remain in the practical application of legal regulations. In addition, despite of these improvements, the frequency rates of working accidents and occupational diseases remain very high. Hence, more “aggressive” strategies are required to increase the awareness of the Portuguese society relative to the OHS public policies, whose effectiveness has been demonstrated either in terms of occupational risks prevention and workers health promotion. The protection of workers’ health and safety at the workplace must then be assumed as an activity of indisputable utility by all stakeholders. The political agenda must thus promote even more the promotion of healthy and safe workplaces. As a consequence, there would be also a higher development of individual aspects, and not only environmental data, in the national strategy of occ

The role of complex chromosome translocations in leukemia

Resumo A tumorigénese é um processo de transformação celular que se desenrola tipicamente em várias etapas. Os diferentes níveis de evolução tumoral resultam da acumulação sucessiva de mutações genéticas numa célula normal que lhe conferem uma vantagem selectiva no respectivo meio tecidular. As mutações podem manifestar-se sob a forma de alterações nucleotídicas pontuais ao nível da sequência de DNA, levando a uma desregulação da função proteíca ou à formação de proteínas não-funcionais, ou através de alterações cromossómicas numéricas ou estruturais. Na leucemia, por exemplo, os genes híbridos que resultam de translocações cromossómicas desempenham um importante papel no processo tumorigénico. Estes genes são transcritos sob a forma de um RNA mensageiro de fusão, o qual é traduzido numa proteína híbrida com função oncogénica. Frequentemente, os subtipos de doença leucémica estão associados com translocações cromossómicas que envolvem 2 pontos de quebra recorrentes e específicos. É disto exemplo a leucemia mielóide crónica, em que uma translocação recíproca entre os cromossomas 9 e 22 conduz à formação de um gene de fusão BCR-ABL1. Em diferentes subtipos de doença, existe também uma pequena proporção de casos que apresenta translocações cromossómicas complexas, que envolvem um ou mais pontos de quebra adicionais em outras localizações genómicas além das que estão implicadas na formação dos genes de fusão. Por vezes, os pontos de quebra estão também associados a delecções extensas de material genético que se pensa terem uma função importante na tumorigénese. No entanto, o papel destas regiões genómicas no desenvolvimento tumoral não tem sido um motivo recorrente de estudo. Neste contexto, o objectivo desta dissertação foi o de determinar o potencial papel tumorigénico de alterações génicas adicionais ocorridas nos pontos de quebra de translocações cromossómicas complexas. Para a prossecução do objectivo proposto, foram estudados 5 rearranjos cromossómicos distintos associados com diferentes tipos de doença hematológica maligna, nomeadamente a leucemia linfoblástica aguda de células B (2 casos), leucemia mielóide aguda, neoplasma mieloproliferativo e síndrome mielodisplásico/neoplasma ieloproliferativo, não classificável. O mapeamento dos pontos de quebra foi efectuado utilizando a hibridação fluorescente in situ e diferentes metodologias de biologia molecular, tendo como base a informação inicial da análise citogenética. Em casos seleccionados, o papel dos novos genes candidatos foi avaliado in vitro utilizando modelos de linhas celulares, nomeadamente no que respeita às funções de controlo da proliferação celular e de regulação transcricional. De entre os 5 casos estudados, quatro deles evidenciaram translocações complexas envolvendo 3 cromossomas, nomeadamente t(12;21;5)(p13;q22;q13), t(12;6;15)(p13;p24~25;q22), t(9;11;19)(p22;q23;p13) e t(X;20;16)(p11;q13;q23). No caso remanescente, foi observada uma translocação dicêntrica dic(9;12)(p11;p11) acompanhada de delecções extensas em ambos os pontos de quebra. Nos casos com t(12;21;5) e t(9;11;19) as translocações estavam associadas com a presença de genes de fusão recorrentes, nomeadamente TV6(12p13)-RUNX1(21q22) e TLL(11q23)-MLLT3(9p22), indicando que se tratavam de rearranjos complexos das translocações t(12;21) e t(9;11) associadas com a leucemia linfoblástica aguda de células B e a leucemia mielóide aguda, respectivamente. O papel dos pontos de quebra adicionais foi estudado em detalhe no caso com t(9;11;19). Através da metodologia de long distance inverse-polymerase chain reaction, foram identificados os pontos de quebra na sequência de DNA dos 3 cromossomas envolvidos na translocação. Além dos pontos de quebra nos genes MLL e MLLT3, foi observado que o local de quebra no cromossoma 19 interrompeu a sequência de um novo gene, designado CCDC94,conduzindo à sua haplo-insuficiência nas células com t(9;11;19). Através de ensaios de reverse transcription-polymerase chain reaction verificámos que o gene CCDC94 é expresso ubiquitariamente em tecidos humanos normais. A análise informática da sequência prevista da proteína CCDC94 indicou uma elevada identidade de aminoácidos com a proteína cwf16, envolvida na regulação do ciclo celular da levedura Schizosaccharomyces pombe. Através da clonagem do DNA complementar de CCDC94 em vectores de expressão, e após a transfecção destes em culturas de linhas celulares in vitro, observámos que este gene codifica uma proteína de localização exclusivamente nuclear. A expressão ectópica da proteína CCDC94 diminuiu a progressão do ciclo celular e a proliferação das células em cultura. Inversamente, a supressão do transcrito do gene CCDC94 através de interferência de RNA conduziu a um aumento significativo da proliferação celular, confirmando que CCDC94 regula negativamente a proliferação e a progressão do ciclo celular. Estes resultados mostram que os pontos de quebra adicionais, presentes em translocações cromossómicas complexas em leucemia, podem resultar na haplo-insuficiência de genes controladores dos mecanismos proliferativos, cooperando desta forma com a acção das proteínas de fusão para proporcionar ao clone leucémico uma proliferação celular descontrolada. Nos restantes 3 casos estudados não foram identificados genes de fusão. Ao invés, todos aqueles apresentaram delecções de extensão variável associadas com os pontos de quebra cromossómicos. No caso com t(12;6;15), identificámos uma delecção de 1.2 megabases de DNA na banda 12p13 que resultou na eliminação de 9 genes incluindo ETV6 e CDKN1B. O gene ETV6 codifica um factor de transcrição que é essencial para a formação das diferentes linhagens hematopoiéticas na medula óssea, enquanto CDKN1B é traduzido numa proteína responsável por bloquear a entrada das células na fase G1 do ciclo celular e,consequentemente, por travar a proliferação celular. Neste contexto, os resultados obtidos indicam que a perda simultânea de ETV6 e de CDKN1B, através de uma translocação cromossómica complexa, constituiu uma acção cooperativa na leucemogénese. A mesma noção pode aplicar-se ao caso com dic(9;12), no qual pelo menos 2 genes que codificam para factores de transcrição importantes na linhagem hematopoiética, PAX5 no cromossoma 9 e ETV6 no cromossoma 12, estavam deleccionados como resultado do rearranjo cromossómico. Dado que o factor de transcrição PAX5 regula negativamente a expressão do gene FLT3, que desempenha uma função pró-proliferativa, é expectável que a haplo-insuficiência de PAX5 no caso com dic(9;12) terá tido como consequência uma elevação dos níveis de expressão de FLT3, contribuindo deste modo para uma proliferação celular aumentada. A t(X;20;16) foi identificada num doente com trombocitémia essencial (TE), uma doença que está intimamente relacionada com alterações de vias intracelulares reguladas por citocinas. Neste caso, através da utilização de um array genómico, identificámos a presença de pequenas delecções associadas com os pontos de quebra nos cromossomas 16 e 20. No cromossoma 16 apenas um gene, MAF, estava deleccionado, enquanto no cromossoma 20 a delecção tinha abrangido 3 genes. Dos genes deleccionados, dois deles, NFATC2 (20q13) e MAF (16q23), codificam proteínas que operam como reguladores transcricionais de citocinas hematopoiéticas. Dado que NFATC2 se localiza numa região que constitui um alvo frequente de delecções em neoplasmas ieloproliferativos, incluindo a trombocitémia essencial,efectuámos um estudo detalhado do papel deste gene na proliferação megacariocítica e na regulação da expressão de uma citocina hematopoiética (GM-CSF), implicada na maturação das diferentes linhagens mielóides. Utilizando um modelo de linha celular de trombocitémia essencial, verificámos que a supressão do transcrito do gene NFATC2 in vitro, por interferência de RNA, estava associada com um aumento da proliferação celular. Em concordância, o bloqueio da activação da proteína NFATC2 através de um inibidor específico da sua interacção com a calcineurina, conduziu a um aumento da proliferação celular in vitro. Utilizando a PCR quantitativa em tempo real, detectou-se um aumento da produção do RNA de GM-CSF em ambos os ensaios celulares, indicando que o factor de transcrição NFATC2 pode regular negativamente a expressão de GM-CSF em células de trombocitémia essencial. No geral, estes resultados mostram que a redução dos níveis fisiológicos do transcrito NFATC2, ou a redução da respectiva actividade proteica, estão relacionados com a proliferação de megacariocitos através do aumento da produção de GM-CSF. De acordo com estes resultados, verificámos que as células dos doentes com TE apresentam níveis mais baixos do transcrito NFATC2 do que a população normal. Dado que o factor de transcrição MAF desempenha igualmente um papel como regular transcricional de citocinas, é plausível que a haplo-insuficiência dos genes NFATC2 e MAF, resultante do rearranjo cromossómico complexo t(X;20;16), teve um efeito cooperativo importante na patogénese da trombocitémia essencial através da alteração do padrão normal de expressão das citocinas hematopoiéticas. Em síntese, efectuámos nesta dissertação um estudo citogenético de 4 translocações cromossómicas complexas incluindo t(12;21;5), t(12;6;15), t(9;11;19) e t(X;20;16), e de uma translocação dicêntrica dic(9;12), associadas com diferentes neoplasmas hematológicos. Em casos seleccionados efectuámos também um estudo molecular detalhado das regiões dos pontos de quebra. Esta análise permitiu-nos identificar 2 genes, CCDC94 no cromossoma 19 e NFATC2 no cromossoma 20, cuja haplo-insuficiência pode promover o aumento da proliferação celular das células leucémicas. A partir destes estudos podem ser retiradas 2 noções principais: (i) Os pontos de quebra adicionais, que ocorrem em translocações complexas associadas com a formação de genes de fusão, podem ter como consequência a desregulação de genes controladores da proliferação celular (e.g., CCDC94); (ii) As translocações complexas caracterizadas pela ausência de genes de fusão recorrentes poderão estar preferencialmente associadas com a presença de delecções, envolvendo um ou mais genes, nos pontos de quebra; nestas situações, serão necessários pelo menos 2 genes com funções celulares semelhantes (e.g., NFATC2 e MAF) ou complementares (e.g., ETV6 e CDKN1B) para, quando deleccionados, promoverem de forma cooperativa a leucemogénese. Nestes termos, o modelo de alterações genéticas sequenciais que caracteriza o desenvolvimento do cancro pode ser substituído por um modelo em que vários genes-alvo são simultaneamente desregulados pela formação de uma translocação cromossómica complexa, evitando deste modo a necessidade de ocorrência de alterações genéticas subsequentes.----------------------ABSTRACT: Tumourigenesis is a multistep process which results from the accumulation of successive genetic mutations in a normal cell. In leukemia for instance, recurrent translocations play a part in this process by generating fusion genes which lead to the production of hybrid proteins with an oncogenic role. However, a minor subset of chromosomal translocations referred to as complex or variant involves extra breakpoints at variable genome locations in addition to those implicated in the formation of fusion genes. We aimed to describe in this work the role, if any, of genes located at extra breakpoint locations or which are affected by breakpoint-adjacent deletions through the study of 5 leukemia patients.Two of the patients presented with TV6(12p13)-RUNX1(21q22) and MLL(11q23)- MLLT3(9p22) fusion genes as a result of a t(12;21;5) and a t(9;11;19), respectively. Detailed molecular characterization of the extra breakpoint at chromosome 19 in the latter case revealed that a novel ubiquitously expressed gene, CCDC94, with a potential role in cell cycle regulation, was disrupted by the breakpoint. We demonstrated using in vitro cellular assays that this gene codifies for a nuclear protein which negatively regulates cell cycle progression. These data shows that extra breakpoint locations of complex translocations may result in haplo-insufficiency of critical proliferation genes, thereby cooperating with the generation of hybrid proteins to provide unrestrained cell proliferation. In the other 3 patients there were reakpoint-associated deletions which precluded the formation of putative fusion genes. In a case with a t(12;6;15) we characterized a deletion at 12p13 which eliminated ETV6 and 8 other genes including CDKN1B. These findings indicate that concomitant loss of ETV6 and CDKN1B, which encodes a cyclin-dependent kinase inhibitor responsible for blocking entry of cells into the G1 phase of the cell cycle, acted cooperatively to promote leukemogenic proliferation. The same notion applied to a case with a dic(9;12) in which 2 genes encoding hematopoietic transcription factors - ETV6 and PAX5 (9p13)- were deleted as a result of breakpoint-adjacent deletions. Similarly, we found that 2 transcription factor genes involved in the regulation of cytokine expression, NFATC2 (20q13) and MAF (16q23), were involved in deletions contiguous to the breakpoints in a patient with a t(X;20;16). In vitro suppression of NFATC2 mRNA or inhibiton of NFATC2 protein activity enhanced cell proliferation as a result of an increase in the production of a myeloid-lineage stimulating hematopoietic cytokine, GM-CSF. These results suggest that haplo-insufficiency of NFATC2 and MAF genes had a cooperative effect in inducing cell proliferation as a result of a disregulation of cytokine production. Two main conclusions may be drawn from our studies: (i) In complex translocations associated with the production of fusion genes, additional breakpoints may cooperate in tumourigenesis by targeting genes that control cell proliferation; (ii) In complex translocations associated with small breakpoint-adjacent deletions, at least 2 genes with similar or complementary functions need to be deregulated to promote tumourigenesis.

A pretensa justificação humanitária da escravidão: o "escravo da força" e o "escravo da fome"

pp. 229-238

Estrutura Genética de Populações de Glossina palpalis gambiensis (Diptera: Glossinidae) na República da Guiné-Bissau

Glossina palpalis gambiensis é o principal vector de Tripanossomose Humana Africana (THA) na África Ocidental e a mosca tsé-tsé mais comum na Guiné-Bissau. Apesar da sua ampla distribuição, nenhum caso de THA tem sido reportado no país desde finais dos anos 70 do século XX. Populações naturais do Grupo palpalis demonstraram diferentes níveis de variação intraespecífica que podem influenciar a sua capacidade vectorial. Portanto, o conhecimento exacto acerca da identidade das espécies e estrutura populacional é essencial para prever o possível restabelecimento e propagação da transmissão de THA na Guiné-Bissau. A variação genética foi analisada em amostras de Glossina palpalis gambiensis de cinco regiões da Guiné-Bissau, com recurso a microssatélites. Três das regiões pertencem à parte continental e duas representam a parte insular do país. No total, 261 moscas tsé-tsé do sexo feminino foram genotipadas para 11 loci microssatélites. Baixos níveis de diferenciação genética foram observados entre as populações de G. p. gambiensis da Guiné-Bissau (FST = 0,006, P = 0,002). Este resultado está de acordo com a análise de agrupamentos, que revelou a presença de um único cluster agrupando todas as amostras, independentemente da origem geográfica. De um modo geral, estes resultados sugerem uma baixa subestruturação populacional em G. p. gambiensis nesta região. Análises de equilíbrio mutação-deriva sugerem ainda a ocorrência de expansão populacional recente. As evidências genéticas sugerem consideráveis níveis de fluxo genético entre as populações continentais e entre as populações insulares e continentais da Guiné-Bissau. No caso do restabelecimento de focos de transmissão de THA, a possibilidade de disseminação do protozoário Trypanosoma, através da dispersão activa das moscas tsé-tsé, deve ser tida em conta no planeamento de estratégias de controlo vectorial na Guiné-Bissau. PALAVRAS-CHAVE: Glossina, Tripanossomose Humana Africana, microssatélites, diferenciação genética.

Biological predictors of survival in limphoma and mechanisms underlying follicular lymphoma transformaion into diffuse large B cell lymphoma (vol I e II)

RESUMO: Os biomarcadores tumorais permitem identificar os doentes com maior risco de recorrência da doença, predizer a resposta tumoral à terapêutica e, finalmente, definir candidatos a novos alvos terapêuticos. Novos biomarcadores são especialmente necessários na abordagem clínica dos linfomas. Actualmente, esses tumores são diagnosticados através de uma combinação de características morfológicas, fenotípicas e moleculares, mas o prognóstico e o planeamento terapêutico estão quase exclusivamente dependentes de características clínicas. Estes factores clínicos são, na maioria dos linfomas, insuficientes numa proporção significativa dos doentes, em particular, aqueles com pior prognóstico. O linfoma folicular (LF) é, globalmente, o segundo subtipo mais comum de linfoma. É tipicamente uma doença indolente com uma sobrevida média entre os 8 e 12 anos, mas é geralmente fatal quando se transforma num linfoma agressivo de alto grau, habitualmente o linfoma difuso de grandes células B (LDGCB). Morfologicamente e funcionalmente, as células do LF recapitulam as células normais do centro germinativo na sua dependência de sobrevivência do microambiente não-tumoral, especialmente das células do sistema imunológico. Biomarcadores preditivos de transformação não existem pelo que um melhor conhecimento da biologia intrínseca de progressão do LF poderá revelar novos candidatos. Nesta tese descrevo duas abordagens distintas para a descoberta de novos biomarcadores. A primeira, o estudo da expressão global de genes ('genomics') obtidos por técnicas de alto rendimento que analisam todo o genoma humano sequenciado, permitindo identificar novas anomalias genéticas que possam representar mecanismos biológicos importantes de transformação. São descritos novos genes e alterações genómicas associados à transformação do LF, sendo especialmente relevantes as relacionadas com os eventos iniciais de transformação em LDGCB. A segunda, baseou-se em várias hipóteses centradas no microambiente do LF, rico em vários tipos de células nãomalignas. Os estudos imunoarquitectural de macrófagos, células T regulatórias e densidade de microvasos efectuado em biopsias de diagnóstico de doentes com LF tratados uniformemente correlacionaram-se significativamente, e independentemente dos critérios clínicos, com a evolução clínica e, mais importante, com o risco de transformação em LDGCB. Nesta tese, foram preferencialmente utilizadas (e optimizadas) técnicas que permitam o uso de amostras fixadas em parafina e formalina (FFPET). Estas são facilmente acessíveis a partir das biopsias de diagnóstico de rotina presentes nos arquivos de todos os departamentos de patologia, facilitando uma transição rápida dos novos marcadores para a prática clínica. Embora o FL fosse o tema principal da tese, os novos achados permitiram estender facilmente hipóteses semelhantes a outros subtipos de linfoma. Assim, são propostos e validados vários biomarcadores promissores e relacionados com o microambiente não tumoral, sobretudo dependentes das células do sistema imunológico, como contribuintes importantes para a biologia dos linfomas. Estes sugerem novas opções para a abordagem clínica destas doenças e, eventualmente, novos alvos terapêuticos.------------- ABSTRACT: Cancer biomarkers provide an opportunity to identify those patients most at risk for disease recurrence, predict which tumours will respond to different therapeutic approaches and ultimately define candidate biomarkers that may serve as targets for personalized therapy. New biomarkers are especially needed in the management of lymphoid cancers. At present, these tumours are diagnosed using a combination of morphologic, phenotypic and molecular features but prognosis and overall survival are mostly dependent on clinical characteristics. In most lymphoma types, these imprecisely assess a significant proportion of patients, in particular, those with very poor outcomes. Follicular lymphoma (FL) is the second most common lymphoma subtype worldwide. It is typically an indolent disease with current median survivals in the range of 8-12 years, but is usually fatal when it transforms into an aggressive high-grade lymphoma, characteristically Diffuse Large B Cell Lymphoma (DLBCL). Morphologically and functionally it recapitulates the normal cells of the germinal center with its survival dependency on non-malignant immune and immunerelated cells. Informative markers of transformation related to the intrinsic biology of FL progression are needed. Within this thesis two separate approaches to biomarker discovery were employed. The first was to study the global expression of genes (‘genomics’) obtained using high-throughput, wholegenome-wide approaches that offered the possibility for discovery of new genetic abnormalities that might represent the important biological mechanisms of transformation. Gene signatures associated with early events of transformation were found. Another approach relied on hypothesis-driven concepts focusing upon the microenvironment, rich in several non-malignant cell types. The immunoarchitectural studies of macrophages, regulatory T cells and microvessel density on diagnostic biopsies of uniformly treated FL patients significantly predicted clinical outcome and, importantly, also informed on the risk of transformation. Techniques that enabled the use of routine formalin fixed paraffin embedded diagnostic specimens from the pathology department archives were preferentially used in this thesis with the goal of fulfilling a rapid bench-to-beside” translation for these new findings. Although FL was the main subject of the thesis the new findings and hypotheses allowed easy transition into other lymphoma types. Several promising biomarkers were proposed and validated including the implication of several non-neoplastic immune cells as important contributors to lymphoma biology, opening new options for better treatment planning and eventually new therapeutic targets and candidate therapeutics.

Estudo do gene FOXE1 e identificação de novos genes de susceptibilidade para o cancro da tiróide familiar

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

DNA damage induced by acrylamide: roe of genetic polymorphisms in DNA damage levels

RESUMO:Em 1994 a acrilamida (AA) foi classificada pela IARC como um provável cancerígeno para o homem. Para além da utilização de AA em numerosas aplicações industriais, a AA está também presente numa grande variedade de alimentos ricos em amido e processados a temperaturas elevadas. Esta exposição através da ingestão de produtos alimentares despoletou elevadas preocupações ao nível do risco para a saúde pública e poderá implicar um risco adicional para o aparecimento de cancro. A glicidamida (GA), o metabolito epóxido formado a partir da oxidação da AA provavelmente através do citocromo P450 2E1, é considerada por vários estudos, o principal responsável pela carcinogenicidade da AA. Actualmente existe uma escassez de resultados relativamente aos mecanismos de genotoxicidade da AA e GA em células de mamífero. Por este motivo, o objectivo deste estudo centra-se na avaliação das consequências genéticas da exposição à AA e GA, recorrendo-se para tal ao uso de células de mamífero como modelo. Tendo como base este objectivo avaliou-se a citotoxicidade da AA e GA, através do ensaio do MTT, e realizaram-se dois testes citogenéticos, o teste das aberrações cromossómicas (CAs) e o teste da troca de cromátides irmãs (SCEs), de modo a avaliar as lesões de DNA induzidas por estes compostos em células de hamster Chinês V79. Os resultados globalmente mostraram que a GA é mais citotóxica e clastogénica do que a AA. No âmbito deste trabalho, foi também efectuada a quantificação de aductos específicos de DNA, nomeadamente N7-(2-carbamoil-2-hidroxietil)guanina (N7-GA-Gua) e N3-(2-carbamoil-2-hidroxietil)adenina (N3-GA-Ade). Os resultados obtidos permitem afirmar que os níveis de N7-GA-Gua e a concentração de GA apresentam uma relação linear dose-resposta. Foi também identificada uma óptima correlação entre os níveis de N7-GA-Gua e a frequência de troca de cromátides irmãs. Adicionalmente, e de forma a compreender os mecanismos de toxicidade da AA, estudaram-se os mecanismos dependentes da modulação do glutationo reduzido (GSH), nomeadamente da butionina sulfoximina (BSO), um inibidor da síntese de GSH, do GSH-monoetil estér (GSH-EE), um composto permeável nas células e que é intra-celularmente hidrolisado a GSH e ainda do GSH adicionado exogenamente ao meio de cultura, em células V79. Os resultados obtidos reforçaram o papel da modulação do GSH nos efeitos de citotoxicidade e clastogenicidade da AA. Para além dos estudos efetuados com células V79, procedeu-se também à determinação da frequência de SCEs, à quantificação de aductos específicos de DNA, bem como ao ensaio do cometa alcalino em amostras de dadores saudáveis expostos à AA e GA. Tanto os resultados obtidos através do ensaio das SCE, como pela quantificação de aductos específicos de DNA, ambos efectuados em linfócitos estimulados, originaram resultados comparáveis aos obtidos anteriormente para as células V79, reforçando a ideia de que a GA é bastante mais genotóxica do que a AA. Por outro lado, os resultados obtidos pelo ensaio do cometa para exposição à AA e GA mostraram que apenas esta última aumenta o nível das lesões de DNA. Outro objectivo deste trabalho, foi a identificação de possíveis associações existentes entre as lesões de DNA, quantificadas através do ensaio das SCEs e do cometa, e biomarcadores de susceptibilidade, tendo em conta os polimorfismos genéticos individuais envolvidos na destoxificação e nas vias de reparação do DNA (BER, NER, HRR e NHEJ) em linfócitos expostos à GA. Tal permitiu identificar associações entre os níveis de lesão de DNA determinados através do ensaio das SCEs, e os polimorfismos genéticos estudados, apontando para uma possível associação entre o GSTP1 (Ile105Val) e GSTA2 (Glu210Ala) e a frequência de SCEs. Por outro lado, os resultados obtidos através do ensaio do cometa sugerem uma associação entre as lesões de DNA e polimorfismos da via BER (MUTYH Gln335His e XRCC1 Gln39Arg) e da via NER (XPC Ala499val e Lys939Gln), considerando os genes isoladamente ou combinados. Estes estudos contribuem para um melhor entendimento da genotoxicidade e carcinogenicidade da AA e GA em células de mamífero, bem como da variabilidade da susceptibilidade individual na destoxificação e reparação de lesões de DNA provocadas pela exposição a estes xenobióticos alimentares. ----------- ABSTRACT:Acrylamide (AA) has been classified as a probable human carcinogen by IARC. Besides being used in numerous industrial applications, AA is also present in a variety of starchy cooked foods. This AA exposure scenario raised concerns about risk in human health and suggests that the oral consumption of AA is an additional risk factor for cancer. A considerable number of findings strongly suggest that the reactive metabolite glycidamide (GA), an epoxide generated presumably by cytochrome P450 2E1, plays a central role in AA carcinogenesis. Until now there are a scarcity of results concerning the mechanisms of genotoxicity of AA and GA in mammalian cells. In view of that, the study described in this thesis aims to unveil the genetic consequences of AA and GA exposure using mammalian cells as a model system. With this aim we evaluated the cytotoxicity of AA and GA using the MTT assay and subsequently performed two cytogenetic end-points: chromosomal aberrations (CAs) and sister chromatid exchanges (SCEs), in order to evaluate DNA damage induced by these compounds in V79 Chinese hamster cell line. The results showed that GA was more cytotoxic and clastogenic than AA. Within the scope of this thesis the quantification of specific DNA adducts were also performed, namely N7-(2-carbamoyl-2-hydroxyethyl)guanine (N7-GA-Gua) and N3-(2-carbamoyl-2-hydroxyethyl)adenine (N3-GA-Ade). Interestingly, the GA concentration and the levels of N7-GA-Gua presented a linear dose-response relationship. Further, a very good correlation between the levels of N7-GA-Gua and the extent of SCEs were observed. In order to understand the mechanisms of AA-induced toxicity, the modulation of reduced glutathione (GSH)-dependent mechanisms were studied, namely the evaluation of the effect of buthionine sulfoximine (BSO), an effective inhibitor of GSH synthesis, of GSH-monoethyl ester (GSH-EE), a cell permeable compound that is intracellularly hydrolysed to GSH and also of GSH endogenously added to culture medium,z in V79 cell line. The overall results reinforced the role of GSH in the modulation of the cytotoxic and clastogenic effects induced by AA.Complementary to the studies performed in V79 cells, SCEs, specific DNA-adducts and alkaline comet assay in lymphocytes from healthy donors exposed to AA and GA were also evaluated. Both, the frequency of SCE and the quantification of specific GA DNA adducts, produced comparable results with those obtained in V79 cell line, reinforcing the idea that GA is far more genotoxic than AA. Further, the DNA damaging potential of AA and GA in whole blood leukocytes evaluated by the alkaline comet assay, showed that GA, but not AA, increases DNA damage. Additionally, this study aimed to identify associations between DNA damage and biomarkers of susceptibility, concerning individual genetic polymorphisms involved in detoxification and DNA repair pathways (BER, NER, HRR and NHEJ) on the GA-induced genotoxicity assessed by the SCE assay and by the alkaline comet assay. The extent of DNA damage determined by the levels of SCEs induced by GA seems to be modulated by GSTP1 (Ile105Val) and GSTA2 (Glu210Ala) genotypes. Moreover, the results obtained from the comet assay suggested associations between DNA damage and polymorphisms of BER (MUTYH Gln335His and XRCC1 Gln399Arg) and NER (XPC Ala499Val and Lys939Gln) genes, either alone or in combination. The overall results from this study contribute to a better understanding of the genotoxicity and carcinogenicity of AA and GA in mammalian cells, as well as the knowledge about the variability in individual susceptibility involved in detoxification and repair of DNA damage due to these dietary xenobiotics.

Diversidade genética e resistência aos anti-retrovirais inibidores enzimáticos de vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) de uma população de toxicodependentes por via endovenosa da Grande Lisboa

Neste estudo procedeu-se à caracterização da diversidade genética das regiões codificantes da protease (PR), transcritase reversa (RT) e integrase (IN) do gene pol do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1), bem como à pesquisa de polimorfismos genéticos associados à diminuição da susceptibilidade aos anti-retrovirais inibidores enzimáticos, circulante numa população de 51 indivíduos utilizadores de drogas por via endovenosa (IDUs) da Grande Lisboa. Em termos globais, a análise filogenética realizada com base em 38 sequências nucleotídicas concatenadas revelou que 12 (31,6%), 13 (34,2%) e 13 (34,2%) das sequências analisadas eram dos subtipos B, G/CRF14_BG e de formas genéticas não-B/não-G (1 F1, 4 CRF02_AG e 8 formas recombinantes únicas), respectivamente. Relativamente à pesquisa de mutações associadas a resistência (perfil genotípico), foram encontradas 15, presentes em 50,0% (22/44) dos indivíduos, com uma distribuição de 1-3/indivíduo (4, todas acessórias, na PR; 6 na RT; 5 na IN, uma principal e 4 acessórias). Todavia, apenas 26,7% (4/15) dessas mutações conferiam uma expressão fenotípica de resistência a uma das classes de inibidores (da RT ou IN), em 9,1% (4/44) dos indivíduos. Foi ainda observada uma elevada frequência de outros polimorfismos genéticos, mais frequentes em subtipos não-B, alguns dos quais considerados assinaturas de subtipo. A homologia genética total ou parcial com os subtipos B e G, reconhecida neste estudo, reflectirá a sua predominância na população de IDUs. Este resultado sugere também que a epidemia de HIV-1 em Portugal poderá estar a evoluir para um padrão epidemiológico singular, no qual os subtipos B, G e suas formas recombinantes predominam. A proporção observada de indivíduos portadores de vírus com mutações associadas a resistência, mesmo em indivíduos naive relativamente à terapêutica, indica que a sua transmissão se encontra em curso entre a população de IDUs, tendo, certamente, um impacto relevante ao nível da abordagem terapêutica e monitorização da infecção.

Desenvolvimento de um ensaio de hibridação múltipla (MHA-MULTIPLE REGION HYBRIDIZATION ASSAY) para identificação presumível de vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 (HIV-1) dos subtipos B, G e de formas recombinantes CRF14_BG e CRF02_AG circulantes em Portugal

A maioria dos métodos utilizados na caracterização genética do HIV-1 baseia-se na análise de regiões específicas do genoma viral, fornecendo informação parcial sobre o mesmo e, por consequência, revelando-se inadequados para a identificação de vírus recombinantes. O único método que permite uma caracterização integral do genoma viral passa pela sua sequenciação completa. No entanto, este é um método dispendioso, laborioso e de difícil implementação quando se pretende a análise de elevados números de amostras. Como alternativa a este último, o conjunto de métodos genericamente designados de MHA (Multiple Region Hybridization Assay) baseiam-se na amplificação, por PCR em tempo-real, de várias regiões ao longo do genoma viral e na sua caracterização com sondas específicas (TaqMan). Tendo este modelo por base, o objectivo deste estudo foi o desenvolvimento de um ensaio de hibridação múltipla (MHABG0214) passível de ser aplicado ao estudo de um elevado número de amostras. Este método foi desenvolvido tendo como objectivo a genotipagem as estirpes circulantes dominantes na epidemia Portuguesa, nomeadamente os subtipos B, G e formas genéticas recombinantes CRF02_AG e CRF14_BG. Com base em alinhamentos de sequências de referência de genoma completo, delinearam-se primers universais e subtipo-específicos para a amplificação de diversas regiões codificantes distribuídas ao longo do genoma do HIV-1 (Gag, Protease, Transcriptase Reversa, Integrase, Rev, Gp120 e Gp41). A optimização foi efectuada, inicialmente, para um conjunto de amostras de referência e seguidamente avaliada num conjunto de 50 amostras clínicas. O MHABG0214 foi implementado numa estratégia de PCR em tempo-real, numa detecção dependente de SYBR® Green I para todas as regiões ou, como alternativa, usando sondas TaqMan (Gp41). Apresentamos ainda uma estratégia em que a análise de resultados se baseia, simplesmente, numa abordagem usando PCR/gel de agarose convencional. Estas abordagens constituem ferramentas úteis na identificação das estirpes de HIV-1 em Portugal.

Evolução de genótipos de Streptococcus agalactiae associados a colonização na grávida

Dissertação para obtenção do grau de Mestre em Microbiologia Médica

Suicide study : a psychological autopsy

RESUMO: O'suicídio'é'atualmente'um'problema'de'saúde'pública.'Estimarse'que'um'milhão'de'pessoas' morra'anualmente'devido'ao'suicídio.'De'acordo'com'diversas'agências'e'organizações'estimar 'que'ocorram'entre'20'a'40'tentativas'de'suicídio'por'cada'suicídio'consumado.'Os'custos'associados'ao'suicídio,'quer'humanos'quer'económicos'são'enormes'e'estendemrse'à'família,'emprego,'economia'e'finanças.'Os'números'oficiais'do'suicídio'em'Portugal'indicam'uma'taxa ligeiramente'acima'dos'10'por' cada'100'000'habitantes'mas' comportando' regiões'onde' são'observadas' taxas' muito' elevadas,' como' no' Sudoeste' de' Portugal' onde' se' observam particularmente taxas 3'vezes'acima'da'média'nacional.' Investigámos' o' fenómeno' com' os' objetivos' de' validar' a' técnica' de' autópsia' psicológica' em' contexto' comunitário' nunca' realizado' em' Portugal,' e' dar' um' contributo' para' uma' compreensão'mais'alargada'deste'problema'de'saúde'pública,'especialmente'nesta'região'de' Odemira.' A' autópsia' psicológica' consiste' em' reunir' detalhadamente' informação' sobre' a'personalidade' e' vida' de' alguém' que' morreu' em' circunstâncias' equívocas' (por' suicídio,' homicídio' ou' acidente)'recorrendo'ainda'a'registos'e'documentação,'bem'como'procedendo'a entrevistas' com' familiares,' colegas' ou' amigos.' Foi' feita' uma' adaptação' de' uma' entrevista' semirestruturada' para' o' efeito.' Foram' recrutados' 2' grupos' de' participantes:' um' grupo' de familiares de pessoas que cometeram'suicídio'(n=30)'e'um'grupo'de'familiares'de'pessoas'que morreram de causas' naturais' (n=24).' O' estudo' decorreu' em' 3' momentos' com' sessões' de' apresentação' (i),' sessões' de' preparação' (ii)' e' entrevistas' para' recolha' de' informação' e'monitorização.'' Os' principais' resultados'mostram' que' existiram' dificuldades' na' obtenção' da' informação' a'partir' dos' entrevistados,' a'maioria' dos' suicidas' eram'homens' acima' dos' 40' anos' de' idade,' afetados' por' lesões' graves' ou' doenças' graves' ' no' período' adulto' embora' apresentassem'condições' válidas' para' trabalhar,' reformados,' vivendo' em' família,' com' traços' de'personalidade' amargurados,' tristes' ou' pessimistas,' com' escassas' atividades' nos' tempos' de' lazer,' sem' problemas' somáticos' significativos' ou' perturbações'mentais' que' comunicaram' a intenção de morrer previamente'e'provenientes'de'famílias'sem'dificuldades'económicas'ou'relações'familiares'desadequadas.' Tendo'em'conta'a'literatura,'algumas'das'características'parecem'ser'muito'particulares'desta'população.'Aparentemente'o'suicídio'poderá'ter'implicações'genéticas'que'deveriam'ser'tidas'em'conta'em'futuras'investigações.' A'integração'da'saúde'mental'nos'cuidados'de'saúde'primários'afigurarse'urgente'tendo'em' conta' que' a' escassez' de' profissionais' de' saúde'mental' é' enorme' numa' parte' do' país' onde'ocorre' o'maior'número'de' suicídios.'Mudar'de'modelo'e'reorganizar'os' serviços'de' forma'a' poder' dar' uma' resposta' ao' défice' de' tratamento' de' saúde' mental' e' ter' em' conta' os' determinantes'sociais'da'saúde'para'fazer'face'ao'isolamento'é'fundamental.' ---------------ABSTRACT: Suicide' is,'nowadays,' a'public'health'problem.'A'million'dies' annually'by' suicide'worldwide.' According'to'several'agencies'and'organizations'an'estimation'of'20'to'40'suicide'attempts'is advanced for each complete' suicide. Associated'costs'to'suicide,'both'human'and'economic,'are' huge' and' spread' on' family,' jobs,' economy,' and' finances.' Official' available' figures' for' suicide' in' Portugal' indicate' a' rate' slightly' over' 10' for' each' 100' 000' inhabitants,' but' with'regions'where'one' can' actually' find'extremely'high' rates,' like' for' instance' in' the'Southwest' part' of' the' country,' where' are' regularly' found' rates' 3' times' higher,' when' compared' to'national'average.'' We' have' investigated' the' phenomenon' aiming' to' validate' the' technique' of' psychological'autopsy' in' a' community' context' never' explored' before' in' Portugal' and' to' contribute' for' a' wider' understanding' of' this' public' health' problem,' especially' in' this' region' of' Odemira.' Psychological'autopsy'consists'into'a'detailed'gathering'of'information'about'the'personality'and' life' of' someone' died' in' equivocal' circumstances' (suicide,' homicide,' accident),' registries and other'documentation'as'well'as'interviews'with'family'members,'corworkers'and'friends.' An' adaptation' of' a' semirstructured' interview' was' made.' Two' groups' of' participants' were'recruited: a'group of'relatives'of'people'committing'suicide'(n=30),'and'a'group'of'relatives'of'people' whose' death' was' after' natural' causes' (n=24).' Study' was'made' in' 3'moments' with'presentation'sessions;'(i)'preparation'sessions;'(ii)'interviewing'data'collection'and'monitoring' iii).'' Main'results'showed'difficulties'to'obtain'information'from'interviewees,'most'suicides'were' from males over 40 years old, affected'by'serious'illness'or'severe'injury'in'adulthood'but'valid'to'work,'retired,'living'in'family,'with'bitterness,'sad'or'pessimistic'as'personality'traits,'with'few' leisure' activities,' without' significant' health' somatic' problems' or' mental' disorders,'communicating'intention'to'die'previously,'coming'from'families'with'no'indication'of'financial'distress'or'inadequate'family'relationship.' Taking'into'account'the'literature'it'looks'like'some'features'seem'to'be'quiet'particular'from'this'population.'Apparently'one'might'say'that'suicide'could'have'genetic'implications'which'further'research'should'account'in'the'future.' Integration' of'mental' health' into' primary' care' is' urgent' once' the' scarcity' of'mental' health' professionals' is' enormous' in' a' part' of' the' country' where' most' suicides' occur.' Scaling' up services must go in order'to'address'to'treatment'gap'and'social'determinants'of'health'should'be'taken'into'account'to'face'isolation.' Results' show' that' the' profile' of' the' suicidal' in' the' region' of' Odemira' is' particular' and'implications' of' genetics' should' be' taken' into' account.' Moreover' much' can' be' done' in'organization' of' services' in' the' region' where' we' performed' the' present' study' in' order' to'address'to'treatment'gap'for'mental'disorders'and'to'the'social'determinants'of'health.

"Estrutura Genética de Populações de Glossina Palpalis gambiensis (Diptera: Glossinidae) na República da Guiné-Bissau"

Glossina palpalis gambiensis é o principal vector de Tripanossomose Humana Africana (THA) na África Ocidental e a mosca tsé-tsé mais comum na Guiné-Bissau. Apesar da sua ampla distribuição, nenhum caso de THA tem sido reportado no país desde finais dos anos 70 do século XX. Populações naturais do Grupo palpalis demonstraram diferentes níveis de variação intraespecífica que podem influenciar a sua capacidade vectorial. Portanto, o conhecimento exacto acerca da identidade das espécies e estrutura populacional é essencial para prever o possível restabelecimento e propagação da transmissão de THA na Guiné-Bissau. A variação genética foi analisada em amostras de Glossina palpalis gambiensis de cinco regiões da Guiné-Bissau, com recurso a microssatélites. Três das regiões pertencem à parte continental e duas representam a parte insular do país. No total, 261 moscas tsé-tsé do sexo feminino foram genotipadas para 11 loci microssatélites. Baixos níveis de diferenciação genética foram observados entre as populações de G. p. gambiensis da Guiné-Bissau (FST = 0,006, P = 0,002). Este resultado está de acordo com a análise de agrupamentos, que revelou a presença de um único cluster agrupando todas as amostras, independentemente da origem geográfica. De um modo geral, estes resultados sugerem uma baixa subestruturação populacional em G. p. gambiensis nesta região. Análises de equilíbrio mutação-deriva sugerem ainda a ocorrência de expansão populacional recente. As evidências genéticas sugerem consideráveis níveis de fluxo genético entre as populações continentais e entre as populações insulares e continentais da Guiné-Bissau. No caso do restabelecimento de focos de transmissão de THA, a possibilidade de disseminação do protozoário Trypanosoma, através da dispersão activa das moscas tsé-tsé, deve ser tida em conta no planeamento de estratégias de controlo vectorial na Guiné-Bissau.